Совершенствование фитопатологического контроля объектов карантинного значения Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 632.913.1

Совершенствование фитопатологического контроля объектов карантинного значения

Ю.Н. ПРИХОДЬКО, Ю.А. ШНЕЙДЕР, Т.С. ЖИВАЕВА, Е.С. МАЗУРИН, Н.А. ШЕРОКОЛАВА, У.Ш. МАГОМЕДОВ, А.И. УСКОВ, Ю.А. ВАРИЦЕВ, Б.В. АНИСИМОВ e-mail: [email protected]

Картофель является одним из основных продуктов питания населения России (132 кг в год при норме 100 кг). По объемам производства картофеля Российская Федерация занимает второе место в мире, уступая лишь Китаю. Однако, при валовом сборе около 30 млн т ежегодно закупается за рубежом порядка 300-500 тыс. т семенного и товарного картофеля.

За последние 10-15 лет в Российскую Федерацию активно ввозились для целей государственного сортоиспытания сорта европейских селекционных учреждений, использующих в течение десятилетий генетические коллекции сортов и диких форм картофеля южноамериканского происхождения. В связи с этим актуальное значение приобретает совершенствование фитопатологического контроля объектов карантинного значения.

Андийский вирус крапчатости картофеля (APMoV) относится к роду Comovirus и впервые был описан Fribourg, Jones, Koenig [3, 5]. APMoV заражает дикие и культурные виды семейства Solanaceae, включая картофель, баклажан и перец. Широко распространен в высокогорных районах Перу, Чили и Эквадора, выявлен также на картофеле в Бразилии и на перце в Гондурасе и Никарагуа.

Вирионы APMoV размером 2527 нм имеют изометрическую симметрию и содержат два белка и две молекулы линейной одноните-

вой РНК. По серологическим свойствам выделены три штамма: APMoV-B, APMoV-C и APMoV-Н [1]. APMoV имеет отдаленное серологическое родство с комовирусами Cowpea mosaic virus (CPMV), Cowpea severe mosaic virus (CPSMV), Bean pod mottle virus (BPMV) и Quail pea mosaic virus (QPMV) [2, 3], но все эти вирусы не заражают картофель.

На большинстве культурных сортов картофеля APMoV вызывает легкую и тяжелую формы крапчатости листьев, а в ряде случаев -некроз верхушек побегов, желтуху и деформации листьев. Вирус распространяется с зараженными клубнями картофеля, при механическом контакте между растениями, а также жуками Diabrotica balteata и D.viridula.

APMoV отличается от большинства других вирусов-паразитов картофеля характерным строением вирио-нов (два вида РНК, два белка) и неспособностью заражать индикаторы Chenopodium quinoa, Ch. amaranti-color и Cucumis sativus.

Андийский латентный вирус картофеля (APLV) относится к роду Timovirus и впервые был выявлен в Колумбии на местных формах картофеля [4]. Способен заражать около 30 видов растений семейств Amarantaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitacеae и Solanaceae, но основными растениями-хозяевами являются различные виды и формы картофеля [4, 2, 3]. Вирус широко распространен в андийских странах: Боливии, Колумбии, Эквадоре и Перу. О выявлении APLV сообщали также из Аргентины, Парагвая и Чили, в особенности на растениях Ullucus tuberosus - местной клубне-

образующей сельскохозяйственной культуры [6].

Частицы APLV имеют изометрическую форму, около 30 нм в диаметре и содержат один белок и одну молекулу линейной однонитевой РНК [4]. По серологическим свойствам APLV подразделяется на три группы штаммов: APLV-Col, APLV-Col-2 (или APLV-ССС) и APLV-Hu [5]. APLV серологически близок к тимовирусу мозаики баклажана (Eggplant mosaic virus = EMV), менее близок к Beladonna mottle tymovirus (BeMV) и Dulcamara mottle tymovirus (DuMV) и имеет отдаленное серологическое родство с большинством других тимовиру-сов. Различные авторы считают APLV либо штаммом EMV, либо валидным видом. Существует также мнение[5], что все тимовирусы, заражающие растения семейства пасленовых, - APLV, BeMV, DuMV, EMV и Physalis mosaic tymovirus фактически являются штаммами одного вируса.

APLV распространяется с зараженными клубнями картофеля, при механическом контакте между растениями и жуками Epitrix sp. Возможна также передача с настоящими семенами картофеля, но с невысокой частотой (обычно до 1 %).

Свое название APLV получил по латентному характеру заражения многих сортов и форм картофеля. Однако у ряда сортов вирус вызывает симптомы мозаики, хлоротической сет-чатости мелких жилок и морщинистости листьев, что особенно характерно для географических зон со значительными различиями дневной и ночной температур воздуха.

APLV имеет следующие основные отличия по биологическим свойствам от других вирусов, заражающих картофель: морфология и размер вирионов; высокая точка температурной инактивации; системное заражение Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor и Nicotiana glutinosa, местное заражение Cucumis sativus, невосприимчивость Phaseolus vulgaris.

Современная диагностика фито-

патогенных вирусов основывается на комплексном использовании серологического (иммуноферментный анализ, иммуноэлектронная микроскопия) и молекулярного (ПЦР-тест, дот-блот-гибридизация) методов. В качестве дополнительных или вспомогательных методов применяются также биотест с растениями-индикаторами и электронная микроскопия, которые для подавляющего большинства вирусов не являются видоспецифичными и позволяют проводить идентификацию лишь на уровне семейства или рода. В соответствии с диагностическими стандартами ЕОКЗР идентификация фи-топатогенных вирусов должна основываться на использовании двух различных методов.

