CC BY
51
11. Farooq S., Azam F. Co-existence of salt and drought tolerance in Triticeae // Hereditas. - 2001. -V. 135, N 2-3. - P. 205-210.
12. Flowers T.J. Improving crop salt tolerance // J. Exp. Bot. - 2004. - V. 55. - P. 307-319.
13. Hsissou D. In vitro selection and characterization of drought-tolerant plants of durum wheat (Triticum durum Desf.) // Agronomie. - 1994. - V. 2. - P. 65-70.
14. Salt tolerance improvement in some wheat cultivars after application of in vitro selection pressure / Zairl I., Chlyah A., Sabounji K., Tittahsen M., Chlyah H. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2003. - V. 73, N 3. - P. 237-244.
Рекомендовано к печати к.б.н. Губановой Т.Б.
СОВРЕМЕННАЯ GERM-LINE БИОТЕХНОЛОГИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФОТОСИНТЕЗА И УРОЖАЙНОСТИ У ПШЕНИЦЫ
О.И. КЕРШАНСКАЯ, доктор биологических наук;
А С. НУРМАГАМБЕТОВА; А.М. ЕСПЕМБЕТОВА;
Л.А. СКВОРЦОВА; Т.М. МУХАНОВ Институт биологии и биотехнологии растений, Национальный центр биотехнологии Республики
Казахстан, Алматы, Казахстан
Введение
Для того, чтобы накормить 9 миллиардов людей в ближайшем будущем, необходимо сочетание традиционных технологий селекции и генетического улучшения культурных растений путем внедрения рекомбинантных ДНК-технологий [4-9]. Растения, использующие традиционный путь фиксации углерода C3, а среди них многие важные сельскохозяйственные виды, такие как пшеница и рис, страдают от кислородного ингибирования фотосинтеза и ассоциированного с ним фотодыхания, демонстрируют низкую эффективность фотосинтеза, особенно в современных условиях высокой инсоляции, роста температуры и засухи. С целью активизации фотосинтеза было сделано несколько попыток генетической модификации фотосинтеза путем переноса генов, кодирующих ферменты С4 метаболизма в С3 растения [4, 6-9]. Этот многообещающий подход был успешно продемонстрирован на рисе [6, 8-9], в настоящее время необходима разработка стратегии С3-С4 генетической инженерии для другой важнейшей сельскохозяйственной культуры - пшеницы [5], а также для представителя бобовых - сои.
Разработка новой germ-line-биотехнологии-создания трансгенных растений пшеницы (генетической трансформации посредством половых элементов растения - пыльцы, яйцеклетки, зародышей и семян) открывает возможность интродукции новых целевых генов, которые могут повысить устойчивость пшеницы к болезням и абиотическим стрессам, улучшить качество зерна, увеличить уровень микроэлементов и витаминов в растении, модифицировать фотосинтез и повысить продуктивность [1, 3].
Целью настоящего исследования является разработка эффективной биотехнологии генетической трансформации и определение подходов к генетической модификации фотосинтеза у пшеницы для повышения ее урожайности до 30% путем введения генов кукурузы, кодирующих ферменты С4 метаболизма фотосинтеза.
Объекты и методы исследования
В исследованиях использовано около 4600 предположительно трансгенных семян пшеницы с геном PEPC, полученных из 5 сортов яровой пшеницы селекции теверо-запада США, и 25 сортов и форм яровой и озимой пшеницы казахстанской селекции с контрастными характеристиками фотосинтеза, продуктивности и засухоустойчивости.
Ген фосфоенолпируват карбоксилазы (PEPC) из кукурузы и Т-плазмида pSB 130/ PEPC, содержащая ген PEPC, любезно предоставлены для проведения совместных и самостоятельных исследований профессором М. Ку из Университета штата Вашингтон (США) [7]. Ген PEPC кодирует фермент С4 метаболизма из кукурузы фосфоeнол пируват карбоксилазу (ФЕПК), функция которого описывается формулой:
ФEП + HCO3- ^ оксалоацетат + Pi
Выращивание суспензии агробактерий для пипетирования проводили в среде LB (Lauri-
Bertini) и инкубировали 1-1,5 суток при 28°С, дважды очищали центрифугированием при 4500 g по 10 мин. Оптимальная плотность агробактерий для трансформации пипетированием составляет 1010 клеток/мл.
