CC BY
15
УДК 616.32
DOI 10.21685/2072-3032-2019-4-9
А. В. Шабров, А. В. Климашевич, Г. А. Зюлькин, О. П. Петрушова, Н. О. Поворинская
СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА ПИЩЕВОДА РАСТВОРАМИ КИСЛОТЫ И ЩЕЛОЧИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Аннотация.
Актуальность и цели. Перекисное окисление липидов является одним из неспецифических механизмов ответа на химическую травму любой локализации. Химические ожоги пищевода растворами щелочи и кислоты имеют различия в патогенезе. Исследование проведено с целью определения дифференциации в динамике восстановления баланса в системе прооксиданты-антиоксиданты после химического повреждения пищевода различными прижигающими жидкостями.
Материалы и методы. Экспериментальными животными были выбраны 30 кроликов породы шиншилла. Моделирование химического ожога пищевода раствором кислоты выполняли с использованием 46 % раствора уксусной кислоты. Экспериментальную модель химического ожога пищевода раствором щелочи создавали с использованием 18,5 % раствора едкого натра. Проводили оценку состояния системы прооксиданты-антиоксиданты на 5, 14, 21, 30, 45-е сут от начала эксперимента.
Результаты. В эксперименте отмечали явления активизации процессов перекисного окисления липидов со 2-х до 5-х сут независимо от природы коррозионного вещества. Восстановление баланса прооксидантов-антиоксидантов регистрировали к 21-м сут после химического ожога раствором щелочи, и к 30-м сут после химического ожога раствором кислоты. К 45-м сут эксперимента явлений перекисного дисбаланса не наблюдали.
Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном дисбалансе в системе перекисного окисления липидов после химического ожога пищевода независимо от природы коррозионного вещества. В динамике дисбаланс в системе прооксиданты-антиоксиданты купируется к 21-м сут после химической травмы раствором щелочи, что на 9-е сут раньше относительно химического ожога раствором уксусной кислоты.
Ключевые слова: химический ожог пищевода, перекисное окисление липидов.
A. V. Shabrov, A. V. Klimashevich, G. A. Zyul'kin, O. P. Petrushova, N. O. Povorinskaya
STATE OF THE LIPID PEROXIDATION SYSTEM AFTER CHEMICAL BURNING OF THE ESOPHAGUS WITH ACID AND ALKALI SOLUTIONS IN THE EXPERIMENT
© Шабров А. В., Климашевич А. В., Зюлькин Г. А., Петрушова О. П., Поворинская Н. О., 2019. Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место.
Abstract.
Background. Lipid peroxidation is one of the non-specific mechanisms of response to chemical injury of any localisation. Chemical burns of the esophagus with alkali and acid solutions have differences in the pathogenesis. In this study it was determined the differentiation in the dynamics of restoring balance in the system of prooxidants-antioxidants after chemical damage to the esophagus with various corrosive liquids.
Materials and methods. Experimental animals were selected 30 rabbits of the breed of tire shilla. Modeling of a chemical burn of the esophagus with an acid solution was performed using a 46% solution of acetic acid. An experimental model of a chemical burn of the esophagus with an alkali solution was created using an 18.5% sodium hydroxide solution.
Results. Activation of lipid peroxidation processes registrated from 2 to 5 days, regardless of the nature of the corrosive substance. The restoration of the balance of prooxidants-antioxidants was discovered on the 21st day after the alkali chemical burn and on the 30th after the acid chemical burn. On the 45th day of the experiment there was no peroxide imbalance. The state of the prooxidant - antioxidant system was evaluated on the 5th, 14th, 21st, 30th, 45th days from the beginning of the experiment.
Conclusions. The results of the experiment indicate an imbalance in the system of lipid peroxidation after a chemical burn of the esophagus, regardless of the nature of the corrosive substance. An imbalance in the system of prooxidants-antioxidants was stopped on the 21st day after a alkali chemical injury, which is 9 days earlier than a acid chemical burn.
Keywords: modeling of chemical burn of the esophagus, antioxidants.
