CC BY
1010
© Лябин М.П., Семенов П.С., 2011
УДК 663/66 ББК 36-9
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНА
М.П. Лябин, П.С. Семенов
Рассмотрены основные области применения хитозана. Показана возможность получения биополимера новым «мягким» способом.
Ключевые слова: хитин, хитозан, медицина, биотехнология, биоинженерия, получение, де-ацетилирование.
Хитозан - вещество XXI в., природный полисахарид, находящий широкое применение в различных областях народного хозяйства. Если в 1994 г. в мире производилось только 1 000 т хитозана, из которых 800 т - в Японии, то сегодня мировой оборот его производства составляет 150-200 тыс. т в год. Лидерами в производстве хитозана являются такие страны, как Китай, Малайзия, Польша и США.
Исследованиями хитозана занимаются более чем в 15 странах, и в настоящее время известно более 70 направлений его практического применения, наиболее важными из которых во всем мире признаны:
1. Пищевая промышленность - в качестве загустителя и структурообразователей для продуктов диетического питания, способствующих выведению радионуклидов из организма; для создания простых и многокомпонентных эмульсий, соусов, паст, осветления пива, соков, вин; в качестве, как консерванта, так и интенсифицикатора запаха и вкуса.
Бактерицидное [13] действие хитозана позволяет использовать его в изготовлении пленок для хранения различных видов пищевой продукции. Наиболее широко известно защитное действие пленок из хитозана, нанесенных на поверхность плодов и овощей - яблок, апельсинов, земляники, томатов, перца. Поскольку плоды и овощи остаются живым
организмом, будучи отделенными от материнского растения, они обладают определенным иммунитетом и в них проходят обменные процессы. Однородные, гибкие, не дающие трещин хитозановые пленки обладают избирательной проницаемостью, поэтому на поверхности плодов и овощей играют роль микробного фильтра и/или регулируют состав газов у поверхности и в толще тканей, влияя тем самым на активность и тип дыхания, что в целом способствует продлению сроков хранения растительного сырья. Помимо этого покрытие из хитозана вызывает некоторые морфологические изменения в возбудителях порчи томатов и перца. Считается, что пленка хи-тозана, способствующая продлению срока хранения мороженого тунца, играет роль барьера, регулирующего проникновение кислорода воздуха и испарение воды.
Хитозан, присутствуя в составе пищевых продуктов, положительно влияет на их биологическую ценность. Кроме того, хитозан относится к диетическим волокнам, которые не усваиваются организмом человека, а в кислой среде желудка образует раствор высокой вязкости. Как компонент пищи или как лечебно-профилактический препарат хитозан проявляет свойства энтеросорбента, иммуномодулятора, антисклеротического и антиартроз-ного фактора, регулятора кислотности желудочного сока, ингибитора пепсина и др. [6].
2. Медицина - для лечения ран, ожогов, язв, производства хирургических нитей, искусственной кожи, лекарственных форм антисклеротического, антикоагулянтного и антиартроз-
ного действия, диагностики и лечения различного вида опухолей, язвы желудка; хитозан улучшает всасывание и эффективность труднорастворимых лекарственных форм, способствующих их пролонгированному действию; эффективен хитозан при лечении парадонтоза и кариеса зубов; в качестве средства борьбы с ожирением, связывания и выведения из организма холестерина, профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
3. Косметика - использование в качестве увлажнителя, эмульгатора, антистатика и смягчающего средства для ухода за волосами и кожей лица, при производстве шампуней, гелей, увлажняющих кремов [5], тональной жидкой пудры, зубных паст, в роли стабилизатора аромата духов.
4. Сельское хозяйство - в качестве биостимулятора, обеспечивающего повышение урожайности овощей на 25-40 %, средства борьбы с нематодами почв в закрытом грунте, стеблевой и корневой гнилью, ржавчиной; специальных покрытий для фруктов, увеличивающих их сроки хранения, кормовой добавки, повышающей резистентность животных к инфекционным заболеваниям и обогащающей корма.
5. Биотехнология и экология - очистка сточных вод от белковых, нефтяных, жировых и других загрязнений, иммобилизация ферментов, сорбция тяжелых металлов и радионуклидов, добавка при производстве стиральных порошков.