Методика проведения агробактериальной трансформации способом агробактериального пипетирования включала оптимизацию суспензии агробактерий с целевым геном агентами трансформации: 1%-ной плурониковой кислотой и/или ацетосирингоном [1]. Отрабатывали технику пипетирования и определяли оптимальную фазу развития растения для трансформации. Суспензию агробактерий на рыльце пестика цветка пшеницы наносили очень аккуратно (в среднюю часть рыльца за 1 -4 сут до оплодотворения).
Выделение ДНК проводили микро- и макрометодами [1]. Нуклеотидную последовательность генов nptII, hptII определяли в базе генов с помощью web.site NCTI. С использованием компьютерной программы «Vector NTI» были рассчитаны и подготовлены праймеры к маркерным генам, входящим в конструкцию гена PEPC. EcoRi фрагмент гена PEPC размером 1,0 кб использовали в качестве положительного контроля при проведении ПЦР.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторах BioRad (США) и Eppendorf (Германия). Использовали реактивы СибЭнзим (Россия). Для анализа продукта ПЦР проводили горизонтальный электрофорез ДНК в 1%-ном агарозном геле. Полученные результаты электрофореза анализировали в гель-документирующей системе BioRad.
Определение активности ФЕПК проводили спектрофотометрически по убыли субстрата ФЕП
[6].
Интенсивность фотосинтетического поглощения СО2 [2] измеряли с использованием портативного газоанализатора CIRAS-1, PP-system (Великобритания). Измерения СО2-газообмена и устьичной проводимости образцов с использованием CIRAS-1 проводили в условиях реальной (от 120 до 600) и потенциальной 1500 мol m-2 s-1 фотосинтетически активной радиации и концентрации СО2 0,03 РРМ.
Сравнительный анализ структуры урожая предположительно трансгенных и исходных форм пшеницы проводили по методам ВИР им. Н.И. Вавилова [2].
Результаты и обсуждение
Разработан новый простой, дешевый, близкий к естественному половому скрещиванию эффективный метод генетической трансформации пшеницы посредством агробактериального пипетирования рыльца пестиков цветков пшеницы на основе механизма дистанционного трансфера пыльцы [3] - метод germ-line-трансформации, который не требует длительных дорогостоящих этапов культуры тканей, регенерации растений, является независимым и может быть использован для интродукции любых целевых генов в пшеницу при создании новых высокопродуктивных, устойчивых к стрессам форм пшеницы в дополнение к традиционной селекции. Метод агробактериального пипетирования включает 5 этапов и 7 подэтапов (рис. 1).
Использование данного метода позволило получить около 4600 предположительно трансгенных семян пшеницы с геном PEPC.
Проведен ПЦР-анализ с растительной ДНК 64 предположительно трансгенных линий пшеницы и их нетрансгенных контролей (рис. 2). Частота трансформации по результатам ПЦР-анализа составила 2,3%.
Проведен анализ фотосинтетической функции трансгенных растений пшеницы. На рис. 3 показано, что трансгенные растения с интродуцированным геном PEPC, наряду с повышением экспрессии PEPC-активности, характеризуются увеличением интенсивности фотосинтетического СО2-газообмена листьями. 17 трансгенных линий пшеницы из 24 показали увеличение интенсивности фотосинтеза на 17% у большинства растений и до 35% у отдельных линий. Увеличение интенсивности фотосинтеза у трансгенных форм коррелировало с повышением устьичной проводимости на 25% у тех же линий.
Анализ взаимосвязи интенсивности фотосинтеза и устьичной проводимости в трансгенных растениях показал положительные корреляции между этими параметрами. Коэффициент корреляции (r2) был равен 0.574. Известно, что устьичная проводимость тесно коррелирует с внутриклеточной концентрацией СО2.