Введение
Процессы свободнорадикального окисления наблюдаются во всех тканях аэробных организмов (в основном липопротеиновых структурах и мембранах), что является физиологическим процессом [1]. При повреждении мембраны клетки возникает дисбаланс между антиоксидантами и проокси-дантами в сторону активизации процессов перекисного окисления липидов. Данный патофизиологический механизм является неспецифическим в ответ на альтерацию [2-4].
Первичное повреждение клеточных мембран агрессивными химическими веществами приводит к высвобождению свободных радикалов, расположенных внутриклеточно. Данные химические соединения, проникая в межклеточное пространство, взаимодействуют с липидами мембран соседних клеток, образуя новые прооксиданты. Радикалы, в свою очередь, активизируют новые цепи свободнорадикальных процессов [5, 6]. К первичному «эндогенному» дисбалансу в системе перекисного окисления липидов присоединяется прооксидантное действие резорбированных из просвета желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) коррозионных препаратов. Раствор кислоты обладает большей способностью к всасыванию в системный кровоток относительно раствора щелочи. Резорбция уксусной кислоты ведет к внутрисосудистому гемолизу эритроцитов. В результате высвобождается большое количество ге-миновых соединений, ионов железа и гемоглобина, которые катализируют разложение гидроперекисей, что приводит к образованию новых свободных радикалов [7-9]. Данный первичный дисбаланс также поддерживается развивающимся в последующем ожоговым эзофагитом [10-12].
Материалы и методы
Исследование на животных проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (Washington, D.C., 1996), требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 1986), принципами ГОСТ «Надлежащая лабораторная практика».
Работу выполняли на базе «Центра доклинических исследований» и Медицинского института Пензенского государственного университета. На проведение эксперимента было получено разрешение локального этического комитета Пензенского государственного университета (протокол № 9 от 30.10.2015). Экспериментальными животными явились кролики-самцы породы шиншилла в количестве 30 особей массой тела не более 5 кг и не менее 3,5 кг. Животных разделили на две группы по 15 особей в каждой с моделированием химического ожога пищевода раствором щелочи и раствором кислоты.
Химический ожог пищевода раствором кислоты создавали путем экспозиции 46 % уксусной кислоты в течение 1 мин в объеме 1 мл. Для этого под общей анестезией расширяли ротовую полость подопытному животному, вводили устройство для доставки химического вещества. В последующем быстро удаляли зонд. На данное устройство получен патент РФ на изобретение № 134422 от 20.11.2013.
Создавали ожог пищевода раствором щелочи путем экспозиции 18,5 % едкого натра в течение 1 мин в объеме 1 мл с помощью устройства для доставки щелочного раствора. На данное устройство получен патент РФ на изобретение № 163272 от 10.07.2016.
У экспериментальных животных выполняли забор крови на 5, 14, 21, 30, 45-е сут. Определяли показатели активности ферментов антиоксидант-ной защиты (каталаза, церулоплазмин, супероксиддисмутаза) и концентрацию продуктов перекисного окисления липидов (диеновые и триеновые конъюгаты, малоновый диальдегид). Статистическую обработку проводили на IBM PC/AT в среде Microsoft Windows 7 Service Park 1 с использованием пакетов программ статистической обработки данных «Statistica 9.0». Для всех параметров определяли минимальное (Min) и максимальное (Max) значения, стандартное отклонение (m), среднюю арифметическую (М). Для сравнения экспериментальных групп по количественному признаку использовали методы непараметрической статистики: для связанных групп - критерий Вилкок-сона, для несвязанных - критерий Манна-Уитни. Достоверность различий определяли при помощи непараметрического критерия Колмогорова - Смирнова. Различия считали достоверными при p < 0,05, т.е. 95 % пороге вероятности.
