CC BY
2
Для корреспонденции
Костылева Елена Викторовна - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов ВНИИПБТ -филиала ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 111033, Российская Федерация, г. Москва, ул. Самокатная, д. 4б Телефон: (495) 362-33-71 E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4775-303X
Куксова Е.В., Костылева Е.В., Середа А.С., Толокнова А.А., Фурсова Е.А., Волкова Г.С.
Совершенствование технологии получения пищевого ингредиента с пробиотическими свойствами с использованием нового комплексного протеолитического ферментного препарата
Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, г. Москва, Российская Федерация
All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology - a branch of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 111033, Moscow, Russian Federation
Разработка технологий получения бакконцентратов и ферментных препаратов на основе отечественных штаммов является актуальной задачей. Использование ферментативных гидролизатов сывороточных белков в качестве компонентов питательных сред для культивирования молочнокислых и бифидо-бактерий дает возможность совершенствования существующих и разработки инновационных процессов получения бакконцентратов с функциональными свойствами для производства биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов. Во ВНИИПБТ - филиале ФГБУН «ФИЦ
Improving the technology for obtaining an ingredient with probiotic properties using a new complex proteolytic enzyme preparation
Kuksova E.V., Kostyleva E.V., Sereda A.S., Toloknova A.A., Fursova E.A., Volkova G.S.
Финансирование. Исследования выполнены в рамках государственного задания № FGMF-2022-0006. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Волкова Г.С., Куксова Е.В.; проведение экспериментальных исследований -Куксова Е.В., Середа А.С., Толокнова А.А., Фурсова Е.А.; анализ экспериментальных данных - Костылева Е.В., Куксова Е.В.; написание текста - Костылева Е.В., Куксова Е.В., Середа А.С.; редактирование статьи - Волкова Г.С.; ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Для цитирования: Куксова Е.В., Костылева Е.В., Середа А.С., Толокнова А.А., Фурсова Е.А., Волкова Г.С. Совершенствование технологии получения пищевого ингредиента с пробиотическими свойствами с использованием нового комплексного протеолитического ферментного препарата // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 5. С. 142-152. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-5-142-152 Статья поступила в редакцию 03.07.2024. Принята в печать 16.09.2024.
Funding. The research was carried out within the framework of the state assignment No. FGMF-2022-0006. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Concept and design of the study - Volkova G.S., Kuksova E.V.; experimental studies - Kuksova E.V., Sereda A.S., Toloknova A.A., Fursova E.A.; analysis of the data - Kostyleva E.V., Kuksova E.V.; writing the text - Kostyleva E.V., Kuksova E.V., Sereda A.S.; scientific editing of the article - Volkova G.S.; responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Kuksova E.V., Kostyleva E.V., Sereda AS., Toloknova A.A., Fursova E.A., Volkova G.S. Improving the technology for obtaining an ingredient with probiotic properties using a new complex proteolytic enzyme preparation. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (5): 142-52. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-5-142-152 (in Russian) Received 03.07.2024. Accepted 16.09.2024.
питания и биотехнологии» создан консорциум пробиотических микроорганизмов - молочнокислых и бифидобактерий - с целью использования в качестве заквасок для специализированной молочной продукции. На основе штамма Aspergillus oryzae 21-154 LAP был получен новый комплексный ферментный препарат с лабораторным названием Протооризин LAP, предназначенный для глубокого гидролиза белковых субстратов.
Цель исследования - оценить возможность использования нового отечественного протеолитического ферментного препарата Протооризин LAP при приготовлении питательных сред на основе молочной сыворотки для культивирования консорциума пробиотических микроорганизмов для получения бакконцентратов.
Материал и методы. Объект исследований - симбиотический консорциум, включающий штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2, Lactococcus lactis subsp. lactis М-12, Streptococcus thermophilus В-92 и бифидобактерий Bifidobacterium longum Б-2. В качестве основы для приготовления питательной среды использовали неосветленную творожную молочную сыворотку, в которую вносили концентрат сывороточных белков. Среды обрабатывали препаратом ß-галактозидазы для снижения содержания лактозы. Гидролиз белков в контрольном варианте проводили обработкой питательных сред коммерческими препаратами сериновой протеазы - Alcalase® 2.4 L и лейцинамино-пептидазы - Flavourzyme® 1000 L. В опытном варианте действие 2 импортных препаратов заменяли лабораторным образцом препарата Протооризин LAP. В полученных питательных средах определяли содержание аминного азота, свободных аминокислот и растворимого белка, проводили электрофорети-ческий анализ белков и пептидов. Контроль процесса роста консорциума на исследуемых питательных средах осуществляли по содержанию сухих веществ и редуцирующих сахаров, по активной и титруемой кислотности, а также микроскопированием. Количество жизнеспособных клеток молочнокислых и бифидобактерий по завершении ферментации определяли посевом на соответствующие селективные агаризованные среды, с использованием автоматического счетчика колоний.
Результаты. Эффективность Протооризина LAP при гидролизе белков молочной сыворотки существенно превосходила результат совместного действия Alcalase® 2.4 L и Flavourzyme® 1000 L как по снижению содержания нерасщепленного белка, в том числе иммуногенных фракций, так и по выходу растворимого белка, аминного азота и аминокислот. Полученные с применением протеаз питательные среды обеспечили хороший рост и развитие консорциума пробиотических штаммов, причем за счет высокого содержания свободных аминокислот на среде, полученной с применением Протооризина LAP, динамика сбраживания углеводов, титруемая кислотность, количество жизнеспособных клеток пробиотических штаммов были выше в опытном варианте, чем при использовании коммерческих препаратов. Применение Протооризина LAP при получении питательной среды также позволило повысить жизнеспособность клеток бактерий после лиофилизации.
Заключение. Разработанные технологические приемы с применением нового протеолитического препарата Протооризин LAP при приготовлении питательных сред на основе белков молочной сыворотки могут быть использованы в технологии производства бакконцентратов на стадии культивирования созданного консорциума на основе молочнокислых и бифидобактерий. Бакконцентрат может быть рекомендован в качестве рецептурного ингредиента при изготовлении содержащих пробиотики биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов.
Ключевые слова: белок молочной сыворотки; гидролиз; ферментные препараты; пробиотики; консорциум; бакконцентраты
The development of technologies for producing bacterial concentrates and enzyme preparations using domestic microbial strains is an urgent task. The use of whey protein hydrolysates as components of nutrient media for probiotic bacteria consortia for the cultivation of lactic acid and bifidobacteria makes it possible to improve and develop innovative processes for obtaining bacterial concentrates with the required functional properties for the production of dietary supplements. A consortium of probiotic microorganisms (lactic acid and bifidobacteria) was created in the All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology as a starter culture for specialized dairy products. Using strain Aspergillus oryzae 21-154 LAP a new complex enzyme preparation with a laboratory name Protoorizin LAP has been obtained providing the extensive hydrolysis of protein substrates.