Коммерческие наборы для диагностики APLV и APMoV методом ИФА производятся фирмами «Adgen» (Великобритания), «Agdia» (США), «Bioreba» (Швейцария), DSMZ и «Loewe» (Германия).

За рубежом были расшифрованы последовательности РНК некоторых участков генома (генов РНК-зависимой РНК-полимеразы, репликазы и белка оболочки) нескольких изолятов APMoV и APLV, но до наших исследований ПЦР-тест для выявления этих вирусов не был разработан. Вследствие этого диагностика APMoV и APLV до настоящего времени предполагала использование методов ИФА и растений-индикаторов. Однако биотест с растениями-индикаторами очень длительный по времени (не менее 21 дня после инокуляции индикаторов), поэтому он неприменим для экспрессной карантинной экспертизы и рекомендован для тестирования растений картофеля, содержащихся в интродукционно-каран-тинных питомниках. Оптимальным является использование следующего набора растений-индикаторов: Chenopodium amaranticolor, Ch. quinoa, С. murale, Nicotiana benthamiana, N. bigelovii, N. cle-velandii, N. debneyi, N. hesperis-67A, N. occidentalis-P1 и N. tabacum «White Barley». Биотесты необходи-

мо проводить в специально оборудованных, изолированных, непроницаемых для насекомых теплицах (стандарт ЕОКЗР РМ 3/21(2)) [7].

Эффективность биотестов зависит от источника инокулюма и концентрации в нем вируса, метода инокуляции, штамма вируса, вида и возраста растений-индикаторов, условий их содержания. APLV и APMoV не имеют растений-хозяев со специфической местной реакцией, поэтому индикаторный метод в отдельности недостаточен для их идентификации. Как положительные, так и отрицательные результаты биотестов требуют подтверждения методом ИФА (стандарт ЕОКЗР РМ 3/21(2)).

В 2009 г. в ФГУ «ВНИИКР» при экспертизе ряда образцов картофеля наборами для ИФА фирмы «Adgen» были выявлены растения и клубни с сероположительной реакцией к APLV и APMoV. Такая реакция наблюдалась для различных образцов: микрорастений в культуре in vitro, глазков непророщенных (глазки 0,2-0,4 см) и пророщенных (глазки 1-2 см) клубней, листьев растений, произрастающих в полевых и тепличных условиях. Достаточно высокая частота таких реакций обусловила необходимость установления достоверности результатов иммунодиагностики, то есть проверки качества тест-систем фирмы «Adgen», равно как и испытанных затем тест-систем фирм «Bioreba» и DSMZ.

Как известно, качество тест-систем для ИФА определяется следующими основными параметрами: специфичностью, то есть отсутствием перекрестной реакции с другими (гетерологичными) вирусами; чувствительностью; отсутствием неспецифической реакции с компонентами сока растений; стабильностью реакционных компонентов тест-системы, в первую очередь, коньюга-тов. При этом основополагающим параметром является специфичность.

В лаборатории вирусологии ФГУ «ВНИИКР» была исследована специфичность тест-систем к APLV и APMoV фирм «Adgen», «Bioreba» и

DSMZ путем оценки их реакции с положительными контролями для ИФА к ряду вирусов, наиболее часто заражающих картофель. Для этого были использованы положительные контроли производства ВНИИКХ, «Adgen» и штаммспецифи-ческие положительные контроли к APLV и APMoV фирмы DSMZ. Для сравнения параллельно оценивали реакцию этих тест-систем с отрицательными контролями для ИФА и с соком здоровых растений картофеля. Анализы проводили по инструкциям фирм-производителей диагностических наборов. Результаты регистрировали на микропланшетном анализаторе «Multiskan Ascent» при длине волны 405 нм.

В результате проведенных испытаний установлена сильная серополо-жительная реакция тест-систем к APLV и APMoV фирмы «Adgen» с положительными контролями к вирусам аукубы мозаики картофеля (PAMV), желтой карликовости картофеля (PYDV), скручивания листьев картофеля (PLRV), бронзовости томата (TSWV), некротической пятнистости бальзамина (INSV), Х- (PVX), Y- (PVY), M- (PVM), S- (PVS) вирусам картофеля. Кроме того, тест-система к APLV реагировала с положительным контролем к APMoV (табл. 1).

При проведении других испытаний также отмечена сероположи-тельная реакция тест-систем к APLV и APMoV фирмы «Adgen» с положительным контролем к вирусу Т картофеля (PVT) и слабая сероположи-тельная реакция тест-системы к APLV с положительным контролем к вирусу кольцевой пятнистости табака (TRSV) (табл. 2).

Тест-системы к APLV и APMoV фирмы «Bioreba» в сильной степени реагировали с положительными контролями к вирусам бронзовости томата (TSWV) и некротической пятнистости бальзамина (INSV). Отмечена также положительная реакция антисыворотки к APLV этой фирмы с контролями к PYDV, PAMV, PVX, PLRV, PVY, PVS и PVM, а антисыворотки - к APMoV с контролями к PYDV, PAMV, PVY и PVM (табл. 1).

Таблица 1

Реакция тест-систем к андийскому латентному вирусу картофеля (АР^У) и андийскому вирусу крапчатости картофеля (АРМоУ) фирм «Adgen», «ВюгеЬа» и DSMZ с положительными контролями к ряду вирусов картофеля

и соку здоровых растений картофеля (2009-2010 гг.)

