CC BY
49
и ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
© Коллектив авторов, 2008 УДК: 616.981.51-615.373.3
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННЫХ КРОЛИЧЬИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ КАПСУЛЬНО-СОМАТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК
Е.А. Горобец, Е.Н. Афанасьев, И.С. Тюменцева, Н.Ф. Василенко Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Выделение возбудителя сибирской язвы от больного человека или животного, из объектов окружающей среды и идентификация микроба являются основными тестами при расшифровке этиологии заболевания и установлении факта бактериального обсеменения исследуемого материала.
Несмотря на значительное количество методов усовершенствования лабораторной диагностики сибирской язвы, эта весьма трудная задача до сих пор в достаточной мере не разрешена. В арсенале диагностических средств для экспресс-диагностики возбудителей особо опасных инфекций практически отсутствуют иммунобиологические препараты для одномоментной детекции их биологических форм. При их разработке и производстве необходимо иметь высокоактивные и специфичные иммунные сыворотки. Их получение - это сложный многоэтапный процесс, который зависит от рациональной схемы иммунизации. Под этим понятием подразумевают следующие факторы: физико-химическое состояние антигена, дозы, способы, интервалы и кратность введения антигена, продолжительность цикла иммунизации, которые находятся в тесном взаимодействии.
Целью наших исследований явился поиск оптимального соотношения этих факторов, приводящий к получению сывороток с достаточно высоким титром специфических антител за сравнительно короткий срок при минимальном расходовании антигена и других материалов.
Материал и методы. В качестве продуцентов иммунной сыворотки использовали здоровых кроликов породы “Шиншилла” без различий пола, весом 3 кг в возрасте 9 месяцев. Животных до начала иммунизации выдерживали на карантине 7 суток. Далее пробно брали кровь и отделяли сыворотку, которую проверяли на активность в реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ) с близкородственными микроорганизмами. В работе были использованы штаммы-сапрофи-ты: Bacillus subtilis 37, 168; Bacillus megaterium 6, 654; Bacillus cereus 1312, 250. Животных, сыворотки которых давали положительный результат в РНИФ хотя бы с одной из близкородственных культур в разведении 1:50 и выше, отбраковывали.
Для иммунизации животных-продуцентов нами
были определены два антигена: капсульное вещество и водорастворимый соматический антиген. Оба вида антигена извлекали из вакцинного штамма Bacillus anthracis 71/12 (вакцина Ценковского II), обладающего способностью капсулообразования.
В основу иммунизации была взята схема, предложенная И.С. Тюменцевой с соавт. [7].
Результаты и обсуждение. Капсульное вещество сибиреязвенного микроба является одним из факторов патогенности, образуется, в основном, вирулентными штаммами и, за редким исключением, некоторыми авирулентными штаммами.
Для получения капсульного вещества суточную культуру Bacillus anthracis 71/12 засевали на бикар-бонатный агар Хоттингера рН 7,2 с добавлением 1% нормальной кроличьей сыворотки, помещали в микро-анаэростат, в котором 50% воздуха заменяли углекислотой, инкубировали при температуре 37°С в течение 20 часов. После этого проводили визуальную оценку роста и контроль капсулообразования микроско-пированием. Смывали 2,5% стерильным раствором хлорида натрия, взвесь помещали в колбу с мелкими стеклянными бусами, добавляя для инактивирования 10% раствор формалина и встряхивали на Шуттель-аппарате 7 часов. После проведения контроля общей и специфической стерильности полученную взвесь центрифугировали при 4000 об/мин. Супернатант, содержащий капсульное вещество, осаждали сульфатом аммония.
Осаждение сульфатом аммония приводит к стабилизации белков. Суспензия белкового осадка или кристаллов в 2-4 М растворе сульфата аммония стабильна в течение многих лет. Это обычный метод хранения коммерческих препаратов [6].
В нашей работе мы использовали метод двойного осаждения при 80% насыщении сульфатом аммония. Высаливание проводили при комнатной температуре, для формирования осадка и стабилизации белка раствор оставляли на ночь при температуре 2-8°С. Этап фильтрования полученного раствора через бумажные фильтры, имеющий множество недостатков, мы заменили методом центрифугирования. Одним из них является то, что процесс фильтрации более длительный по времени. Большинство биологических материалов дают обильные и рыхлые осадки, которые быстро за-
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА, № 1, 2008
Таблица
Схема иммунизации животных для получения иммунной капсульно-соматической
сибиреязвенной сыворотки
Интервал между инъекциями (сутки) Вид антигена, его концентрация (мг/мл) Область введения Способ введения Иммуномодуля- торы, количество (мг), способ введения
Цикл № № инъекции капсульное вещество водорастворимый соматический антиген капсульное вещество водорастворимый соматический антиген капсульное вещество водорастворимый соматический антиген тималин н я -е о о ф о ик ц
1 - 1,0 - ухо - в/в - 5 (в/м) -
2 3 1,25 - ухо - в/в - 5 (в/м) -
Грундим- мунизация 3 3 1,5 - ухо - в/в - 5 (в/м) 100 (в/м)
4 3 2,0 - ухо - в/в - 5 (в/м) -
5 3 3,0 - ухо - в/в - 5 (в/м) -
Отдых 15±5
6 - 3,0 3,0 ухо бедро в/в л/у 5 (в/м) -
Основной цикл 7 3 3,0 3,0 ухо бедро в/в в/м 5 (в/м) -
8 3 3,0 3,0 ухо бедро в/в в/м 5 (в/м) -
9 3 3,0 3,0 ухо бедро в/в в/м 5 (в/м) -
10 3 3,0 3,0 ухо бедро в/в в/м 5 (в/м) -
купоривают фильтры, так что вскоре скорость потока резко уменьшается или прекращается совсем. В этой ситуации необходимо заменить фильтровальный материал, а это ведет к потере получаемого препарата. Поэтому метод центрифугирования - это более чистый и совершенный способ отделения белковых и других осадков. Центрифугировали при 4000 об/мин. в течение 30 мин. Осадок растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) рН 7,2 и проводили диализ против водопроводной воды в течение 48 часов, затем против дистиллированной воды в течение 24 часов для удаления избыточного содержания ионов NH+4.