The purpose of the research was to evaluate the possibility of using the new domestic proteolytic enzyme preparation Protoorizin LAP in preparing whey-based nutrient media for culturing a consortium of probiotic microorganisms to obtain bacterial concentrates. Material and methods. The object of the research was a symbiotic consortium, including lactic acid bacteria strains (Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ff-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2, Lactococcus lactis subsp. lactis M-12, Streptococcus thermophilus B-92) and bifidobacteria (Bifidobacterium longum E-2). Unclarified curd whey and whey protein concentrate were taken as the nutrient medium basis. The media were treated with fi-galactosidase to reduce the lactose content. In order to hydrolyze proteins, the control culture medium was treated with commercial preparations: serine protease - Alcalase® 2.4 L and leucine aminopeptidase -Flavourzyme® 1000 L. In the experimental medium, two imported preparations were replaced with a laboratory sample of the enzyme preparation Protoorizin LAP. In the prepared nutrient media, the content of amine nitrogen, free amino acids and soluble protein was determined, and electrophoretic analysis of proteins and peptides was carried out. The consortium growth was monitored by the content of dry substances and reducing sugars, by active and titratable acidity, as well as by microscopy. The number of viable cells of lactic acid bacteria and bifidobacteria at the end of fermentation and in the resulting bacterial concentrates were determined by sieving on the appropriate selective agar media using an automatic colony counter.
Results. The effectiveness of Protoorizin LAP in the hydrolysis of whey proteins significantly exceeded the result of the combined action of Alcalase® 2.4 L and Flavourzyme® 1000 L both in terms of reducing the undigested protein content, including immunogenic fractions, and in terms of the yield of soluble protein, amine nitrogen and amino acids. The nutrient media obtained using proteases ensured good growth and development of the probiotic consortium. Due to the high content of free amino acids, the dynamics of carbohydrate consumption, titratable acidity, and the number of viable cells were higher in the medium obtained using Protoorizin LAP than when using commercial preparations. At the same time, a high titer of probiotic strains and good cultural and morphological characteristics were obtained on all media. The experimental preparation Protoorizin LAP provided the increase in viability of bacterial cells after lyophilization.
Conclusion. The technological method that include application of the new proteolytic preparation Protoorizin LAP in preparing nutrient media based on whey proteins was developed. The method can be used in the technology of producing bacterial concentrates at the stage of culturing of the created lactic acid and bifidobacteria consortium. The bacterial concentrate can be recommended as a recipe ingredient in the manufacture of dietary supplements or foods for special dietary uses containing probiotics. Keywords: whey protein; hydrolysis; enzyme preparations4 probiotics; consortium; bacterial concentrates
В последнее время динамично развивается рынок специализированных пищевых продуктов, прежде всего молочной низколактозной и гипоаллергенной продукции, производство которой основано на использовании стартовых культур молочнокислых и бифидобактерий в виде бактериальных заквасок и бакконцентратов, обладающих пробиотическими свойствами [1]. При достаточной концентрации пробиотики оказывают противоми-кробное действие за счет усиления адгезии клеток молочнокислых и бифидобактерий к слизистой оболочке кишечника, конкурентной элиминации патогенных микроорганизмов, продукции антимикробных веществ и регуляции иммунной системы. В состав большинства пробиотиков входят бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium [2].
Для достижения максимального положительного эффекта пробиотики часто используют в виде синбио-тиков, т.е. в комплексе с пребиотиками - веществами, способными селективно стимулировать рост полезной микрофлоры [3, 4]. Традиционно в качестве пребиоти-ков используют олигосахариды: лактулозу, галактоо-лигосахариды, олигофруктозу, мальтоолигосахариды.
Однако олигосахариды в качестве побочного эффекта могут вызывать диарею и повышенное газообразование. Рядом исследователей был показан пребиотиче-ский эффект белковых гидролизатов. Легкодоступный для бактерий белок в виде коротких пептидов и свободных аминокислот способствует пролиферации бактерий, может действовать как промотор систем транспорта полипептидов, а также повышать жизнеспособность и кислотоустойчивость штаммов [2, 3]. Так, обработанный пепсином казеин оказывал антимикробное действие на E. coli в кислой среде, но повышал кислотоустойчивость L. rhamnosus. Гидролизаты сывороточного белка способствуют пролиферации пробиотических бактерий, причем наибольший эффект наблюдается при оптимальной степени гидролиза, обеспечивающей наличие в питательной среде пептидов и аминокислот, которые являются ростостимулирующими компонентами для молочнокислых и бифидобактерий. Сывороточные пептиды играют важную роль в образовании короткоцепо-чечных жирных кислот, которые могут предотвращать инвазию патогенных бактерий, регулируя барьерную функцию и иммунный статус кишечника хозяина и тем
самым увеличивая содержание пробиотиков в микро-биоте [2]. Криопротекторные свойства белковых гидро-лизатов играют важную роль при получении бактериальных концентратов, производство которых включает как этап концентрирования бактериальных клеток, так и их консервирование методами криозаморажи-вания и вакуум-сублимационной (лиофильной) сушки [1, 3, 5, 6]. Гидролизаты белков молока широко используются в качестве основы для питательных сред для выращивания консорциумов пробиотических бактерий при получении бакконцентратов [7]. Гидролизаты белков молочной сыворотки защищают клетки во время сублимационной сушки и хранения, сохраняя целостность клеточной мембраны и снижая вредное воздействие окислительного стресса [5].
Важным фактором, влияющим на пребиотические свойства белковых гидролизатов, является моле-кулярно-массовое распределение в них пептидов [2]. В наибольшей степени рост пробиотических микроорганизмов стимулируют низкомолекулярные пептиды и свободные аминокислоты. Так, гидролизаты казеина, содержащие пептиды с молекулярной массой (ММ) ниже 1 кДа, существенно ускоряли рост Bifidobacterium infantis, B. breve и B. longum [3]. Сывороточные пептиды с ММ ниже 1 кДа оказывали пролиферативное действие на пробиотические бактерии, в частности отмечалось увеличение количества жизнеспособных клеток L. acidophilus и Bifidobacterium spp. Гидролизат сывороточного белка оказывал более выраженное защитное действие на B. lactis Пробио-М8, чем интактный сывороточный белок той же концентрации [2, 5, 8]. Пептиды молочной сыворотки не только оказывали антибактериальное действие в отношении патогенных микроорганизмов (E. coli, B. subtilis и Staphylococcus aureus), но и стимулировали рост пробиотических бактерий Bifidobacterium longum ATCC 15707 [3]. Следует также отметить, что пептиды, образующиеся при ферментативном гидролизе молочной сыворотки, проявляют различные биологические функции, включая благоприятное воздействие на нервную, эндокринную, иммунную, сердечно-сосудистую и пищеварительную системы, что повышает биологическую ценность получаемых на ее основе специализированных пищевых продуктов [3].