Контроли А405 для тест-систем:

АРМоУ («Adgen») АРМоУ («ВюгеЬа») АРМоУ (DSMZ, АЗ-0005) APLV («Adgen») APLV («ВюгеЬа») APLV (DSMZ, AS-0002)

Положительные контроли

Андийский вирус крапчатости картофеля (АРМоУ), 3,831 (+) 4,507 (+) 4,553 (+) 3,594 (+) 0,016 (-)

гомологичные положительные контроли

Андийский латентный вирус картофеля (APLУ), 0,045 (-) 0,142 (-) 3,941 (+) 4,443 (+) 4,461 (+)

гомологичные положительные контроли

Вирус бронзовости томата (TSWV), «Adgen» 4,069 (+) 2,938 (+) 1,176 (+) 4,404 (+) 3,313 (+) 0,283 (+/-)

Вирус некротической пятнистости бальзамина (1№У), «Adgen» 4,409 (+) 4,489 (+) 4,501 (+) 4,449 (+) 4,483 (+) 4,470 (+)

Вирус желтой карликовости картофеля (PYDV), «Adgen» 3,429 (+) 0,437 (+/- ) 1,542 (+) 3,038 (+) 0,495 (+) 0,597 (+)

Вирус черной кольчатости томата (TBRV), «Adgen» 0,029 (-) 0,101 (-) 0,132 (-) 0,065 (-) 0,163 (-) 0,022 (-)

Вирус аукубы мозаики картофеля (РАМУ), «Adgen» 4,425 (+) 0,288 (+/- ) 0,485 (+/-) 3,426 (+) 0,335 (+/-) 0,032 (-)

Х-вирус картофеля (РУХ), ВНИИКХ 1,829 (+) 0,159 (-) 0,076 (-) 1,829 (+) 0,377 (+/-) 0,070 (-)

Вирус скручивания листьев картофеля (PLRV), ВНИИКХ 1,934 (+) 0,133 (-) 0,091 (-) 1,934 (+) 0,324 (+/-) 0,071 (-)

S-вирус картофеля (PУS), ВНИИКХ 1,837 (+) 0,158 (-) 0,081 (-) 1,837 (+) 0,385 (+/-) 0,071 (-)

Y-вирус картофеля (PУY), ВНИИКХ 2,055 (+) 0,264 (+/- ) 0,082 (-) 2,055 (+) 0,448 (+/-) 0,072 (-)

М-вирус картофеля (РУМ), ВНИИКХ 1,684 (+) 0,229 (+/- ) 0,076 (-) 1,684 (+) 0,319 (+/-) 0,062 (-)

АРМоУ/АРиУ, гомологичные отрицательные контроли Здоровое растение картофеля, 5960-о, растение № 1 Здоровое растение картофеля, 5960-о, растение № 2

Отрицательные контроли

0,057 (-) 0,077 (-) 0,072 (■ 0,096 (-) 0,089 (-) 0,090 (0,076 (-) 0,102 (-) 0,067 (

0,056 0,162 0,137

(-) 0,045 (-) (-) 0,049 (-) (-) 0,055 (-)

0,037 (-) 0,041 (-) 0,042 (-)

Примечание: + сильная сероположительная реакция, соответствующая реакциям тест-систем с гомологичными +/- слабая сероположительная реакция, уступающая реакциям тест-систем с гомологичными патогенами - сероотрицательная реакция.

патогенами

Наиболее высокая специфичность констатирована для тест-систем к APLV (АБ-0002) и АРМс^ (АБ-0005) фирмы DSMZ, которые тем не менее реагировали с положительными контролями к TSWV, INSV и PYDV. Для антисыворотки AS-0005 установлена также положительная реакция с контролем к PAMV (табл. 1).

Эти результаты свидетельствуют о том, что тест-системы ИФА к APMoV и APLV фирм «Ас1деп» и «ВюгеЬа» (последней фирмы - в меньшей степени) недостаточно специфичны и могут давать перекрестные реакции с другими вирусами, заражающими картофель.

В частности, такая реакция наблюдалась у тест-систем к APMoV и APLV фирмы «АСдеп» при тестировании пророщенных клубней картофеля (ростки длиной 2-5 см) из экспериментальной базы «Ильинское» ВНИИКХ, зараженных в различных

Таблица 2

Реакция тест-систем к андийскому латентному вирусу картофеля (APLV) и андийскому вирусу крапчатости картофеля (АРМоУ) фирмы «Adgen» с положительными контролями к ряду вирусов, заражающих картофель (2009-2010 гг.)

Контроли А405 для тест-систем:

АРМоУ APLV

(<Adgen») («Adgen»)

Андийский вирус крапчатости картофеля (АРМоУ) 3,831 (+) 3,594 (+)

Андийский латентный вирус картофеля (APLV) 0,014 (-) 3,941 (+)

Вирус аукубы мозаики картофеля (РАМУ) 4,425 (+) 3,426 (+)

Вирус желтой карликовости картофеля (PYDV) 3,429 (+) 3,038 (+)

Вирус пожелтения картофеля (PYV) 0,020 (-) 0,026 (-)

Т-вирус картофеля (РУТ) 3,563 (+) 4,038 (+)

Вирус черной кольцевой пятнистости томата (TBRV) 0,029 (-) 0,065 (-)

Вирус кольцевой пятнистости табака (TRSV) 0,027 (-) 0,150 (+/-)

Вирус кольцевой пятнистости томата (ToRSV) 0,032 (-) 0,039 (-)

Вирус бронзовости томата (TSWV) 4,069 (+) 4,404 (+)

Вирус некротической пятнистости бальзамина (1^У) 4,409 (+) 4,449 (+)

Вирус желтой курчавости листьев томата (TYLCSV) 0,082 (-) 0,035 (-)

Отрицательный контроль к АРЬУ 0,040 (-) 0,042 (-)

Отрицательный контроль к АРМоУ 0,037 (-) 0,037 (-)

Таблица 3

Реакция тест-систем к АРГУ и APMoV, РУХ, Р^, PVS и PVM с различными образцами растений картофеля, зараженными Х-, Y-, S- и М-вирусами картофеля (15.03.20l0 г.)