Результаты
После химического ожога пищевода в образцах крови экспериментальных животных регистрировали выраженный дисбаланс в системе проокси-данты-антиоксиданты. Активность ферментов-антиоксидантов прогрессивно снижалась со 2-х сут после нанесения ожоговой травмы до 21-х и 30-х сут
эксперимента соответственно группам химического ожога пищевода раствором щелочи и кислоты (табл. 1). Уровень церулоплазмина снижался начиная со 2-х сут наблюдения. В динамике данный показатель возвращался к исходному значению к 21-м сут эксперимента после химического ожога раствором щелочи, разница в данном показателе между сравниваемыми группами составила 23,2 % (р < 0,05). К 30-м сут исследования уровень церулоплазмина нормализовался в группе ожогов пищевода раствором кислоты. В остальные временные промежутки статистически значимой разницы уровня церуло-плазмина между исследуемыми группами выявлено не было (р > 0,05).
Таблица 1
Значения параметров перекисного окисления липидов после химического ожога 18,5 % раствором едкого натра и 46 % раствором уксусной кислотой (Ме, п = 30)
Показатель Химический реагент Исходное значение 2-е сут 5-е сут 14-е сут 21-е сут 30-е сут 45-е сут
ЦП (мг/л) Раствор кислоты 5701,25 5065,2 2669,6 4132,5 4332,1 5917,2 5835,3
Раствор щелочи 5701,25 5600 2625 4687,5 5337,5 5906,25 5950
СОД (усл. ед./ мг белка) Раствор кислоты 6,12 3,3 2,673 3,230 3,818 5,98 6,72
Раствор щелочи 6,12 2,8 2,1 3,64 5,8 7,6 6
я а 3 Ь нч л ас Раствор кислоты 0,0182 0,0819 0,0655 0,0319 0,0300 0,0228 0,0223
Раствор щелочи 0,0182 0,033 0,028 0,027 0,0191 0,0190 0,0203
МДА (нМоль/г белка) Раствор кислоты 2,137 6,057 6,625 6,192 6 3,286 2,109
Раствор щелочи 2,137 5,95 5,3 4,92 4,3 3,2 1,9
ДК и ТК (усл. ед./мг липидов) Раствор кислоты ДК 1,6277 5,026 5,641 6,643 6,4025 4,83 2,3
ТК 1,75125 4,511 5,104 5,79 6,09 3,612 1,772
Раствор щелочи ДК 1,6277 3,975 3,96 4,83258 2,561 2,015 1,15
ТК 1,75125 3,375 3,735 4,245 1,65375 1,84875 2,325
Примечание. ЦП - церулоплазмин, СОД - супероксиддисмутаза, МДА - малоновый диальдегид, ДК - диеновые конъюгаты, ТК - триеновые конъюгаты.
Активность супероксиддисмутазы снижалась до минимальных значений в обеих группах к 5-м сут эксперимента. На 14-е сут исследования отмечали тенденцию к восстановлению уровня фермента. На 21-е сут выявлена разница в активности между сравниваемыми группами в 1,992 усл. ед./мг
белка, или 51,9 % при ^ < 0,05), больше после химического ожога раствором щелочи. На 30-е сут эксперимента уровень фермента в обеих группах достигал доожогового значения.
Повышение уровня каталазы регистрировали со 2-х сут наблюдения. В данный временной промежуток значение параметра увеличивалось относительно исходного значения в 4,5 раза после химического ожога уксусной кислотой, в то же время в группе ожогов щелочными растворами - в 1,8 раза. Причиной данного различия явилась способность кислоты к большей резорбции из просвета желудка подопытного животного относительно щелочного раствора с развитием метаболического ацидоза и гемолиза эритроцитов. В дальнейшем уровень каталазы снижался до исходных значений в группе ожога пищевода раствором кислоты к 30-м сут эксперимента, в группе ожогов раствором щелочи - к 21-м сут исследования.
В группе прооксидантов была отмечена тенденция к быстрому увеличению значений сразу после химической травмы и до 21-х сут после химического ожога раствором щелочи и 30-х сут после химического ожога раствором кислоты.