На российском рынке бакконцентратов наблюдается высокая зависимость от импорта - доля отечественной продукции составляет лишь 9-12% [1]. Перспективным решением этой проблемы представляется создание заквасок и бакконцентратов на основе отечественных микробных культур и пребиотических компонентов, обладающих как функциональными, так и криопротек-торными свойствами. В качестве пребиотиков целесообразно рассматривать гидролизаты белков молочной сыворотки, полученные с помощью протеолитических ферментов.
Т.А. Раскошной и соавт. [7, 9] была разработана технология получения бакконцентрата L. reuteri с использованием питательных сред на основе обезжиренного молока и молочной сыворотки, обработанных фермент-
ными препаратами (ФП) бактериальных эндопротеаз (Alcalase, Neutrase, Protamex, Протосубтилин). Наиболее активный рост пробиотической культуры наблюдался на средах, полученных с использованием ФП Alcalase (Novozymes A/S, Дания) в дозировке 3% от содержания белка в среде.
Чтобы обеспечить расщепление иммуногенных белков молочной сыворотки, устранить горечь, обусловленную образованием горьких пептидов в результате действия эндопротеаз на молочные белки, и получить гидролизаты с высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, наиболее эффективных в качестве компонентов сред для культивирования молочнокислых и бифидобактерий, комбинируют действие эндопротеаз с источниками лейцинаминопепти-дазы (LAP), - такими ФП, как Flavourzyme (Novozymes A/S, Дания), Flavorpro (Biocatalysts Limited, Великобритания) и др. [10, 11]. В связи с уходом с российского рынка основных производителей протеолитических ферментов проводится поиск отечественных ФП, способных обеспечить глубокий гидролиз белковых субстратов, в частности белков молочной сыворотки, которая является вторичным сырьевым ресурсом молочной промышленности.
В производстве биологически активных добавок с пробиотиками, а также специализированных пищевых продуктов и заквасок важным аспектом является разработка недорогих, эффективных производственных питательных сред для культивирования микроорганизмов.
Во ВНИИПБТ создан консорциум пробиотических микроорганизмов - молочнокислых и бифидобактерий с целью использования в качестве заквасок для специализированной молочной продукции, подобран состав питательной среды на основе молочной сыворотки для получения бакконцентратов. На основе селекционированного штамма Aspergillus oryzae 21-154 LAP - продуцента комплекса протеолитических ферментов с увеличенной активностью лейцинаминопептидазы, получен новый комплексный ФП Протооризин LAP, предназначенный для глубокого гидролиза белковых субстратов. Ввиду высокой потребности молочнокислых бактерий в сложных питательных веществах, обогащение питательной среды продуктами гидролиза белка (пептидами и пептонами) приводит к повышению их способности сбраживать лактозу и стимулирует рост молочнокислых бактерий более значимо, чем аминокислоты. Для интенсивного накопления биомассы бифидобактериям в большей степени, чем молочнокислым бактериям, требуются аминокислоты, прежде всего пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Обладая некоторой протеолитической активностью, бифидобакте-рии могут дополнительно обеспечить свои потребности в азотистых веществах [12, 13].
Цель исследований - создание бакконцентрата молочных и бифидобактерий на основе гидролизата молочной сыворотки и концентрата сывороточного белка с использованием отечественного ФП Протооризин LAP.
Материал и методы
Объект исследований - симбиотический консорциум, включающий штаммы молочнокислых бактерий: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2, Lactococcus lactis subsp. lactis М-12, Streptococcus thermophilus В-92 и бифидобактерии Bifidobacterium longum Б-2.
В качестве основы для приготовления питательной среды использовали неосветленную творожную молочную сыворотку фермерского хозяйства «Луч» (Московская область, Волоколамский район). В 1200 см3 сыворотки добавляли 60 г концентрата сывороточных белков (КСБ) («ООО Миксэм», РФ), затем вносили ФП р-галактозидазы («Зитекс», Индия) в дозировке 0,1% от содержания лактозы, устанавливали рН 5,5 и проводили гидролиз в течение 2 ч при 50 °С. Далее доводили рН до 6,2, в контрольный вариант вносили протеолитиче-ские ФП Alcalase® 2.4 L в дозировке 2% от содержания белка и Flavourzyme® 1000 L - 1% от содержания белка. В экспериментальный вариант вносили ФП Протооризин LAP в дозировке 1,5% от содержания белка. Проводили гидролиз в течение 4 ч при 55 °С по ранее отработанным параметрам [11], что позволило получить гидролизаты с пониженной аллергенностью и отсутствием горького и соленого привкусов.
В полученные гидролизаты вносили минеральные соли и ростостимулирующие добавки: KH2PO4 - 0,1%, MnSO4x4 H2O - 0,05%, MgSO4x7 H2O - 0,02%, Na3C6H5O7 x 2H2O - 0,03%. Для ускорения адаптации консорциума и интенсификации роста бифидобактерий в полученные гидролизаты вносили L-цистеин солянокислый -0,05 г, а также в 2 первых пассажах при пересеве консорциума добавляли Твин-80 - 1 см3 на 1 дм3 среды. Готовые среды нейтрализовали до рН 7,0, выдерживали 9 мин при 90 °С для инактивации ферментов и пастеризации, с последующим быстрым охлаждением среды до 38±1 °С.
В полученных питательных средах проводили определение аминного азота методом формольного титрования по ГОСТ 25179-2014 «Молоко и молочные продукты. Методы определения массовой доли белка», определяли содержание свободных аминокислот нин-гидриновым методом и растворимого белка спектро-фотометрическим методом [14]. Разделение белков в полученных гидролизатах по ММ методом электрофореза проводили в 12% полиакриламидном геле (25 мМ трис-глициновый буфер, pH 8,3, с додецилсуль-фатом натрия в концентрации 1 мг/см3) в ячейке для электрофореза Mini Protean Cell system (Bio-Rad, США). Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250 (Amresco, США).
Для изучения динамики роста и развития консорциума на приготовленных питательных средах культивирование проводили в течение 24 ч при 37 °С. Засев питательных сред осуществляли 5% посевного материала консорциума. Культивирование проводили в микро-
аэрофильных условиях при периодическом неинтенсивном перемешивании культуральных жидкостей (КЖ) в колбах 3-4 раза в сутки.
Контроль процессов ферментации осуществляли по следующим показателям: содержание сухих веществ, титруемая кислотность, активная кислотность, содержание редуцирующих веществ методом Шомоди-Нель-сона по ГОСТ Р 54905 «Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности бета-глюка-назы», а также микроскопированием посевного материала и КЖ с использованием микроскопа Nikon ECLIPSE Ci-S/Ci-L с программным обеспечением Infinity Analyze Lumenera (Lumenera Corporation, Канада).