№ Образец А405 для тест-систем к вирусам:

APLV («Agden») APMoV («Agden») PVX (ВНИИКХ) PVY (ВНИИКХ) PVS (ВНИИКХ) PVM (ВНИИКХ)

Здоровое растение 0,141 (-) 0,139 (-) 0,055 (-) 0,060 (-) 0,032 (-) 0,065 (-)

Клубни из ЭХ «Ильинское» ВНИИКХ, ростки длиной 2-5 см

Лукьяновский 0,543 (+) 0,377 (+/-) 0,074 (-) 0,546 (+) 0,093 (+/-) 0,102

Ред Скарлет 0,406 (+/-) 0,174 М 0,050 (-) 0,545 (-) 0,029 (-) 0,539 (+)

Памяти Лорха 0,799 (+) 0,559 (+) 0,084 (-) 0,102 (-) 0,092 (+/-) 0,506 (+)

Красавчик 0,370 (+/-) 0,174 (-) 0,514 (+) 0,062 (-) 0,546 (+) 0,078 (-)

Жуковский ранний 0,478 (+/-) 0,182 (-) 0,051 (-) 0,533 (+) 0,042 (-) 0,524 (+)

Никульский 0,630 (+) 0,377 (+/-) 0,515 (+) 0,083 (-) 0,126 (+/-) 0,529 (+)

Удача 0,421 (+/-) 0,212 (-) 0,066 (-) 0,522 (+) 0,041 (-) 0,538 (+)

Брянский деликатес 0,488 (+/-) 0,216 (-) 0,064 (-) 0,062 (-) 0,094 (+/-) 0,525 (+)

Брянский надежный 0,448 (+/-) 0,184 (-) 0,052 (-) 0,050 (-) 0,099 (+/-) 0,535 (+)

Отрицательный контроль 0,137 0,099 0,055 0,050 0,030 0,060

Положительный контроль 4,321 4,319 0,522 0,532 0,586 0,549

сочетаниях PVX, PVY, PVS и PVM (табл. 3). При тестировании этих клубней тест-системами фирм «ВюгеЬа» и DSMZ сероположитель-ной реакции не наблюдали. Проведенный ПЦР-тест также не выявил присутствие АРМс^ и APLV.

В других экспериментах было установлено, что тест-системы для ИФА к APMoV и APLV фирмы «Ас1деп» неспецифически реагируют также с компонентами экстрактов сока из кожицы клубней картофеля. Все образцы картофеля различного происхождения (сорта, окраска клубней) имели более высокие значения эк-стинкции при анализе тканей, содержащих кожицу, чем при анализе одних глазков (табл. 4). Несомненно, такая неспецифическая реакция может привести к получению ложно-положительных результатов. Для корректной интерпретации таких результатов необходим параллель-

ный анализ заведомо зараженных образцов.

В связи с возможностью получения ложноположительных результатов из-за низкого качества тест-систем для ИФА возникает вопрос о необходимости корректировки сроков экспертизы подкарантинного материала клубней картофеля. Согласно международным (Standart PM 3/21(2) Post-entry quarantine for potato, Standart PM 4/21(1) Seed potatoes) и отечественным (ГОСТ 29267-91, ГОСТ 29268-91, ГОСТ 53136-2008) стандартам выявление вирусов необходимо проводить в проростках глазков картофеля длиной не менее 1 см или в так называемых «индексах» (вырезанных из клубней глазков с мякотью, высаживаемых в стерильный субстрат). У клубней, находящихся в состоянии глубокого покоя (октябрь-декабрь), проростки такой величины можно

получить не менее чем после 3-не-дельного проращивания и предварительной обработки гибберелли-ном. В связи с этим сроки проведения экспертизы значительно увеличиваются.

Как уже отмечалось, для APMoV и APLV характерно наличие серологически различающихся штаммов, что обуславливает дополнительные трудности при их иммунодиагностике.

Для объективной диагностики необходимо использовать антисыворотки ко всем штаммам этого вируса, применяя их по отдельности или в смеси. В спецификациях фирм «АСдеп» и «ВюгеЬа» не указана реакция выпускаемых ими тест-систем к APLV и APMoV с серотипами этих вирусов. Такая реакция была испытана в лаборатории вирусологии ФГУ «ВНИИКР» со штаммспецифич-ными положительными контролями для ИФА фирмы «ВюгеЬа» (табл. 5).

Тест-системы к APLV фирм «АСдеп» и «ВюгеЬа» реагировали со всеми штаммами этого вируса (APLV-Col, APLV-Col-2, APLV-Hu), но для тест-системы фирмы «АСдеп» наблюдалась более сильная реакция со штаммом APLV-Hu. Для тест-системы к APLV фирмы «ВюгеЬа» отмечена также слабая сероположи-тельная реакция со штаммом андийского вируса крапчатости APMoV-B.