Концентрация триеновых и диеновых конъюгатов в плазме крови животных увеличивалась со 2-х сут эксперимента с максимальным значением в исследуемых группах на 14-е сут. На 21-е сут отмечали статистически значимое снижение значений показателей в группе ожогов пищевода щелочными растворами: диеновых конъюгатов на 53 % и триеновых конъюгатов на 39 % (р < 0,05). Нормализация данных показателей регистрировали к 45-м сут эксперимента в обеих группах.
Как конечное звено перекисного окисления липидов малоновый диаль-дегид был повышен со 2-х сут эксперимента с максимальным значением в группе химических ожогов раствором щелочи. В дальнейшем данный параметр имел четкую тенденцию к снижению в группе химических ожогов едким натром. В группе ожогов уксусной кислотой отмечалась стабилизация значения параметра до 21-х сут эксперимента. Нормализация значения показателя отмечена на 45-е сут исследования в обеих группах.
Обсуждение
При химических ожогах пищевода отмечается ряд закономерностей течения процессов перекисного окисления липидов, что обусловлено природой коррозионного вещества. При ожоге кислотными растворами реагент в большей степени реабсорбировался из просвета желудочно-кишечного тракта экспериментального животного и в большей степени вызывал метаболические изменения в системном кровотоке относительно раствора щелочи. Раствор уксусной кислоты оказывал меньшее деструктивное действие на стенку органа по сравнению с раствором едкого натра, но образование плотного ожогового струпа после химического ожога пищевода кислотой способствовало затягиванию смен фаз воспаления [13]. Данные различия в патогенезе химических ожогов пищевода различными по структуре прижигающими жидкостями имели отражения в динамике концентраций исследуемых ферментов. В эксперименте концентрация прооксидантов (малоновый диальде-гид, диеновые и триеновые конъюгаты) возрастала со 2-х сут после химического ожога пищевода с последующим увеличением показателей до 21-х сут
в группе химических ожогов щелочным раствором и до 30-х сут после химического ожога раствором кислоты. Нормализация показателей ферментов ан-тиоксидантной защиты (церулоплазмин, супероксиддисмутаза, каталаза) была отмечена также к 21-м сут эксперимента в группе химических ожогов раствором едкого натра и к 30-м сут в группе химических ожогов раствором уксусной кислотой.
Заключение
Химический ожог пищевода независимо от химической природы реагента приводит к выраженному дисбалансу в системе перекисного окисления липидов в сторону преобладания прооксидантов и конечных продуктов окисления липидов со снижением активности ферментов-антиоксидантов.
Дисбаланс в системе прооксиданы-антиоксиданты купировался к 30-м суткам после химического ожога пищевода раствором кислоты. После воздействия раствора щелочи ликвидация перекисного дисбаланса отмечалась к 21-м сут, что на 9-е сут раньше относительно ожога раствором уксусной кислоты. Данное различие обусловлено образованием плотного ожогового струпа после химического ожога пищевода раствором кислоты с длительно текущим ожоговым эзофагитом, а также прооксидантным свойством самого раствора кислоты.
Библиографический список
1. Зобова, Д. А. Перекисное окисление липидов как патогенетическая основа развития эндотелиальной дисфункции / Д. А. Зобова, С. А. Козлов, Т. К. Парамонова, Н. А. Тюрина // Medicus. - 2016. - № 3 (9). - С. 21-22.
2. Индукторная способность мембраностабилизирующих препаратов / П. П. Зайцев, А. П. Власов, А. Г. Григорьев, О. А. Карпунькин, А. М. Альсовайди, И. А. Крен-делев // Вестник хирургической гастроэнтерологии. - 2018. - № 1. - С. 48-49.
3. Raposio, E. Evaluation of plasma oxidative stress, with or without antioxidant supplementation, in superficial partial thickness burn patients: a pilot study / E. Raposio, M. P. Grieco, E. Caleffi // Journal of Plastic Surgery and Hand Surgery. - 2017. - № 2. -P. 1-6.
4. Adjepong, M. The role of antioxidant micronutrients in the rate of recovery of burn patients: a systematic review. / M. Adjepong, P. Agbenorku, P. Brown, I. Oduro // Burns Trauma. - 2016. - Vol. 3, № 4. - P. 18.