Рис. 1. Схема метода агробактериального пипетирования
Рис. 2. ПЦР-анализ трансгенных растений пшеницы с пробой гена PEPC. Слева направо: маркер ^ 25, 27 - номера трансгенных линий ^ маркер ^ 28, 30 ^ номера трансгенных линий ^ С - отрицательный контроль вода ^ С - положительный контроль - интактный
ген PEPC ^ 10, 23 - нетрансгенные линии
Поэтому высокая интенсивность фотосинтеза трансгенных растений может частично зависеть от способности этих растений создавать повышенную внутриклеточную концентрацию СО2 в листьях, обусловленную увеличением открытия устьиц. Немедленным результатом повышения концентрации внутриклеточной СО2 является увеличение фиксации СО2 из атмосферы, подавление оксигеназной активности РБФК и связанным с этим подавлением фотодыхания.
200 240 2S0 320 360 400
2
Stoma tai conductance (mol / cm / s)
Рис. 3. Трансгенные растения пшеницы с высокой фотосинтетической активностью и
устьичной проводимостью
Исследованы 419 семян 21 линии предположительно трансгенной пшеницы по элементам структуры урожая: высота растения, длина колоса главного и бокового побегов, число стеблей/число колосьев, число колосков в колосе, число зерен в колосе, масса зерна с 1 колоса, масса зерна с 1 растения. Обнаружено, что 17 из 22 трансгенных линий пшеницы Т и Т2 отличались высоким урожаем зерна, превосходящим на 25-30% и более урожай зерна с 1 растения в контроле -исходной форме (табл.).
Таблица
Урожай зерна трансгенных линий пшеницы Т2 и исходного сорта Хауис, средние данные за
2006-2008 гг.
Форма Масса зерна с 1 растения, г Трансген / контроль по Ухоз., %
Контроль 'Houis' 0,56 ± 0,07
Н50РС-26, Ti 0,70 ± 0,06 25
НРС-26, Т2 0,71 ± 0,05 26
Н 25РС-26,Т1 0,67 ± 0,05 20
НРС-22, Ti 0,89 ± 0,05 59
НРС-96, Т1 0,56 ± 0,02
Н 25РС-19, Т2 0,78 ± 0,01 39
Н 25РС-24, Т1 0,57 ± 0,06
Н 25РС-18, Ti 0,78 ± 0,01 39
Выводы
Разработан новый простой, дешевый, близкий к естественному половому скрещиванию эффективный метод генетической трансформации пшеницы посредством агробактериального пипетирования рыльца пестиков цветков на основе механизма дистанционного переноса пыльцы.
Проведена трансформация пшеницы методом агробактериального пипетирования. Получено около 4600 предположительно трансгенных семян пшеницы.
Проведено молекулярно-биологическое подтверждение интродукции гена РЕРС из кукурузы в геном пшеницы по результатам ПЦР-анализа. Идентифицированы 17 трансгенных линий пшеницы на наличие гена РЕРС. Частота трансформации по результатам данного этапа детекции трансгенов составила 2,3% от общего числа полученных семян.
Трансгенная пшеница с экспрессией ключевого фермента метаболизма С4 карбоновых кислот из кукурузы - РЕРС демонстрировала повышение интенсивности фотосинтетического СО2-газообмена на 25-30% и увеличение урожая зерна с одного растения на 25-50%.
Список литературы
1. Кершанская О.И. Генетическая инженерия растений. Практический подход. - Алматы: Доива, 2007. - 152 с.
2. Кершанская О.И. Фотосинтетические основы продукционного процесса у пшеницы. -Алматы: Доива, 2007. - 252 с.
3. Новый способ генетической трансформации пшеницы посредством агробактериального пипетирования: A. c. 60040. Казахстан. 19.KZ13A4.11. 21165/ Кершанская О.И., Джангалина Э.Д. -№ 21165; Заявл. 05.05.2008; Бюл. № 9. - 4 с.