Таблица 4

Реакция тест-систем к АРМоУ и АРГУ фирмы «Adgen» с соком из различных тканей здоровых клубней картофеля

Тестируемые ткани клубней А405 для тест-систем к вирусам:

APLV APMoV

Глазки 0,060 (0,055-0,087) 0,079 (0,064-0,083)

Глазок + кожица 0,98 (0,075-0,127) 0,142 (0,100-0,190)

Кожица 0,164 (0,098-0,187) 0,217 (0,139-0,298)

Отрицательный контроль 0,057 0,070

Положительный контроль 4,282 4,446

Тест-системы к АРМсЧ фирм «Ас1деп» и «ВюгеЬа» высокоэффективно реагировали со штаммом APMoV-В и заметно слабее - со штаммом APMoV-С. Тест-система к APMoV фирмы «ВюгеЬа» не реагировала со штаммом APMoV-Н, а у аналогичной тест-системы фирмы «АСдеп» с данным штаммом отмечена лишь слабая сероположительная реакция (табл. 5).

В спецификации фирмы DSMZ указано, что используемая нами антисыворотка AS-0005 к APMoV рекомендована для выявления штамма APMoV-В. Нами подтверждена эффективность данной антисыворотки в выявлении штамма APMoV-В, но дополнительно установлена ее реакция со штаммом APMoV-С и слабая реакция со штаммом APLV-Col. Со штаммом APMoV-Н антисыворотка AS-0005 не реагировала.

Спецификацией фирмы DSMZ используемая нами антисыворотка AS-0002 к APLV рекомендована для выявления штаммов APLV-Col и APLV-Hu. Нами подтверждена высокая чувствительность этой антисыворотки к штамму APLV-Col, но к штамму APLV-Hu отмечена лишь очень слабая реакция. Дополнительно установлена сильная сероположительная реакция AS-0002 со штаммом APLV-Col-2, что не совпадает с характеристикой фирмы-производителя. Перекрестной реакции данной антисыворотки со штаммспецифически-ми положительными контролями к APMoV не отмечено (табл. 5).

Таким образом, в результате про-

веденных испытаний установлено, что тест-системы к APLV и APMoV фирмы «АСдеп» характеризуются наиболее высокой универсальностью при выявлении всех серотипов этих вирусов. Однако эти тест-системы непригодны для карантинной экспертизы ввиду их перекрестной реакции с целым рядом гетероло-гичных вирусов, заражающих картофель, и неспецифической реакции с компонентами сока растений картофеля.

Для тест-систем к APLV и APMoV фирмы «ВюгеЬа» нами также отмечена перекрестная реакция с гете-рологичными вирусами, но значительно более слабая, чем у антисывороток фирмы «АСдеп». Тест-система к APMoV фирмы «ВюгеЬа» не позволяла диагностировать штамм APMoV-Н.

Наиболее высокой специфичностью характеризовались испытанные нами тест-системы к APLV и APMoV фирмы DSMZ, которые не реагировали с PLRV, X-, Y-, S- и М-вируса-ми, наиболее часто встречающимися на картофеле. Однако антисыворотки этой фирмы характеризуются выраженной штаммспецифичнос-тью, поэтому для выявления всех се-ротипов APLV производителем рекомендуется параллельное использование антисывороток AS-0002 (для диагностики штаммов APLV-Col и APLV-Col-2) и AS-0003 (для детекции штамма APLV-Hu). Для диагностики всех серотипов APMoV фирма DSMZ рекомендует использовать антисыворотки AS-0005 (для выяв-

ления штамма APMoV-В) и AS-0007 (для выявления штаммов APMoV-С и APMoV-Н). Нами планируется проведение испытаний антисывороток AS-0003 и AS-0007 этой фирмы.

Негативным свойством всех испытанных нами тест-систем к APLV и APMoV является их реакция с положительными контролями к вирусам бронзовости томата (TSWV), некротической пятнистости бальзамина (INSV), желтой карликовости картофеля (PYDV) и в большинстве - с вирусом аукубы мозаики картофеля (PAMV). В случае присутствия этих вирусов в тестируемых образцах и перекрестной реакции с ними антисывороток к APLV и APMoV возможна ошибочная интерпретация результатов тестов. Для избежания этого необходимо дополнительное тестирование образцов на наличие TSWV, ^Ч PAMV и PYDV.

TSWV и РАМЧ давно известны на культуре картофеля. INSV преимущественно поражает декоративные и овощные культуры закрытого грунта, но картофель также является хозяином этого вируса. PYDV имеет североамериканское происхождение и включен в список А1 карантинных организмов ЕОКЗР. Все эти вирусы на картофеле в Российской Федерации не регламентированы, поэтому данные об их распространении на этой культуре в нашей стране практически отсутствуют.

Таким образом можно сделать вывод, что иммунодиагностика с использованием испытанных нами тест-систем фирм «АСдеп»,

Таблица 5

Реакция тест-систем к андийскому латентному вирусу картофеля (APLУ) и андийскому вирусу крапчатости картофеля (АРМоУ) фирм «Agden», «ВюгеЬа» и DSMZ со штаммспецифическими положительными контролями

к АР^У и АРМоУ фирмы DSMZ (2010 г.)