В процессе ферментации проводили нейтрализацию КЖ 10% раствором NaOH. По завершении ферментации определяли титр микроорганизмов при рассеве на селективные агаризованные среды: для молочнокислых бактерий - на агар MRS для лактобактерий (Himedia M641. Lactobacillus MRS Agar) и на агар Ли (Himedia M602); для бифидобактерий - на агар для бифидобак-терий (Himedia M 1396. Bifidobacterium Agar). Подсчет выросших колоний проводили с использованием автоматического счетчика колоний Scan 500 (Interscience, Франция).
Бактериальную массу выделяли на центрифуге ОПН-16 (Labtex, Россия) при 10 000 об/мин (4 °C) в течение 15 мин. Концентрирование полученных КЖ осуществляли с использованием инновационного баромембран-ного процесса ультрафильтрации. Использовали экспериментальную ячейку с плоской мембраной и лопастной мешалкой. Фильтрацию проводили в тупиковом режиме через полисульфонамидную мембрану УПМ-20 («Влади-пор», Россия) при температуре 20 °С. Полученный концентрат замораживали в морозильной камере SANYO MDF-192(T) (SANYO, Япония) и лиофильно высушивали на сублиматоре Thermo Scientific Heto LyoLab 3000 (Thermo Scientific Heto, Дания). Для определения жизнеспособности клеток пробиотических бактерий после лиофилизации готовые бакконцентраты разводили в стерильной дистиллированной воде и рассевали на указанные выше селективные среды для подсчета титра.
Статистическую обработку результатов, полученных не менее чем в 3 повторностях, проводили с использованием программы Statistica 6.0 методом однофакторного дисперсионного анализа при уровне значимости 0,05.
Результаты и обсуждение
Обработка базовой основы питательной среды р-галактозидазой, приводящая к трансформации лактозы до глюкозы и галактозы, позволила оптимизировать питательную среду и создать благоприятные условия для накопления биомассы молочнокислых и бифидобактерий, входящих в состав консорциума, не вызывая конкуренции за углеводный субстрат. Реакция трансгликозилирования протекает параллельно с гидро-
M 1 2 3
116,0 т
лизом субстрата, а глюкоза служит активным акцептором галактозильного остатка, обеспечивая синтез продуктов трансгликозилирования лактозы [15].
Подобранный режим обеспечил гидролиз 53,0% лактозы базовой основы питательной среды (от суммарного содержания 4,6% лактозы творожной сыворотки и КСБ), что является оптимальным для последующей стадии ферментации.
Проведение гидролиза позволяет молочнокислым бактериям, входящим в состав консорциума, не только более активно утилизировать лактозу, но и вырабатывать из галактозы полисахарид галактозан, придающий вязкость сгустку [16, 17].
Экзополисахариды не только обладают большим потенциалом в профилактике заболеваний человека [18, 19], они также могут стать ингредиентами в пищевой промышленности для придания особой качественной структуры и вкуса, что является преимуществом в биотехнологических процессах производства бакконцентратов на молочных средах. В публикациях [20, 21] отмечается, что экзополисахариды, продуцируемые пробиотическими штаммами молочнокислых и бифидобактерий, также способны взаимодействовать с кишечной микробиотой. Фактически некоторые из этих полимеров могут использоваться в качестве источника ферментируемых углеводов рядом кишечных комменсалов, предположительно, участвуя в высвобождении бактериальных метаболитов, полезных для организма хозяина.
Для обогащения питательной среды аминокислотами и пептидами в гидролизат молочной сыворотки вносили КСБ. Сывороточные белки представляют собой водорастворимую фракцию белков молока и содержат 50-60% р-лактоглобулина с ММ около 18,3 кДа, как правило, в форме димера с ММ 35-40 кДа и 20% а-лактальбумина с ММ 14,2 кДа [22, 23]. Эти белки не гидролизуются пепсином желудочного сока и проявляют иммуногенные свойства, что затрудняет их использование в производстве пищевых продуктов, включая специализированные. В связи с этим основным качественным показателем полноты гидролиза сывороточных белков является отсутствие на электрофореграммах выраженных полос, соответствующих белкам с ММ выше 10 кДа.
Для количественной оценки глубины и интенсивности гидролиза белков в питательных средах изучали содержание растворимого белка и свободных аминокислот (табл. 1). Высокое содержание свободных аминокислот в гидролизатах существенно занижает результаты определения содержания растворимого белка традицион-
Рис. 1. Электрофореграмма основных белков молочной сыворотки при обработке питательных сред различными ферментными препаратами (ФП): 1 - контроль (без ФП); 2 - Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L; 3 - Протооризин LAP
Fig. 1. Electropherogram of the major whey proteins when treating culture media with various enzyme preparations (EPs): 1 - control (without EP); 2 - Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L; 3 - Protoorizin LAP
ным методом Лоури. Поэтому, учитывая использование в работе ФП с высокой активностью LAP, для получения корректных данных по содержанию растворимого белка применяли метод оптической спектрофотометрии в диапазоне 210-220 нм [14].
Полученные данные показали высокую эффективность Протооризина LAP при гидролизе иммуногенных белков молочной сыворотки (рис. 1). В отличие от варианта с применением комплекса импортных коммерческих препаратов, где осталась выраженная полоса на уровне около 18,3 кДа, соответствующая нерасщеплен-ному р-лактоглобулину, в варианте с Протооризином LAP данная полоса практически незаметна. Все остальные молочные белки были успешно гидролизованы используемыми ФП до пептидов и аминокислот.
Таблица 1. Количественные показатели эффективности гидролиза белков при приготовлении сред для культивирования консорциума
Table 1. Quantitative indicators of the efficiency of protein hydrolysis when preparing media for consortium
Ферментный препарат Enzyme preparation Растворимый белок, мг/см3 Soluble protein, mg/cm3 Свободные аминокислоты, мг/см3 Free amino acids, mg/cm3
Без протеолитических ферментов (контроль) Without proteolytic enzymes (control) 32,1 ±1,5 4,9±0,2
Alcalase® 2.4 L - 2% + Flavourzyme® 1000 L - 1% 46,0±1,9 7,1 ±0,4
Протооризин LAP - 1,5% / Protooryzin LAP - 1.5% 49,3±2,1 21,1 ±1,1
Время ферментации, ч Fermentation time, h
Рис. 2. Динамика изменения содержания редуцирующих веществ (РВ) в процессе роста консорциума: 1 - на среде, полученной с применением Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L; 2 - на среде, полученной с применением Протооризина LAP
Fig. 2. Dynamics of changes in the reducing substances (RS) content during the growth of the consortium: 1 - on the medium obtained using Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L; 2 - on the medium obtained using Protooryzin LAP
Использование Протооризина LAP также значительно увеличило содержание аминокислот в питательной среде. Если действие Флавозима привело к повышению содержания аминокислот лишь на 45% по сравнению с контролем (без гидролиза протеоли-тическими ферментами), то Протооризин LAP повысил содержание аминокислот в 4,3 раза по сравнению с контролем.