5. Нестеров, Ю. В. Изменение активности супероксиддисмутазы, каталазы и свободнорадикальных процессов в легочной ткани крыс разного постнатального возраста при тепловом стрессе / Ю. В. Нестеров, А. С. Чумакова, Д. Л. Теплый // Астраханский медицинский журнал. - 2016. - Т. 11, № 2. - С. 75-83.
6. Чеснокова, Н. П. Молекулярно-клеточные механизмы индукции свободнора-дикального окисления в условиях патологии / Н. П. Чеснокова, Е. В. Понукалина, М. Н. Бизенкова // Современные проблемы науки и образования. - 2006. - № 6. -С. 21-26.
7. Окисленные белки в крови больных с острым отравлением уксусной кислотой / Л. А. Демидчик, И. В. Бейникова, Л. Е. Муравлева, В. Б. Молотов-Лучанский, Р. Е. Бакирова, Д. А. Клюев, Р. А. Утибаева // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2018. - № 5-1. - С. 82-86.
8. Особенности окислительного стресса в остром периоде химической болезни / М. В. Белова, К. К. Ильяшенко, Б. В. Давыдов, С. И. Петров, И. В. Батурова, Ж. Ц. Нимаев, Е. А. Лужников // Токсикологический вестник. - 2007. - № 2. -С. 12-15.
9. Frisman, E. Red cell antioxidant enzymes and prognostic indexes in patients with burns / E. Frisman, O. Racz, A. Chmelarova // Burns. - 2013. - Vol. 39, № 3. - P. 458-464.
10. Нимаев, Ж. Ц. Антиоксидантная терапия в комплексном лечении больных с острыми отравлениями веществами прижигающего действия : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 14.01.17 / Нимаев Ж. Ц. ; Научно-исследовательский институт скорой помощи. - Москва, 2009. - 24 с.
11. Говорин, А. В. Нарушение процессов перекисного окисления липидов и антиокислительной системы крови у больных с острым отравлением уксусной кислотой / А. В. Говорин, Е. В. Бойко, Н. А. Соколова, Е. А. Руцкина // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - № 1. - С. 112-113.
12. Dubick, M. A. Ceruloplasmin and Hypoferremia: Studies in Burn and Non-Burn Trauma Patients / M. A. Dubick, J. L. Barr, C. L. Keen, J. L. Atkins // Antioxidants (Basel). - 2015. - Vol. 6, № 4 (1). - P. 153-69.
13. Баландина, И. А. Морфологическая характеристика пищевода после химического ожога с проведением баллонной дилатации на 30-е сутки / И. А. Баландина, Ф. А. Шилова, Ф. З. Сапегина // Материалы итоговой научно-практической конференции ПГМА. - Пермь, 2003. - С. 161-163.
References
1. Zobova D. A., Kozlov S. A., Paramonova T. K., Tyurina N. A. Medicus. 2016, no. 3 (9), pp. 21-22. [In Russian]
2. Zaytsev P. P., Vlasov A. P., Grigor'ev A. G., Karpun'kin O. A., Al'sovaydi A. M., Kren-delev I. A. Vestnik khirurgicheskoy gastroenterology [Bulletin of surgical gastroenterology]. 2018, no. 1, pp. 48-49. [In Russian]