А405 для тест-систем к вирусам:

Контроля АРМоУ АРМоУ АРМоУ APLV APLV APLV

(«Adgen») («ВюгеЬа») (DSMZ, АЗ-0005) («Agden») («ВюгеЬа») ^М^ AS-0002)

Положительные контроли

АРМоУ-В, РУ-0057 3,383 (+) 2,436 (+) 4,397 (+) 0,057 0,273 (+/-) 0,024 (-)

АРМоУ-С, РУ-0058 0,982 (+) 1,951 (+) 0,844 (+) 0,079 0,099 (-) 0,029 (-)

АРМоУ-Н, РУ-0059 0,304 (+/-) 0,090 (-) 0,078 0,067 0,035 (-) 0,017 (-)

APLV-Col, РУ-0060 0,053 (-) 0,032 (-) 0,233 (+/-) 1,637 (+) 4,355 (+) 4,200 (+)

APLV-Col-2, РУ-0062 0,045 (-) 0,052 (-) 0,056 (-) 1,276 (+) 3,926 (+) 2,033 (+)

APLV-Hu, РУ-0061 0,050 (-) 0,051 (-) 0,052 (-) 4,451 (+) 4,412 (+) 0,244 (+/-)

«Bioreba» и DSMZ не гарантирует однозначную идентификацию APLV и APMoV в растениях картофеля. В дополнение к серологическим необходимо использовать молекулярные методы диагностики.

Разработка диагностики на основе ПЦР для выявления и идентификации APLV и APMoV в настоящее время проводится в лаборатории вирусологии ФГУ «ВНИИКР» с использованием специфических прай-меров, разработанных в ЗАО «Синтол» и ООО «Агродиагностика».

При разработке ПЦР-теста были использованы лиофилизированные изоляты PV-0062 штамма APLV-Col-2 и PV-0057 штамма APMoV-B, приобретенные в фирме DSMZ, штамм-специфичные положительные конт-роли для ИФА этой же фирмы, положительные и отрицательные контро-ли для ИФА к APLV, APMoV и ряду других вирусов фирм «Adgen», «Bioreba» и производства ВНИИКХ, клубни, индексы и горшечные растения картофеля различного происхождения с сероположительной и сероотрица-тельной реакцией к APLV и APMoV, здоровые растения картофеля сорта Жуковский ранний из ВНИИКХ, искусственно инокулированные изо-лятами PV-0057 и PV-0062.

Выделение РНК проводили комплектом реагентов для выделения нуклеиновых кислот (Проба-НК) фирмы «Агродиагностика». Реакцию обратной транскрипции ставили с использованием соответствующего комплекта реагентов ООО «Агроди-агностика», обратных транскриптаз AMV и MMLV фирмы «Promega» (США), обратной транскриптазы MMLV фирмы ПКЗАО «Диалат Лтд». Для реакции амплификации с прай-мерами фирмы «Агродиагностика» использовали комплект реагентов для ПЦР-амплификации кДНК этой же фирмы. Для постановки реакции амплификации с праймерами ЗАО «Синтол» использовали мастермикс для амплификации ДНК производства фирмы «Диалат Лтд», включающий в себя SmarTaq-полимеразу. ПЦР ставили на амплификаторах «Mastercycler Gradient» и «Master-

cycler Personal» фирмы «Eppendorf». Детекцию результатов RT-PCR осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Величину продуктов амплификации измеряли, используя маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruber 100 bp Plus фирмы «Fermentas».

Полученные продукты ПЦР очищали с использованием набора Gene JET PCR фирмы «Fermentas», после чего проводили их прямое сек-венирование. Последовательности после секвенирования выравнивали с помощью программы BioEdit. Выровненные последовательности оценивали в приложении BLAST NCBI.

При испытании праймеров Aplv rep к APLV, разработанных в фирме ЗАО «Синтол», специфический продукт амплификации заданной длины (319 п.о.) был получен к изоляту PV-0062 штамма APLV-Col-2, положительным контролям для ИФА к изоляту PV-0061 штамма APLV-Hu и PV-0062 фирмы DSMZ и к положительному контролю для ИФА фирмы «Bioreba». Не отмечено реакции праймеров Aplv rep с положительным контролем для ИФА к изоляту PV-0060 штамма APLV-Col (фото 1).

В пяти последующих эксперимен-

M 1 23456789

i—<

1. Электрофореграмма результатов RT-PCR c праймерами Aplv rep к APLV (наборы для выделения РНК и обратной транскрипции фирмы «Агродиагностика», реакция амплификации с мастермиксом фирмы «Диалат», специфический продукт — 319 п.о.).

Варианты: 1. Изолят PV-0062 штамма APLV-Col-2 (DSMZ); 2. Положительный контроль для ИФА к изоляту PV-0062 штамма APLV- Col-2 (DSMZ); 3. Положительный контроль для ИФА к изоляту PV-0060 штамма APLV-Col (DSMZ); 4. Положительный контроль для ИФА к изоляту PV-0061 штамма APLV-Hu (фирма DSMZ); 5. Лизирующий буфер; 6. Положительный контроль для ИФА к APLV фирмы «Bioreba»; 7. Отрицательный контроль для ИФА к APLV фирмы «Bioreba»; 8. Положительный контроль для ИФА к APLV фирмы «Adgen»; 9. Отрицательный контроль для ИФА к APLV фирмы «Adgen»; М-маркеры

M 1 2 3 4 5678 9 10 M

630 п.о.

« -

2. Электрофореграмма результатов КГ-РСК с праймерами ООО «Агродиагностика» к APLV (наборы реагентов фирмы «Агродиагностика», специфический продукт — 630 п.о.).

Варианты: 1. Изолят РУ-0062 штамма АР1У-Со1-2 2. Положительный кон-

троль для ИФА к изоляту РУ-0062 штамма АР1У- Со1-2 3. Положительный

контроль для ИФА к изоляту РУ-0060 штамма АР1У-Со1 4. Положительный

контроль для ИФА к изоляту РУ-0061 штамма АР1У-Ни (фирма DSMZ); 5. Лизирующий буфер; 6. Положительный контроль для ИФА к АР1У фирмы «ВюгеЬа»; 7. Отрицательный контроль для ИФА к АР1У фирмы «ВюгеЬа»; 8. Положительный контроль для ИФА к АР1У фирмы «Adgen»; 9. Отрицательный контроль для ИФА к АР1У фирмы «Adgen»; 10. Вода; М — маркеры

тах, в которых оптимизировали концентрации ферментов, режимы обратной транскрипции и амплификации, также не удалось добиться положительной реакции этих праймеров с положительным контролем к изоляту PV-0060 штамма APLV-Col фирмы DSMZ и положительным контролем для ИФА к APLV фирмы «Adgen».