Показатель аминного азота в среде с Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L составил 310,2 мг%, а в питательной среде с Протооризином LAP - 514,2 мг%. Полученные значения свидетельствуют о достаточном содержании доступного аминного азота для роста и развития консорциума на приготовленных питательных средах.
Подготовленные питательные среды засевали консорциумом молочнокислых и бифидобактерий и культивировали при 37 °С в течение 24 ч.
Из данных рис. 2 очевидно - штаммы молочнокислых и бифидобактерий, входящие в состав консорциума, активно утилизируют углеводы питательных сред на основе гидролизатов молочной сыворотки, что обусловлено наличием более легкоусвояемых форм азота (аминокислоты, низкомолекулярные пептиды), а также различиями молочнокислых и бифидобактерий в механизмах регуляции метаболизма, которые обеспечивают взаимодополняемость сбраживания углеводов, характерную для симбиоза.
Кислотообразование относится к показателям специфической активности пробиотиков на основе лакто-и бифидобактерий. Продуцируемые ими карбоновые кислоты играют существенную роль в становлении и функционировании кишечной микробиоты желудочно-кишечного тракта. Кислотообразование явля-
Время ферментации, ч Fermentation time, h
Рис. 3. Динамика изменения титруемой кислотности в процессе роста консорциума: 1 - на среде, полученной с применением Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L; 2 - на среде, полученной с применением Протооризина LAP
Fig. 3. Dynamics of changes in titratable acidity during the growth of the consortium: 1 - on the medium obtained using Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L; 2 - on the medium obtained using Protooryzin LAP
ется культуральным свойством, характеризующим биохимическую и в значительной степени определяющим антагонистическую активность клеток производственных штаммов молочнокислых бактерий [24]. Кислотообразующая активность характеризует интенсивность сбраживания углеводного субстрата. Согласно полученным данным, представленным в табл. 1 и на рис. 3, кислотообразующая активность консорциума молочнокислых и бифидобактерий коррелировала с более высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов в питательной среде, на что указывает появление третьего пика титруемой кислотности в варианте с Протооризином LAP на час раньше, чем на среде с Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L. Это подтверждается данными, полученными А.В. Бегу-новой с соавт. [25].
Следует отметить, что рост и развитие консорциума на питательной среде с Протооризином LAP продемонстрировали лучшую динамику сбраживания углеводов и кислотообразующей активности (см. рис. 2, 3), чем на среде с Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L.
Проведенная микроскопия образцов КЖ показала высокую плотность популяции штаммов, входящих в состав консорциума, что позволяет судить о стабильности соотношения клеток молочнокислых и бифидобактерий 2:1, при этом клетки Bifidobacterium longum, без бифуркации, имели правильную форму гранулированных палочек, без ветвлений, а также обнаруживались коккоидные и диплококкоидные клетки. Клетки молочнокислых бактерий L. bulgaricus, L. plantarum и Lactobacillus helveticus, без деформаций, представлены палочками, а Lac. lactis и St. thermophilus - мелкими и более крупными кокками, что соответствует культу-
Таблица 2. Количество жизнеспособных клеток штаммов-продуцентов, входящих в состав консорциума, в культуральных жидкостях Table 2. The number of viable cells of the producer strains included in the consortium in cultural liquids
Штамм Strain Количество жизнеспособных клеток штаммов-продуцентов, КОЕ/см3 Number of viable cells of producer strains, CFU/cm3
на среде с Протооризином LAP on the medium prepared using Protoorizin LAP на среде с Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L on the medium prepared using Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L
Пробиотические лактобактерии: Probiotic lactobacilli: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2 (4,93±0,02)х108 (3,89±0,01)x108
Молочнокислые микроорганизмы в ассоциациях с пробиотическими микроорганизмами: Lactic acid microorganisms in association with probiotic microorganisms: Lactococcus lactis subsp. lactis М-12, Streptococcus thermophilus В-92 (3,44±0,02)х109 (1,89±0,02)х108 (2,36±0,02)x109 (1,53±0,02)x108
Бифидобактерии: Bifidobacteria: Bifidobacterium longum Б-2 (6,34±0,02)х109 (5,27±0,02)x109
рально-морфологическим характеристикам [26] и является несомненным признаком достаточной концентрации необходимых питательных компонентов и ростовых факторов.
По окончании процесса ферментации определяли количество жизнеспособных клеток в КЖ. Результаты представлены в табл. 2.
В результате проведенных серий ферментаций установлено, что КЖ, содержащие максимальное количество жизнеспособных клеток бифидобактерий и молочнокислых бактерий в активной фазе роста, целесообразно получать на стадии окончания экспоненциальной фазы роста и устойчивого выхода на стационарную фазу (15-17 ч развития консорциума), когда титр жизнеспособных клеток наиболее высокий и сохраняется на том же уровне до 22-го часа ферментации, и далее направлять на концентрирование и лиофильную сушку.
Для отработки режима концентрирования использовали влажный осадок после центрифугирования консорциума с содержанием жизнеспособных клеток не менее 6x10 КОЕ/см3, а концентрирование фильтрата осуществляли при давлении 1,2 МПа через мембрану УПМ-20, при этом содержание жизнеспособных клеток в концентратах составляло (5-7)х10 КОЕ/см3.
Исходя из видовой принадлежности штаммов-продуцентов, входящих в состав консорциума, был подобран состав защитной среды с внесением сухого рисового мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом, равным 25, желатозы (5%), лимоннокислого натрия (1%) и аскорбиновой кислоты (0,1%). Вместо воды при приготовлении криопротекторной среды использовали полученные пермеаты, нейтрализованные до рН 7, а остатки неиспользованных пермеатов возвращали на стадию приготовления питательных сред.
Далее смешивали полученные жидкие концентраты с влажным осадком и криозащитной средой (криопро-
текторами) в соотношении 1:1. Криопротекторы предохраняют клетки микроорганизмов от негативного влияния фазового перехода воды в лед при замораживании, а также способствуют понижению осмотического давления внутри клеток и тем самым препятствуют разрыву клеточных оболочек при оттаивании и замораживании [27].