Помимо перечисленного, хитозан используют при изготовлении ткани [2; 4] для нижнего белья и носков, а в фотографических процессах, связанных с быстрым проявлением изображения, применяют такие важные характеристики хитозана, как его пленкообразующие свойства, поведение в системах, содержащих желатин и комплексы серебра, обеспечивающее отсутствие поперечной (в
слоях пленки) диффузии красителя, оптические характеристики полимера.
Весьма перспективно использование хитозана в бумажной промышленности: благодаря большей прочности при водных обработках ионных связей, образующихся при нанесении хитозана на целлюлозное волокно при формировании бумаги, по сравнению с существующими в обычной бумаге водородными связями, заметно возрастает прочность бумажного листа, особенно в мокром состоянии. При этом одновременно улучшаются и другие важные свойства - сопротивление продав-ливанию, излому, стабильность изображения.
Такие неоспоримые достоинства хитоза-на, как биосовместимость с альгинатами, фосфатами, в частности глицерофосфатом натрия, гиалоурановой кислотой, кальцием, физиологическая активность при отсутствии токсичности, совершенная безопасность для человека и экологическая чистота (биодеструкция), низкая иммуногенность, способность к пленко-, волокно- и гелеобразованию, высокая сорбционная емкость, умеренная цитостати-ческая активность в отношении бактерий, грибов и атипичных клеток, позволяют широко использовать его в биоинженерии для моделирования различный тканей, в том числе и хрящевой [9; 10; 14].
Как известно, основным источником при промышленном получении хитозана служит хитин, являющийся основой наружного скелета ракообразных, кутикулы насекомых, клеточной стенки грибов и некоторых бактерий.
По химической структуре хитин является линейным аминополисахаридом, цепь которого состоит из ^ацетил-2-амино-2-дезо-киси-О-гликопиранозных звеньев [3] (рис. 1).
Хитин как нерастворимый полимер не поддается выделению из панциря напрямую. Для его получения необходимо последовательное полное, комплексное удаление белковой и
минеральной составляющих панциря. В настоящее время известно несколько способов, относящихся к химической группе извлечения хитина из панцирьсодержащего сырья. В большинстве этих способов операции депротеини-зации и деминерализации включают обработку измельченных панцирей растворами соляной кислоты и едкого натра с последующей промывкой водой. После этого проводится удаление с помощью отбеливающих реагентов красящих пигментов и промывка спиртом и эфиром липофильных веществ. К основным недостаткам большинства способов извлечения хитина относится необходимость использования специального, коррозионно-стойкого дорогостоящего (предпочтительно изготовленного из титана) оборудования, использование больших объемов подготовленной воды для отмывки сырья, применение в технологической схеме и последующая утилизация отработанной едкой щелочи и органических растворителей. Помимо вышеперечисленного, традиционные методы очистки хитина уже на ранних стадиях обработки сырья приводят к разрушению полимерных цепей, что ограничивает области его использования, особенно в качестве биоинженерного компонента.
Хорошо известно, что основным масштабным источником панцирьсодержащего сырья являются камчатские крабы. Принимая во внимание ценность, уникальность и широкую сферу практического использования этого продукта, представляется актуальным изыскание иных доступных сырьевых ресурсов.
Учитывая вышесказанное, предложено извлекать хитозан из доступного сырья панцирей ракообразных рода Pandalus с использованием модифицированной нами схемы, применяемой ранее для плесневых грибов рода Aspergillum.
Мягкие щадящие условия предложенного метода позволяют использовать реакторы для неагрессивных и слабоагрессивных сред, а также исключают необходимость дополнительной очистки сточных вод. Вывод из цикла органических растворителей способствует повышению пожарной безопасности и снижению токсичности процесса.
Для лучшего сохранения нативной структуры биополимера строго соблюдалось поддержание оптимального температурного режима на стадии депротеинирования не более 70 °С, на стадии деминерализации не более 20 °С. Как показал опыт, наиболее предпочтительно - 4 °С, но это ведет к значительному увеличению продолжительности процесса.
Так как практически нерастворимый хитин не нашел широкого применения в какой-либо отрасли промышленности, наибольший практический интерес представляет его производное - хитозан, хорошо растворимый в разбавленных органических кислотах, в частности в водном растворе уксусной кислоты.