Для праймеров к APLV, синтезированных в ООО «Агродиагностика», получена аналогичная реакция со всеми изолятами и контролями к APLV, что и для праймеров Aplv rep фирмы «Синтол» (фото 2).

Праймеры Aplv rep не реагировали с положительными контролями к APMoV, TSWV, PAMV, PYDV, а также с РНК, выделенной из растений картофеля, зараженных X-, Y-, S- и М-вирусами картофеля. Не отмечено неспецифической реакции этих праймеров с соком здоровых растений картофеля и хризантемы.

При испытании нескольких обратных транскриптаз (AMV и MMLV фирмы «Promega», MMLV фирмы «Диалат Лтд», набора RT-Random фирмы «Агродиагностика») лучшая эффективность амплификации для изоля-тов штаммов APLV-Col-2 и APLV-Hu получена с обратной транскриптазой AMV фирмы «Promega». При использовании наборовреагентов фирмы «Диалат Лтд» установлена возможность проведения реакций обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке, что сокращает продолжительность теста.

Последовательности продуктов, полученных после амплификации с испытуемыми праймерами к APLV, на 98 % соответствовали участку гена репликазы белка(нуклеотиды 377-617) в геноме APLV.

Синтезированные для выявления APMoV праймеры фирмы «Агродиагностика» и праймеры Apmv Rpol фирмы «Синтол» реагировали лишь со штаммом APMoV-В, но не со штаммами APMoV-C, APMoV-Н и положительными контролями фирм «Adgen» и «Bioreba» (фото 3). Аналогичные результаты были получены во всех последующих экспериментах, ставящих своей целью оптими-

зировать условия проведениятеста.

При испытании праймеров ЗАО «Синтол» Арту Рр не было получено положительной реакции ни с одним контролем к АРМс^.

Для получения кДНК штамма APMoV-В в равной степени были пригодны обратные транскриптазы AMV фирмы «Рготеда», MLV фирмы «Диалат Лтд» и набор RT-Random фирмы «Агродиагностика».

Реакции обратной транскрипции и амплификации успешно проходили в одной пробирке при использовании транскриптазы MMLV фирмы «Рготеда» и мастермикса для амплификации ДНК фирмы «Диалат Лтд» с БтагТад-полимеразой. Не отмечено перекрестной реакции праймеров Арту Rpol с X-, Y-, Б- и М-вирусами картофеля, а также с соком здоровых растений картофеля. В то же время достигнут положительный результат при выявлении APMoV уже через 6 дней после искусственной инокуляции этим вирусом здоровых растений картофеля (фото 4).

Чувствительность выявления APMoV методом ПЦР не снижалась

М 1 2 3 4 5 6 М

3. Электрофореграмма результатов КГ-РСК с праймерами Аршу Кро1 к АРМоУ) (наборы для выделения РНК и обратной транскрипции фирмы «Агродиагностика», реакция амплификации с мас-термиксом фирмы «Диалат Лтд», специфический продукт — 319 п.о.).

Варианты: 1. Положительный контроль для ИФА к изоляту РУ-0057 штамма АРМоУ-В ф8М2); 2. Положительный контроль для ИФА к изоляту РУ-0058 штамма АРМоУ-С ф8М2); 3. Положительный контроль для ИФА к изоляту РУ-0059 штамма АРМоУ-Н 4. Положительный контроль для ИФА к АРМоУ фирмы «ВюгеЪа»; 5. Положительный контроль для ИФА к АРМоУ фирмы «Adgen»; 6. Вода; М-мар-керы молекулярного веса ДНК

11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 м W

S 323 п.о. щр mm 1

\Л л ti Л

4. Выявление андийского вируса крапчатости картофеля (АРМоУ) методом ПЦР в различных образцах картофеля (праймеры Аршу Кро1, наборы для выделения РНК и обратной транскрипции фирмы «Агродиагностика», специфический продукт — 323 п.о.)

Варианты: 1. Сорт Ильинский, ВНИИКХ, «индекс», здоровое растение; 2. Сорт Ред Скарлет, «индекс», здоровое растение; 3. 5344/09-и, № 38.2, горшечное растение, заражено РУУ; 4. 5344/09-и, № 21.4, горшечное растение, заражено РУЗ; 5. 5344/09-и, № 14.2, горшечное растение, заражено PУY и РУМ; 6. Положительный контроль для ИФА к изоляту РУ-0057 штамма АРМоУ-В 7. Сорт Лукьяновский,

ВНИИКХ, клубень, заражен PVY и РУМ; 8. Сорт Памяти Лорха, ВНИИКХ, клубень, заражен РУХ и РУМ; 9. Сорт Никулинский, ВНИИКХ, клубень, заражен РУХ, РУ8 и РУМ; 10. 5344/09-и, № 35.2, клубень, заражен РУ8, РУХ и РУМ; 11. Сорт Жуковский ранний, растение инокулированное АРМоУ; 12. Сорт Жуковский ранний, растение инокулированное АР1У; М — маркер молекулярного веса ДНК

при 80-кратном разбавлении положительного контроля соком здоровых растений картофеля.