Процесс замораживания проводили в морозильной камере и лиофильно высушивали. Экспериментально подобранные условия лиофилизации предусматривают 3 возможных режима предварительного замораживания бактериальных концентратов консорциума: 1) 8 ч при -55 °С; 2) 8 ч при -35...-40 °С и 3) 12-14 ч при -25 °С. Применение этих условий обеспечивало в дальнейшем (после проведения досушивания лиофилизатов бактериальных концентратов консорциума в течение 12-16 ч при 25 °С до остаточной влажности <4%) сохранение жизнеспособности клеток не менее 3,0х1010 КОЕ/г.
Для определения жизнеспособности клеток бактерий после лиофилизации готовые сухие образцы бакконцен-тратов разводили в стерильной дистиллированной воде и рассевали на селективные среды. Результаты представлены в табл. 3.
Заключение
Проведение гидролиза питательной среды, содержащей молочную сыворотку и КСБ, последовательно ФП р-галактозидазы (0,05% по лактозе, 2 ч при 50 °С) и Про-тооризином LAP (1,5% по белку, 4 ч при 55 °С, рН 6,2) позволяет снизить содержание лактозы и иммуногенных белков, при этом питательная среда обогащается низкомолекулярными пептидами и аминокислотами.
Культивирование консорциума молочнокислых и бифидобактерий (L. delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, L. plantarum 578/25, L. helveticus 842(D)-2, Lc. lactis subsp.
Таблица 3. Количество жизнеспособных клеток пробиотических культур в лиофилизированных образцах бакконцентрата Table 3. Number of viable cells of probiotic cultures in lyophilized samples of bacterial concentrate
Штамм Strain Количество жизнеспособных клеток штаммов-продуцентов, КОЕ/г Number of viable cells of producer strains, CFU/g
на среде с Протооризином LAP on the medium prepared using Protoorizin LAP на среде с Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L on the medium, prepared using Alcalase® 2.4 L + Flavourzyme® 1000 L
Пробиотические лактобактерии: Probiotic lactobacilli: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2 (3,58±0,02)х109 (2,14±0,01)x109
Молочнокислые микроорганизмы в ассоциациях с пробиотическими микроорганизмами: Lactic acid microorganisms in association with probiotic microorganisms: Lactococcus lactis subsp. lactis М-12, Streptococcus thermophilus В-92 (3,20±0,02)х109 (2,49±0,02)х109 (2,84±0,02)x109 (1,92±0,02)x109
Бифидобактерии: Bifidobacteria: Bifidobacterium longum Б-2 (3,54±0,02)х1010 (2,71±0,02)x1010
Итого Total (4,47±0,02)х1010 (3,4±0,02)x1010
lactis М-12, St. thermophilus В-92, B. longum Б-2) в течение 24 ч на среде с гидролизатом сывороточных белков позволяет интенсивно сбраживать углеводы при высокой скорости роста консорциума и обеспечивает титр жизнеспособных клеток на конец культивирования до 6,34х109 КОЕ/см3.
При получении бакконцентрата КЖ концентрируется до 5х1012 КОЕ/см3, концентрат лиофильно высушивается с защитной средой в соотношении 1:1 до влажности менее 4%. Полученная пищевая добавка с титром клеток в препарате не менее 3х1010 КОЕ/г может быть рекомендована для использования в составе биоло-
Сведения об авторах
гически активных добавок к пище в качестве источника бифидобактерий, пробиотических лактобактерий и молочнокислых бактерий.
Таким образом, использование нового ФП протео-литического действия при приготовлении питательной среды для культивирования консорциума пробиотиче-ских микроорганизмов обеспечило высокие показатели жизнеспособности и продуктивности штаммов, входящих в состав консорциума. Разработанные технологические режимы могут быть использованы в технологии производства бакконцентрата на основе созданного консорциума молочнокислых и бифидобактерий.
ВНИИПБТ - филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация): Куксова Елена Владимировна (Elena V. Kuksova) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии органических кислот, пищевых и кормовых добавок E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6497-6828
Костылева Елена Викторовна (Elena V. Kostyleva) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4775-303X
Середа Анна Сергеевна (Anna S. Sereda) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9097-3946
Толокнова Анастасия Алексеевна (Anastasia A. Toloknova) - инженер-технолог лаборатории биотехнологии органических кислот, пищевых и кормовых добавок E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0002-2979-6658
Фурсова Елизавета Андреевна (Elizaveta A. Fursova) - инженер-технолог лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8330-3231
Волкова Галина Сергеевна (Galina S. Volkova) - доктор технических наук, заведующий лабораторией биотехнологии органических кислот, пищевых и кормовых добавок E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4051-1828
Литература
1. Пойманов В.В., Гришанова Д.С., Антипов С.Т. Исследование процессов замораживания и вакуум-сублимационной сушки бактериальных концентратов для молочной отрасли // 15. Вестник ВГУИТ. 2018. Т. 80, № 4. С. 19-24. DOI: https://doi. org/10.20914/2310-1202-2018-4-19-24
2. Zhang C., Zhang Y., Li H., Liu X. The potential of proteins, hydro-lysates and peptides as growth factors for Lactobacillus and Bifidobacterium': current research and future perspectives // Food Funct. 2020. 16. Vol. 11, N 3. P. 1946-1957. DOI: https://doi.org/10.1039/c9fo02961c
3. Gao P.P., Liu H.Q., Ye Z.W., Zheng Q.W., Zou Y., Wei T. et al. The beneficial potential of protein hydrolysates as prebiotic for probiotics 17. and its biological activity: a review // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2023.
Vol. 9. P. 1-13. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2023.2260467
4. Харитонов Д.В., Харитонова И.В., Просеков А.Ю. Разработка концепции создания синбиотиков и синбиотических молочных продуктов // Техника и технология пищевых производств. 2013. 18. Т. 31, № 4. С. 91-94.
5. Wang H., Huang T., Liu K., Yu J., Yao G., Zhang W. et al. Protective effects of whey protein hydrolysate on Bifidobacterium animalis ssp. lactis Probio-M8 during freeze-drying and storage // J. Dairy Sci. 2022.
Vol. 105, N 9. P. 7308-7321. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-21546 19.
6. Крумликов В.Ю., Остроумов Л.А., Сухих С.А., Кригер О.В. Подбор параметров стабилизации (замораживание и сушка) симбио-тического консорциума с целью получения закваски прямого внесения // Техника и технология пищевых производств. 2016.
Т. 42, № 3. С. 25-30. 20.
7. Раскошная Т.А., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Бегунова А.В. Разработка питательной среды и режимов культивирования Lactobacillus reuteri для получения бактериального концентрата // Техника и технология пищевых производств. 2016. Т. 42, № 3. 21. С. 56-62.
8. Yu Y.-J., Amorim M., Marques C., Calhau C., Pintado M. Effects of whey peptide extract on the growth of probiotics and gut microbiota //
J. Funct. Foods. 2016. Vol. 21. P. 507-516. DOI: https://doi. 22. org/10.1016/j.jff.2015.10.035
9. Семенихина В.Ф., Раскошная Т.А., Рожкова И.В., Бегунова А.В., Ширшова Т.И. Разработка технологического процесса полу- 23. чения бактериального концентрата Lactobacillus reuteri // Вестник ОрелГАУ 2016. № 5 (62). С. 86-93.