Полученный капсульный антиген разливали в ампулы, лиофилизировали, запаивали и хранили при температуре 2- 8°С.
Для получения и контроля на специфическую активность гипериммунной кроличьей сибиреязвенной капсульно-соматической сыворотки нам необходимо было приготовить водорастворимый соматический антиген и подобрать эффективную методику его извлечения из микробной клетки.
Выделение антигенов микроорганизмов в гомогенном виде для изучения их свойств, иммунизации животных, разработки диагностических препаратов в большинстве случаев осуществляется после перевода антигена в растворимое состояние. Для этого применяют экстракцию водой, солевыми растворами, трихлоруксусной кислотой, фенолом, ацетоном, с помощью кислотного и щелочного гидролизов и т.д. Получаемые при этом экстракты имеют различные физико-химические, биологические и иммунохимические свойства и спектр антигенов. При таком количестве методов нам необходимо было подобрать условия,
обеспечивающие наиболее полное выделение специфического антигена.
Для извлечения антигенных комплексов из микробной клетки существуют различные методы ее разрушения, такие как механические, физические, химические. Наше внимание привлек эффективный ультразвуковой метод. При ультразвуковой дезинтеграции механизм разрушения микробной клетки заключается в процессе образования и захлопывания кавитационных полостей, в результате чередования высоких и низких давлений, разрежений [4]. Под действием ультразвуковых волн наступает разрушение структуры клетки микробов, а изменение химических веществ в них происходит медленнее, что дает возможность получения различных биологических активных комплексов, близких к нативным [3, 5].
На основании этих данных, для извлечения необходимого нам антигена мы сочли целесообразным использовать щадящий режим дезинтеграции клеток микробов с помощью ультразвуковой дезинтеграции (УЗДн 2Т) в сочетании с водно-солевой экстракцией, с последующим осаждением белка [1, 2].
Для получения водорастворимого соматического антигена использовали штамм сибиреязвенного микроба Bacillus anthracis 71/12, выращенный на агаре Хоттингера рН 7,2 при температуре 37°С в течение 24 часов. Обеззараживали биомассу кипячением при температуре 98°С в течение 40 минут. Биомассу осаждали центрифугированием при 16000 об/мин. в течение 30 минут. Экстракцию водорастворимого антигена проводили 2,5% раствором хлористого натрия при температуре 2-8°С в течение 48 часов. Далее биомассу центрифугировали, супернатант (первая порция ан-
И оригинальные исследования. инфекционные болезни
тигена) сливали в чистую посуду, а полученный осадок так же растворяли в 2,5% растворе хлористого натрия в отношении 1:5 и при постоянном охлаждении дезинтегрировали при частоте 44 кГц 20 минут.
Дезинтегрированную биомассу центрифугировали при 6000 об/мин. в течение 45 минут, при этом полученный супернатант (вторая порция антигена) так же собирали отдельно. Осадок после центрифугирования дезинтегрированных клеток растворяли в 2,5% растворе хлористого натрия в отношении 1:2 и при постоянном помешивании на магнитной мешалке оставляли на 1 сутки в холодовой камере. Центрифугировали, осадок удаляли, и объединенный экстракт водорастворимых антигенов подвергали диализу против дистиллированной воды в течение 48 часов для удаления избыточного содержания хлористого натрия при температуре 2-8°С. Полученный антиген разливали в ампулы и лиофилизировали.
Основной цикл иммунизации кроликов состоял из 10 инъекций. Схема иммунизации заключалась в комбинированном внутривенном введении капсульного вещества в возрастающих дозах и внутримышечных инъекциях водорастворимого соматического антигена. В эти же сроки внутримышечно вводили иммуномодуляторы: тималин (по 5 мг) и циклофосфан (в третью инъекцию дополнительно 100 мг). На 20-й день от животных получали по 4 мл иммунной сыворотки, затем добавляли половинные дозы антигена в каждую сыворотку. Полученный комплекс «антиген-антитело» вводили тому же животному, от которого получена иммунная сыворотка. Схема иммунизации представлена в таблице.