Последовательность продуктов, полученных после амплификации с испытуемыми праймерами к АРМоУ на 97 % соответствовала участку гена РНК-зависимой РНК-полиме-разы (нуклеотиды 1444-1744) генома АРМоУ. Это свидетельствует о высокой специфичности разработанных праймеров.

Таким образом, в ФГУ «ВНИИКР» разработана диагностика на основе ПЦР, позволяющая выявлять два из трех известных штаммов APLV и наиболее распространенный штамм АРМоУ. Необходима расшифровка участков генома штаммов АРМоУ-С, АРМоУ-Н и APLV-Сol и получение к

ним специфических праймеров, что позволит разработать ПЦР-тест, позволяющий диагностировать все штаммы этих вирусов.

Проведенные эксперименты позволяют сделать следующие выводы:

1. Для выявления APLV и APMoV в растениях картофеля в качестве скрининг-теста применять ELISA-тест со штаммспецифичными антисыворотками фирмы DSMZ.

2. При тестировании клубней для вирусологической экспертизы использовать только глазки (длиной не менее 1 см) клубней без кожицы или «индексы».

3. Для подтверждения сероположи-тельных результатов использовать разработанный тест на основе ПЦР.

УДК 632.936.2

Аттрактивность насекомых -

С.В. ПИМЕНОВ, специалист-энтомолог Пятигорского филиала ФГУ «ВНИИКР» e-mail: [email protected]

Для своевременной и эффективной борьбы с вредителями продовольственных запасов, в частности зерна, очень важна диагностика его зараженности на ранних стадиях. С этой целью широко применяются ловушки и пищевые приманки. Для усиления аттрактивности пищевых приманок в корм могут добавляться различные виды растительных масел. Мы изучали возможность применения растительных масел в качестве аттрактантов насекомых. Ловушки, установленные на одном из предприятий хлебопродуктов Ставропольского края, содержали подсолнечное, кукурузное, льняное, оливковое и репейное масла. Контролем служила ловушка только с клеем пестификс.

Применение масляных ловушек позволило выявить практически всю энтомофауну склада. Было отловлено 24 вида насекомых, относящихся к 12 семействам. При подсчете и диагностике вредителей не учитывались случайные виды, не относящиеся к обитателям складских помещений (табл.). Наиболее широко были представлены семейства чернотелок (Tenebrionidae) - 5 видов, плоскотелок (Cucujidae) - 4 вида и огневок (Pyralidae) - 3 вида. Из вредителей запасов зерна в ловушках, расположенных по краю насыпи, обнаружено в среднем больше особей суринамского мукоеда (48,1 экз.), а из засорителей запасов зерна - бархатистого грибоеда (127,2 экз.).

Гусеницы огневок, жуки блестянок и скрытников концентрировались в средней и верхней частях насыпи зерна.

ЛИТЕРАТУРА

1. Avila A.C., Salazar L.F., Ortega M., Daniels J. A new strain of Andean potato mottle virus from Brazil // Plant Disease, 1984, vol. 68, р. 997-998.

2. Fribourg C.E., Jones R.A.C., Koenig R. Andean potato mottle, a new member of the Cowpea mosaic virus group // Phytopathology, 1977, vol. 67, p. 969-974.

3. Fribourg C.E., Jones R.A.C., Koenig R. Host plant reaction, physical properties and serology of three isolates of Andean potato latent virus from Peru // Annals of Applied Biology, 1977, Vol. 86, p. 373-380.

4. GibbsA.J., Hecht-PoinarE., WoodsR.D., McKee R.K. Some properties of three related viruses: Andean potato latent, dulcamara mottle and ononis yellow mosaic // Journal of General Microbiology, 1966, vol. 44, p. 177-193.

5. Koenig R., Lesemann D. Tymovirus group // CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, 1979, № 214, р. 7.

6. Lizirraga C., Canta CruzM., Jayasinghe U. Detection of isolate of Andean potato latent virus in ulluco (Ullucus tuberosus Caldas) // Plant Dis, 1996, vol. 80, p. 344-345.

7. EPPO. Phytosanitary procedures PM 3/21 (2). Post-entry quarantine for potato // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2004, vol. 34, p. 443-454.

Аннотация. Объекты внешнего карантина APMoV и APLV (список А1 ЕОКЗР и РФ) являются потенциально опасными патогенами для коллекционных и селекционных посадок картофеля в РФ. Для достоверной идентификации карантинных вирусов картофеля необходимо комплексное использование серологического (ИФА), молекулярного (ПЦР) и биологического (растения-индикаторы) тестов. В настоящее время во ВНИИКР и ВНИИКХ в рамках совместной программы проводится отработка методов выявления и идентификации APMoV и APLV.

Ключевые слова. Андийский вирус крапчатости картофеля (APMoV), андийский латентный вирус картофеля (APLV), внешний карантин, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция.

Abstract. APMoV and APLV (EPPO A1 List and Russia) associated with imported plants and plant products are potentially dangerous pathogens of potatoes planted for the purposes of selection and collection. These pathogens fall under the external quarantine regulations of the Russian Federation. Reliable identification of these pathogens requires use of integrated approach, i.e. use of a combination of serological (ELISA), molecular (PCR) and biological (indicator plants) methods. At present VNIIKR and VNIIKH under the joint initiative are testing and validating of APMoV and APLV identification methods.

Keywords. Andean potato mottle virus, Andean potato latent virus, external quarantine, Enzyme-linked immunosorbent assay, polymerase chain reaction.

ФГУ «ВНИИКР»,

ВНИИ картофельного хозяйства