10. Мельникова Е.И., Богданова Е.В. Оценка кинетических пара- 24. метров протеолиза сывороточных белков в УФ-концентрате подсырной сыворотки // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2020. Т. 82, № 4.
С. 107-112. DOI: https://doi.org/10.20914/2310-1202-2020-4-107-112
11. Sereda A.S., Kostyleva E.V., Velikoretskaya I.A., Tsurikova N.V. Whey 25. proteins hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2022. Vol. 1052. Article ID 012045. DOI: https:// doi.org/10.1088/1755-1315/1052/1/012045
12. Shah N.P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods // J. Dairy Sci. 2000. Vol. 83, N 4. P. 894-907. DOI: https:// doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(00)74953-8 26.
13. Утебаева А.А., Бурмасова М.А., Сысоева М.А. Перспективы использования бифидобактерий в продуктах функционального питания и лекарственных средствах // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, № 4. С. 100-109. 27. DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2016-6-4-100-109
14. Суховская И.В., Борвинская Е.В., Смирнов Л.П., Немова Н.Н. Сравнительныйанализметодовопределенияконцентрациибелка спектрофотометрии в диапазоне 200-220 нм и по Бредфорд //
Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2010. № 2. С. 68-71.
Морозова А.Н., Головнева Н.А., Рябая Н.Е., Сафонова М.Е. Галактозидазы Bifidobacterium longum БИМ в-813Д с транс-гликозилирующей активностью // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2021. № 2. С. 61-68. DOI: https://doi.org/10.11134/ btp.2.2021.5
Горбатова К.К., Гунькова П.И. Биохимия молока и молочных продуктов : учебник. 5-е изд., испр. и доп. Санкт-Петербург : ГИОРД, 2021. 336 с. ISBN: 976-5-98879-219-2. Zhang K., Liu S., Liang S., Xiang F., Wang X., Lian H. et al. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: Structure, biological activity, structure-activity relationship, and application in the food industry: a review // Int. J. Biol. Macromol. 2024. Vol. 257, pt 2. Article ID 128733. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128733 Захарова Ю.В., Леванова Л.А., Отдушкина Л.Ю. Фундаментальные и прикладные аспекты исследования экзополисахаридов бифидобактерий // Фундаментальная и клиническая медицина. 2021. Т. 6, № 1. С. 53-59. DOI: https://doi.org/10.23946/2500-0764-2021-6-1-53-59
Rajoka M.S.R., Wu Y., Mehwish H.M., Bansal M., Zhao L. Lacto-bacillus exopolysaccharides: new perspectives on engineering strategies, physiochemical functions, and immunomodulatory effects on host health // Trends Food Sci. Technol. 2020. Vol. 103. P. 36-48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2020.06.003
Castro-Bravo N., Margolles A., Wells J., Ruas-Madiedo P. Exopolysac-charides synthesized by Bifidobacterium animalis subsp. lactis interact with TLR4 in intestinal epithelial cells // Anaerobe. 2019. Vol. 56. P. 98-101. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2019.02.014 Castro-Bravo N., Wells J.M., Margolles A., Ruas-Madiedo P. Interactions of surface exopolysaccharides from Bifidobacterium and Lacto-bacilus within the intestinal environment // Front. Microbiol. 2018. Vol. 9. Р. 2426. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02426 Deeth H., Bansal N. Whey proteins: an overview // Whey Proteins: from Milk to Medicine. San Diego : Academic Press, 2019. P. 1-50. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812124-5.00001-1 Guo M., Wang C. Chemistry of whey proteins // Whey Protein Production, Chemistry, Functionality, and Applications / ed. M. Guo. Wiley, 2019. P. 39-65. DOI: https://doi.org/10.1002/9781119256052.ch3 Несчисляев В.А., Мокин П.А., Орлова Е.В., Маслов Ю.Н., Савина А.С. Кислотообразование и кислотоустойчивость проби-отиков // Медико-фармацевтический журнал «Пульс». 2020. Т. 22, № 12. С. 34-38. DOI: https://doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-12-34-38
Бегунова А.В., Рожкова И.В., Зверева Е.А., Глазунова О.А., Федорова Т.В. Молочнокислые и пропионовокислые бактерии: формирование сообщества для получения функциональных продуктов с бифидогенными и гипотензивными свойствами // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. T. 55, № 6. С. 566-577. DOI: https://doi.org/10.1134/S0555109919060047 Беркли Р., Бок Э., Бун Д. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита, Дж. Стейли, С. Уилльямса ; пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. 9-е изд. Москва : Мир. 1997. 429 с. ISBN: 5-03-00310-3. Занданова Т.Н. Выбор криопротекторов для замораживания бактериального концентрата симбиотической закваски // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. 2021. № 3. С. 163-168. DOI: https://doi.org/10.36718/1819-4036-2021-3-163-168
References
1. Poymanov V.V., Grishanova D.S., Antipov S.T. Investigation of the processes of freezing and freeze-drying of bacterial concentrates for the dairy industry. Vestnik VGUIT [Proceedings of the Voronezh State University of Engineering Technologies]. 2018; 80 (4): 19—24. DOI: https://doi.org/10.20914/2310-1202-2018-4-19-24 (in Russian)
2. Zhang C., Zhang Y., Li H., Liu X. The potential of proteins, hydrolysates and peptides as growth factors for Lactobacillus and Bifidobacte-
rium: current research and future perspectives. Food Funct. 2020; 11 (3): 1946-57. DOI: https://doi.org/10.1039/c9fo02961c
3. Gao P.P., Liu H.Q., Ye Z.W., Zheng Q.W., Zou Y., Wei T., et al. The beneficial potential of protein hydrolysates as prebiotic for probiotics and its biological activity: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 2023; 9: 1-13. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2023.2260467
4. Kharitonov D.V., Kharitonova I.V., Prosekov A.Yu. The concept of synbiotics and synbiotic dairy products development. Tekhnika i tekh-
nologiya pischevykh proizvodstv [Technique and Technology of Food Production]. 2013; 31 (4): 91-4. (in Russian)
5. Wang H., Huang T., Liu K., Yu J., Yao G., Zhang W., et al. Protective 16. effects of whey protein hydrolysate on Bifidobacterium animalis ssp. lactis Probio-M8 during freeze-drying and storage. J Dairy Sci. 2022; 105 (9): 7308-21. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-21546 17.