Хитозан (II) является р-(1-4)-2-амино-2дезокси^-гликополисахаридом, содержащим, как правило, 5-15 % ацетамидных групп, а также до 1 % групп, соединенных с аминокислотами и пептидами [12]. Из хитина (I) данный биополимер получается в результате удаления ацетильной группы из положения С2 действием раствором щелочи путем полиме-раналогичных превращений (рис. 2).
Протекание процесса затруднительно, потому что трансрасположение в элементарном звене макромолекулы хитина заместителей (ацетамидной и гидроксильной групп) у С2 и С3 обусловливает значительную гидролитическую устойчивость ацетамидных групп, в том числе и в условиях щелочного гидролиза.
Поэтому отщепление ацетамидных групп удается, как правило, осуществить лишь в
CH3
CO
I
NH
+NaOH
-CH3COONa
CO
I
CH3
(I) (II)
Рис. 2. Схема реакции получения хитозана из хитина
O
O
NH
сравнительно жестких условиях - при обработке 40-49%-м водным раствором NaOH при температуре 110-140 °С в течение 4-6 часов [9; 11].
Реакция деацетилирования сопровождается одновременным разрывом гликозидных связей полимера, то есть уменьшением молекулярной массы, изменением надмолекулярной структуры, степенью кристалличности, снижением его вязкости и т. д. [1; 8; 12].
Для сохранения молекулярной массы полимера предпочтительно снижать температуру обработки хитина [7].
Измельчение хитина облегчает доступ деацетилирующего агента внутрь структуры, благодаря чему достигается равномерное протекание процесса деацетилирования и сопровождающей его деструкции [9]. При использовании слишком крупных частиц хитина данный процесс проходит не в полной мере, поверхностные слои таких частиц деацетили-рованы в большей степени, чем внутренние. При последующем растворении в уксусной кислоте эти поверхностные слои образуют раствор, а внутренние слои частиц, не полностью деацетилированные, только набухают. Такой неоднородный хитозан может иметь ограниченное применение. В случае достаточно тонкого измельчения хитина все слои частиц деацетилируются в одинаковой степени, что приводит к получению более однородного продукта.
Также хорошо известно, что наличие кислорода в среде, в которой проводится реакция деацетилирования, увеличивает степень деструкции хитина, поэтому кислород из зоны реакции необходимо удалять.
При сушке готового продукта в условиях высоких температур (более 50 °C), а также в результате длительного хранения хито-зана возможно его уплотнение, потемнение и снижение растворимости, что отрицательно сказывается на потребительских свойствах.
Результаты органолептических и физико-химических испытаний (см. таблицу) сви-
детельствуют о соответствии качества полученного хитозана по определенным параметрам, нормам технических условий на хи-тозан пищевой, что показывает возможность получения продукта по предложенному нами способу, перспективность его дальнейшей разработки.
Как мы полагаем, для получения хитоза-на со структурой, наиболее близкой к природной, следует подобрать еще более мягкие условия проведения процесса получения хитина, возможно, в условиях ферментативного катализа и обеспечивать перемешивание реакционной массы на стадии его деацетилирования.
Экспериментальная часть
Процесс депротеинирования проводился на предварительно отсортированном и промытом сырье. В качестве депротеинирующего реагента применялся 10 %-й раствор натрия бикарбоната в присутствии катионных и анионных ПАВ, обладающих депигментирующим и обезжиривающим свойствами, что исключает применение агрессивных и токсических реагентов: раствора концентрированной щелочи, перекисных соединений и органических растворителей. Максимально щадящее воздействие на полимер предотвращает его деградацию и исключает развитие вторичной пигментации готового продукта.
Стадия деминерализации проводилась
0,1 M раствором НС1. По окончании процесса полимер подвергался тщательной многократной промывке дистиллированной водой на воронке Бюхнера, отжиму и сушке.
Процесс деацетилирования предварительно измельченного до размеров 1-2 х 2-3 мм хитина проводили в двугорлом реакторе, снабженном термометром и подключенном к водоструйному насосу, в 40%-м растворе NaOH (при соотношении к хитозану 1 : 20) при 100 °С в течение 1-2 ч.
Готовый продукт многократно промывали дистиллированной водой на воронке Бюхне-
Физико-химические свойства хитозана
Наименование показателя Ед. изм. Норма по ТУ Результаты испытаний
Массовая доля влаги % Не более 10,0 9,40
рН 1%-го раствора хитозана в 2%-й уксусной кислоте Ед. рН Не более 7,5 З,85
ра до нейтрального значения рН. Промытый хитозан представляет собой сильно гидратированный, набухший продукт с содержанием воды более 70 %. Для предотвращения ороговения хитозан сушился в термошкафу при 5055 °С до постоянного значения массы.