4. Hausler R.E., Hirsch H.-J., Kreuzaler F., Peterhansel C. Overexpression of C4-cycle enzymes in transgenic C3 plants: a biotechnological approach to improve C3-photosynthesis // J. Exp. Bot. - 2002. - V. 53. - P. 591-607.
5. Kershanskaya O.I., Ku M.S.B. Genetic modification of Photosynthesis as a first step to wheat transformation for increased yield // Biotechnology: Theory and Practice. - 2005. - N 4. - P. 10-22.
6. Ku M S B., Cho D., Ranade U., Hsu T.-P., Li X., Jiao D.-M., Ehleringer J., Miyao M., Matsuoka M. Photosynthetic performance of transgenic rice plants overexpressing maize C4 photosynthesis enzymes // Redesign Rice Photosynthesis / Ed. J. Sheehy. - Manilla: IRRI Press, 2000. - 236 p.
7. Leegood R.C. C4 photosynthesis: principles of CO2 concentration and prospects for its introduction into C3 plants // J. Exp. Bot. - 2002. - V. 53. - P. 581-590.
8. Matsuoka M., Furbank R.T., Fukayama H., Miyao M. Molecular engineering of C4 photosynthesis // Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol. - 2001. - V. 52. - Р. 297-314.
9. Miyao M. Molecular evolution and genetic engineering of C4 photosynthetic enzymes // J. Exp. Bot. - 2003. - V. 54 (381), N 2. - Р. 179-189.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.
Б1ОТЕХНОЛОГ1Я КЛОНАЛЬНОГО М1КРОРОЗМНОЖЕННЯ ЛАВАНДИ (LAVANDULA
ANGUSTIFOLIA MILL.)
Т.М. МАНУШК1НА, кандидат сыъсъкогосподарсъких наук Микола!вський державний аграрний ушверситет, Микола!в Л.О. БУГАСНКО, доктор б1олог1чних наук Кримський iнженерно-педагогiчний ушверситет, Омферополь
Вступ
Лаванда вузьколиста (Lavandula angustifolia Mill.) е одтею з основних ефiроолiйних рослин, що культивуються в свт. Ефiрна олiя та суцвггтя лаванди широко використовуються в парфумерно-косметичнш, фармацевтичнш i харчовiй промисловостях. Вирощування лаванди та одержання ефiрноi олii в нашiй краiнi зосереджене в Криму. В умовах ринкового виробництва плануеться до 2015 р. збшьшити площi, зайнятi пiд лавандою, до 10 тис. га, оскшьки вирощування uiei культури е рентабельним. Однак розширення насаджень лаванди стримуеться вiдсутнiстю садивного матерiалу. Шляхом виршення uiei проблеми може бути розробка бшьш iнтенсивних бiотехнологiчних методiв розмноження замiсть традицiйного живцювання.
У лiтературi виявлена досить обмежена кiлькiсть робгт, пов'язаних з бiотехнологiчними дослiдженнями роду Lavandula L. Анашз публiкацiй показуе, що бшьша частина лiтературних даних присвячена вивченню процесiв калусо- i морфогенезу [4, 8], а також накопичення вторинних метаболiтiв у кштинних культурах лаванди: монотерпеноiдiв [5], розмариновоi кислоти [7].
Першi дослiдження культури аткальних меристем лаванди розпочатi в 1нституп ефiроолiйних i лiкарських рослин Н.1. Мещеряковою i Г.А. Сарнецьким у 1985 роцi [3]. У подальшому проведенi нечисленнi дослiдження з клонального мiкророзмноження, присвяченi в основному вивченню гормональноi регуляцii розвитку аткальних меристем, що показують високу видову i сортову специфiчнiсть процесiв регенерацп рослин лаванди в умовах in vitro [1].
Виходячи з цього, метою наших дослщжень було вивчення впливу внутршшх i зовнiшнiх чинниюв на процеси морфогенезу в культурi iзольованих меристем лаванди i розроблення ефективних прийомiв клонального мiкророзмноження нових сортiв i перспективних зразкiв uiei цiнноi ефiроолiйноi рослини.
Об'екти та методи дослщження