При таком способе иммунизации титры специфических антител в бивалентных сыворотках при определении в НИРФ (на вегетативной и капсульной формах) были 1:6400-1:12800 к соматическому антигену и 1:1600-1:3200 к капсульному антигену. Причем на капсульный антиген отвечало 45-50% животных-проду-центов, а на соматический антиген - 100% животных, использованных в опытах.
Заключение. Таким образом, усовершенство-
ванный нами способ получения бивалентной капсульно-соматической иммунной сыворотки позволил увеличить количество животных-продуцентов с производственными титрами к обоим антигенам (с 8-12% до 45-50%) при значительном сокращении сроков иммунизации (от 150-260 суток до 50 суток) и полном отсутствии падежа кроликов.
Кроме того, такая биотехнологическая схема дала возможность использовать оставшуюся часть иммунных сывороток (с низкими титрами к капсульному антигену) в качестве производственного сырья для изготовления сибиреязвенных соматических флуоресцирующих иммуноглобулинов, существенно снизив материальные потери и затраты.
Литература
1. Афанасьев, Е.Н. Антигенная структура бруцелл, сообщение V. Изучение антигенных взаимосвязей бруцелл методом НРИФ / Е.Н. Афанасьев, И.Ф. Таран, И.С. Тю-менцева // Деп. в ВИНИТИ 12.09.86 г. - №6635 - В 86.
2. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Е.Н. Афанасьев. - Ростов, 2000. - 45 с.
3. Григорьева, Г.И. Мембраны и мембранные белки в сравнительной характеристике стафилококков: Автореф. дис. ... канд. биолог. наук / Г.И. Григорьева. - Пущино, 1980. - 19 с.
4. Гуревич, Г.А. Инженерно-физические аспекты и фемено-логия процессов дезинтегрирования микроорганизмов / Г.А. Гуревич, А.А. Кудрявцев, Б.А. Фихте // Дезинтеграция микроорганизмов: Сб. научн. тр. - Пущино, 1972.
- С. 15-51.
5. Ермаченко, В.А. Получение мембранных стафилококков и их ферментативная и белковая характеристика / В.А. Ермаченко, Г.И. Григорьева, ГК. Джемухадзе // Сб. научн. тр.
- Москва, 1978. - 74 с.
6. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс // Перевод с англ. В.К. Антонова. - М: Мир. - 1985.- С. 56-90.
7. Тюменцева, И.С. Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- и поливалентными антигенами / И.С. Тюменцева, Е.В. Жданова // Деп. в ВИНИТИ 04.11.94 г. - №2507 - В 94.
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИя
иммунных кроличьих сибиреязвенных
КАПСУЛЬНО-СОМАТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК
Е.А. ГОРОБЕЦ, Е.Н. АФАНАСЬЕВА,
И.С. ТЮМЕНЦЕВА, Н.Ф. ВАСИЛЕНКО
Разработаны оптимальные параметры извлечения капсульного вещества и водорастворимого соматического антигена из вакцинного штамма Bacillus anthracis 71/12. Усовершенствованный способ получения бивалентной капсульно-соматической иммунной сыворотки позволил увеличить количество животных-продуцентов с производственными титрами к обоим антигенам (с 8-12% до 45-50%) при значительном сокращении сроков иммунизации (от 150-260 суток до 50 суток) и полном отсутствии падежа кроликов. Такая биотехнологическая схема дала возможность использовать оставшуюся часть иммунных сывороток (с низкими титрами к капсульному антигену) в качестве производственного сырья для изготовления сибиреязвенных соматических флуоресцирующих иммуноглобулинов, существенно снизив материальные потери и затраты.
Ключевые слова: Bacillus anthracis, иммунные кроличьи сибиреязвенные капсульно-соматические сыворотки, реакция непрямой иммунофлуоресценции, капсульное вещество, водорастворимый соматический антиген
PERFECTION OF THE RECEPTION WAY OF IMMUNE
RABBIT ANTHRAX CAPSULe-SOMATIC SERUMS
GOROBETS E.A., AFANASIEVA E.N.,
TYUMENTSEVA I.S., VASILENKO N.F.
Optimum parameters of extraction of capsular substances and a water-soluble somatic antigen from vaccine strain Bacillus anthracis 71/12 are developed. The advanced way of reception of bivalent capsule-somatic immune serums has allowed to increase quantity of animals-producers with industrial titers to both antigens (from 8-12% up to 45-50%) at significant reduction of immunization terms (from 150-260 days up to 50 days) and at full absence of a loss of rabbits. Such biotechnological scheme has enabled to use the remained part of immune serums (with low titers to capsule antigen) as industrial raw material for producing of anthrax somatic fluorescent antibodies, essentially having lowered material losses and expenses.
Key words: Bacillus anthracis, immune rabbit anthrax capsule-somatic serums, reaction of indirect immune fluorescence, capsule substance, a water-soluble somatic antigen