3. Raposio E., Grieco M. P., Caleffi E. Journal of Plastic Surgery and Hand Surgery. 2017, no. 2, pp. 1-6.
4. Adjepong M., Agbenorku P., Brown P., Oduro I. Burns Trauma. 2016, vol. 3, no. 4, pp. 18.
5. Nesterov Yu. V., Chumakova A. S., Teplyy D. L. Astrakhanskiy meditsinskiy zhurnal [Astrakhan medical journal]. 2016, vol. 11, no. 2, pp. 75-83. [In Russian]
6. Chesnokova N. P., Ponukalina E. V., Bizenkova M. N. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya [Modern problems of science and education]. 2006, no. 6, pp. 21-26. [In Russian]
7. Demidchik L. A., Beynikova I. V., Muravleva L. E., Molotov-Luchanskiy V. B., Baki-rova R. E., Klyuev D. A., Utibaeva R. A. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fun-damental'nykh issledovaniy [International journal of applied and basic research]. 2018, no. 5-1, pp. 82-86. [In Russian]
8. Belova M. V., Il'yashenko K. K., Davydov B. V., Petrov S. I., Baturova I. V., Nimaev Zh. Ts., Luzhnikov E. A. Toksikologicheskiy vestnik [Toxicological bulletin]. 2007, no. 2, pp. 12-15. [In Russian]
9. Frisman E., Racz O., Chmelarova A. Burns. 2013, vol. 39, no. 3, pp. 458-464.
10. Nimaev Zh. Ts. Antioksidantnaya terapiya v kompleksnom lechenii bol'nykh s ostrymi otravleniyami veshchestvami prizhigayushchego deystviya: avtoref. dis. kand. med. nauk: 14.01.17 [Antioxidant therapy in the complex treatment of patients with acute poisoning with cauterizing substances: author's abstract of dissertation to apply for the degree of the candidate of medical sciences: 14.01.17]. Moscow, 2009, 24 p. [In Russian]
11. Govorin A. V., Boyko E. V., Sokolova N. A., Rutskina E. A. Dal'nevostochnyy meditsinskiy zhurnal [Far Eastern medical journal]. 2009, no. 1, pp. 112-113. [In Russian]
12. Dubick M. A., Barr J. L., Keen C. L., Atkins J. L. Antioxidants (Basel). 2015, vol. 6, no. 4 (1), pp. 153-69.
13. Balandina I. A., Shilova F. A., Sapegina F. Z. Materialy itogovoy nauchno-prakticheskoy konferentsii PGMA [Proceedings of final scientific and practical conference of Perm State Medical Academy]. Perm, 2003, pp. 161-163. [In Russian]
Шабров Александр Валерьевич
ассистент, кафедра хирургии, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: [email protected]
ShabrovAleksandr Valer'evich Assistant, sub-department of surgery, Medical Institute, Penza State University (40, Krasnaya street, Penza, Russia)
Климашевич Александр Владимирович
доктор медицинских наук, профессор, кафедра хирургия, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: [email protected]
Зюлькин Григорий Александрович
кандидат медицинских наук, доцент, кафедра хирургии, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40); заведующий хирургическим отделением, Пензенская областная клиническая больница имени Н. Н. Бурденко (Россия, Пенза, ул. Лермонтова, 28)
E-mail: [email protected]
Klimashevich Aleksandr Vladimirovich Doctor of medical sciences, professor, sub-department of surgery, Medical Institute, Penza State University (40, Krasnaya street, Penza, Russia)
Zyul'kin Grigoriy Aleksandrovich Candidate of medical sciences, associate professor, sub-department of surgery, Medical Institute, Penza State University (40, Krasnaya street, Penza, Russia); head of the surgical unit, Penza Regional Clinical Hospital named after N. N. Burdenko (28, Lermontova street, Penza, Russia)
Петрушова Ольга Петровна кандидат биологических наук, доцент, кафедра физиологии человека, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: [email protected]
Petrushova Ol'ga Petrovna Candidate of biological sciences, associate professor, sub-department of human physiology, Medical Institute, Penza State University (40, Krasnaya street, Penza, Russia)
Поворинская Наталья Олеговна студентка, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: [email protected]
Povorinskaya Natal'ya Olegovna
Student, Medical Institute, Penza State University (40, Krasnaya street, Penza, Russia)
Образец цитирования:
Состояние системы перекисного окисления липидов после химического ожога пищевода растворами кислоты и щелочи в эксперименте / А. В. Шабров, А. В. Климашевич, Г. А. Зюлькин, О. П. Петрушова, Н. О. Поворинская // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2019. - № 4 (52). - С. 86-93. - DOI 10.21685/2072-3032-2019-4-9.