Состав полученного хитозана из панциря ракообразных рода Pandalus определяли методом элементного анализа. В результате проведения анализа содержание азота составило 8,6 %, водорода - 6,46 %, углерода -43,8 %, кислорода - 40,9 %.
Для оценки уровня качества полученного хитозана были использованы показатели, заложенные в технические условия на пищевой хитозан (ТУ 9289-067-00472124-03). Органолептические показатели:
Внешний вид: чешуйки размером 1-3 мм.
Цвет: белый с кремовым оттенком.
Вкус: свойственный данному продукту, без постороннего привкуса.
Запах: свойственный данному продукту, без постороннего запаха.
Измерение среды раствора продукта в уксусной кислоте проводили на рН-метре марки рН-150 МИ.
Массовую долю влаги определяли путем сушки продукта в вакууме при температуре 100-105 °С до постоянной массы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Быкова, В. М. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана: Хитин, его строение и свойства / В. М. Быкова, С. В. Немцев // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. -М. : Наука, 2002. - С. 7-23.
2. Волокнистые, пленочные и пористые материалы на основе хитозана / Е.Л. Илларионова [и др.] // Химические волокна. - 1995. - № 6. - С. 18-22.
3. Гальбрайх, Л. С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение / Л. С. Гальбрайх // Со-
ровский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7, № 1. - С. 51-56.
4. Гальбрайх, Л. С. Модифицированные волокнистые и пленочные материалы / Л. С. Г альбрайх // Химические волокна. - 2005. - № 5. - С. 21-27.
5. Исследование композиций целлюлоза-хи-тозан. Твердофазная модификация, реология, пленки / Г. А. Вихорева [и др.] // Химические волокна. -2000. - № 6. - С. 14-18.
6. Кильдеева, Н. Р. Получение материалов медицинского назначения из растворов биосовме-стимых полимеров / Н. Р. Кильдеева, Л. С. Гальб-райх, Г. А. Вихорева // Химические волокна. -2005.- № 6. - С. 21-24.
7. Общая химическая технология / под ред. И. П. Мухленова. - М. : Высш. шк., 1984. - 255 с.
8. Пат. 2116314 Российская Федерация, МПК 6 С08 В37/08. Способ получения хитозана / Г. И. Касьянов, О. И. Квасенков, А. И. Николаев, Е. Е. Касьянова. - №97104789/04 ; заяв. 26.03.97 ; опубл. 27.07.98 // Изобретения. - 1998. - № 21. - 220 с.
9. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. - М. : Наука, 2002. - 368 с.
10. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action / E. Rabea, M. Badawy, C. Stevens,
G. Smagghe [et al.] // Biomacromol. - 2003. - Vol. 4, № l. - P. 14-57.
11. ChitosanPreparation from Persian GulfShrimp Shells and Investigating the Effect of Time on the Degree of Deacetylation / M. Shahabi Viarsaghl, M. Janmaleki,
H. Reza Falahatpisheh1, J. Masoumi // Journal of Paramedical Sciences (JPS). - 2009. - Vol. 1. - P. 2-7.
12. Hoemann, C. Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesive chitosan-based cell-delivery vehicle / C. Hoemann, J. Sun, A. Le’gare // Osteoarthritis Cartil. - 2005. - Vol. 13. - P. 318-329.
13. Kyung, W. K. Antimicrobial activity of native chitosan, degraded chitosan-carboxymethylated chitosan / W. K. Kyung, R. I. Thomas, L. Chan // Journal of Food Protection. - 2003. - № 66. - P. 1495-1498.
14. Ultrastructure of hybrid chitosan-glycerol phosphate blood clots by environmental scanning electron microscopy / M. Iliescu, C. О. Hoemann, M. S. Shive, A. Chenite // Microsc. Res. Technique. - 2008. - Vol. 71, №3. - P 236-247.
IMPROVED TECHNOLOGY OBTAINING CHITOSAN
M.P. Lyabin, PS. Semenov
The main applications of chitosan. The possibility of obtaining biopolymer new “soft” way.
Key words: chitin, chitosan, medicine, biotechnology, bioengineering, production, deacetylation.