6. Krumlikov V.Yu., Ostroumov L.A., Sukhikh S.A., Kriger O.V. Selection of stabilization benchmarks (freezing and drying) of the symbiotic consortium with the purpose of producing the starter of direct application. Tekhnika i tekhnologiya pischevykh proizvodstv [Technique and Technology of Food Production]. 2016; 42 (3): 25-30. (in Russian) 18.
7. Raskoshnaya T.A., Semenikhina V.F., Rozhkova I.V., Begunova A.V. Development of nutrient medium and cultivation regimes of Lacto-bacillus reuteri for bacterial concentrate production. Tekhnika i tekh-nologiya pischevykh proizvodstv [Technique and Technology of Food 19. Production]. 2016; 42 (3): 56-62. (in Russian)
8. Yu Y.-J., Amorim M., Marques C., Calhau C., Pintado M. Effects of whey peptide extract on the growth of probiotics and gut micro-biota. J Funct Foods. 2016; 21: 507-16. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jff.2015.10.035 20.
9. Semenikhina V.F., Raskoshnaya T.A., Rozhkova I.V., Begunova A.V., Shirshova T.I. Development of the technological process of Lacto-bacillus reuteri bacterial concentrate production. Vestnik OrelGAU [Bulletin of OrelSAU]. 2016; 5 (62): 86-93. (in Russian) 21.
10. Mel'nikova E.I., Bogdanova E.V. Estimation of the kinetic parameters of whey proteins proteolysis in the UF-concentrate of cheese whey. Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta inzhen-ernykh tekhnologiy [Bulletin of the Voronezh State University of 22. Engineering Technologies]. 2020; 82 (4): 107-12. DOI: https://doi. org/10.20914/2310-1202-2020-4-107-112 (in Russian)
11. Sereda A.S., Kostyleva E.V., Velikoretskaya I.A., Tsurikova N.V. Whey 23. proteins hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme. IOP Conf Ser Earth Environ Sci. 2022; 1052: 012045. DOI: https://doi.org/10.1088/1755-1315/1052/1/012045 24.
12. Shah N.P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. J Dairy Sci. 2000; 83 (4): 894-907. DOI: https://doi. org/10.3168/jds.S0022-0302(00)74953-8
13. Utebaeva A.A., Burmasova M.A., Sysoeva M.A. Prospects of using bifidobacterium in functional food products and medicines. Izvestiya 25. vuzov. Prikladnaya khimiya i biotekhnologiya [Proceedings of Higher Educational Institutions. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016;
6 (4): 100-9. DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2016-6-4-100-109 (in Russian)
14. Sukhovskaya I.V., Borvinskaya E.V., Smirnov L.P., Nemova N.N. Comparative analysis of the methods for determination of protein 26. concentration - spectrophotometry in the 200-220 nm range and
the Bradford protein assay. Trudy Karel'skogo nauchnogo tsentra Rossiyskoy akademii nauk [Proceedings of the Karelian Scientific Center of the Russian Academy of Sciences]. 2010; (2): 68-71. (in Rus- 27. sian)
15. Morozova A.N., Golovneva N.A., Ryabaya N.E., Safonova M.E. Galactosidases of strain Bifidobacterium longum BIM B-813D with transglycosylating activity. Eurasian Journal of Applied Biotech-
nology. 2021; (2): 61-8. DOI: https://doi.org/10.11134/btp.2.2021.5 (in Russian
Gorbatova K.K., Gun'kova P.I. Biochemistry of milk and dairy products: textbook. 5th ed., corrected and additional. Saint Petersburg: GIORD, 2021: 336 p. ISBN: 976-5-98879-219-2. (in Russian) Zhang K., Liu S., Liang S., Xiang F., Wang X., Lian H., et al. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: Structure, biological activity, structure-activity relationship, and application in the food industry: a review. Int J Biol Macromol. 2024; 257 (pt 2): 128733. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128733
Zakharova Yu.V., Levanova L.A., Otdushkina L.Yu. Bifidobacterial exopolysaccharides: a brief review. Fundamental'naya i klinicheskaya meditsina [Fundamental and Clinical Medicine]. 2021; 6 (1): 53-9. DOI: https://doi.org/10.23946/2500-0764-2021-6-1-53-59 (in Russian) Rajoka M.S.R., Wu Y., Mehwish H.M., Bansal M., Zhao L. Lactoba-cillus exopolysaccharides: new perspectives on engineering strategies, physiochemical functions, and immunomodulatory effects on host health. Trends Food Sci Technol. 2020; 103: 36-48. DOI: https://doi. org/10.1016/j.tifs.2020.06.003
Castro-Bravo N., Margolles A., Wells J., Ruas-Madiedo P. Exopolysac-charides synthesized by Bifidobacterium animalis subsp. lactis interact with TLR4 in intestinal epithelial cells. Anaerobe. 2019; 56: 98-101. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2019.02.014 Castro-Bravo N., Wells J.M., Margolles A., Ruas-Madiedo P. Interactions of surface exopolysaccharides from Bifidobacterium and Lacto-bacilus within the intestinal environment. Front Microbiol. 2018; 9.:2426. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02426 Deeth H., Bansal N. Whey proteins: an overview. In: Whey Proteins: from Milk to Medicine. San Diego: Academic Press, 2019: 1-50. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812124-5.00001-1 Guo M., Wang C. Chemistry of whey proteins. In: M. Guo (ed.). Whey Protein Production, Chemistry, Functionality, and Applications. Wiley, 2019: 39-65. DOI: https://doi.org/10.1002/9781119256052.ch3 Neschislyaev V.A., Mokin P.A., Orlova E.V., Maslov Y.N., Savina A.S. Acid receiving and acid resistance of probiotics. Mediko-farmat-sevticheskiy zhurnal «Pul's» [Medical and Pharmaceutical Journal «Pulse»]. 2020; 22 (12). 34-8. DOI: https://doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-12-34-38 (in Russian)
Begunova A.V., Rozhkova I.V., Zvereva E.A., Glazunova O.A., Fedorova T.V. Lactic and propionic acid bacteria: The formation of a community for the production of functional products with bifidogenic and hypo-tensitive properties. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2019; 55 (6): 566-77. DOI: https:// doi.org/10.1134/S0555109919060047 (in Russian) Berkeley R., Bock E., Boone D., et al. Identifier of Burgee's bacteria. In 2 vols. Eds. by J. Hoult, N. Krieg, P. Smith, J. Staley, S. Williams; transl. from Engl.; G.A. Zavarzin (ed.). 9th ed. Moscow: Mir. 1997: 429 p. ISBN: 5-03-00310-3. (in Russian)
Zandanova T.N. Cryoprotectors selection to freeze bacterial concentrate of symbiotic starter. Vestnik Krasnoyarskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Bulletin of Krasnoyarsk State Agrarian University]. 2021; (3): 163-8. DOI: https://doi.org/10.36718/1819-4036-2021-3-163-168 (in Russian)
