CC BY
31
УДК 535.36:53.088:612.11:612.398.1
СООТНОШЕНИЕ РАЗМЕРОВ И КОНЦЕНТРАЦИЙ ЧАСТИЦ В НЕРАЗБАВЛЕННОЙ И РАЗБАВЛЕННОЙ ПЛАЗМЕ КРОВИ ПО ДАННЫМ СВЕТОРАССЕЯНИЯ
М. Н. Кириченко, A.B. Масалов, Л. Л. Чайков, А. Р. Зарицкий
В работе представлены результаты ■исследования ели-MfiUiM разбавления, на концентрации и размеры частиц в плазме крови, получаемые с помощью методов динамического рассеяния, света. Установлено, что связь между концентрациями и радиусами частиц имеет линейный характер в двойном, логарифмическом масштабе как для, неразбавленных, так и для, разбавленных el 0 и 100 раз образцов размороженной плазмы, крови в области размеров частиц от 1 до 300 нм, для, сферической модели их формы. Это указывает на применимость теории Ми и её приближений и формулы, Стокса Эйнштейна для, описания, светорассеяния, в неразбавленной плазме. Показа,но, что применение модели ■цилиндрической формы частиц расширяет диапазон линейной связи между концентрациями и размерами частиц до размеров в 10000 нм.
Ключевые слова: частицы плазмы крови, распределение интенсивности рассеянного света по размерам частиц, соответствие концентраций частиц их радиусам.
Исследования плазмы и сыворотки крови важны с точки зрения как фундаментальных проблем биологии человека, так и диагностики заболеваний [1 4]. Методы светорассеяния (динамического и статического) успешно применяются для исследования этих биологических жидкостей. Одним из важнейших параметров, определяемых с помощью метода динамического рассеяния света (ДРС), является гидродинамический радиус белков, агрегатов и везикулярных частиц, который может изменяться при разЛИЧНЫХ заболеваниях. Не менее важной с этой точки зрения является концентрация частиц в плазме крови. Исследованию сыворотки крови с помощью методов светорассеяния посвящено заметное количество работ, в то время как плазма крови исследована ФИАН, 119991 Россия, Москва, Ленинский пр-т, 53; e-mail: [email protected].
в меньшей степени [5, 6]. Имеющиеся в литературе работы в основном посвящены ис~ следованию либо модельных растворов [7 9], либо разбавленных образцов [10]. Работ, посвященных определению концентрации частиц в неразбавленных образцах плазмы5 нами не обнаружено. Это связано, по-видимому, с опасениями, что применимость модели Стокса Эйнштейна для оценки гидродинамических радиусов, а также теории Ми или приближения Рэлея Ганса Дебая (РГД) для расчета концентраций может нарушаться в случае образцов с высокой концентрацией белка. Практический же интерес чаще всего представляют именно неразбавленные образцы плазмы крови.
Согласно теории Ми и приближению РГД [11 13] рассеяние света происходит независимо на каждой частице и полная интенсивность рассеянного света пропорциональна концентрации присутствующих в жидкости частиц. Приближение независимости рассеяния на отдельных частицах может нарушаться по мере роста их концентрации, когда полная интенсивность обусловлена не суммой интенсивностей рассеяния на отдельных частицах, а амплитудой флуктуаций среднего по длине волны показателя преломления. С другой стороны, при высоких концентрациях молекул или агрегатов белков неизбежно возникает их взаимодействие, что может исказить соотношение между коэффициентом диффузии D и радиусом частиц r, которое в отсутствие взаимодействия описывается формулой Стокса Эйнштейна [14. 15]:
D =(1)
6пЦГг
где k - константа Больцмана, T - температура, п ~ вязкость раствора, гг - радиус частицы в приближении ее сферичности.
В ходе ранее выполненных измерений было обнаружено, что получаемые методом ДРС распределения интенсивности по размерам частиц в образцах неразбавленной плазмы крови нестаоильны от измерения к измерению [16]. При накоплении функции корреляции в течение длительного времени (более 300 сек) такая нестабильность не исчезала. Поэтому мы накапливали большое число функций корреляции, измеренных за времена 100 200 секунд, и набирали массив распределений интенсивности по размерам частиц. Этот массив подвергался статистической обработке. При определении концентраций частиц Np различных размеров оказалось, что связь между концентрациями Np и гидродинамическими радиусами частиц r (в диапазоне от 1 до 300 нм) в двойном логарифмическом масштабе линейна:
log Np = a log r + b, (2)
где коэффициент, определяющий наклон прямой а = —3.99 ± 0.09, а коэффициент, определяющий смещение по оси ординат Ь = —5.77 ± 0.19.
Объемная доля материала частиц (белка) связана с концентрацией частиц Мр следующим соотношением: С = 4/3пг3Мр, тогда Сь ~ 1/г, то есть большая часть материала сосредоточена в самых мелких частицах (г ~ 3.2 нм). При общей объемной концентрации белков в плазме крови порядка 7%, [17] и сосредоточении основной части белков в самых мелких частицах расстояние между их центрами ~15 — 20 нм. Поэтому необходимо было проверить применимость моделей, используемых для определения гидродинамического радиуса частиц (соотношение Стокса Эйнштейна) и их концентраций (приближение РГД) в образце неразбавленной плазмы крови.
Цель настоящей работы проверить применимость соотношения Стокса Эйнштейна и приближения РГД для исследования размеров и концентраций частиц неразбавленной плазмы крови.
Для этого были определены размеры различных частиц плазмы крови, проведены оценки их концентраций и исследованы соответствия между ними в разбавленных и неразбавленных образцах. При наличии взаимодействий между частицами малых размеров в больших концентрациях, связь между концентрациями частиц, рассчитанными в приближении РГД, и их размерами, определенными по формуле Стокса Эйнштейна, может искажаться. Поэтому для проверки возможных искажений указанного соответствия проводилось сравнение графиков соответствия N — г для образцов неразбавленной и разбавленной в 10 и 100 раз размороженной плазмы крови. Если в неразбавленной плазме крови имеются упомянутые искажения, то они будут проявляться только для малых частиц, у которых концентрация наибольшая. Для частиц больших размеров, концентрация которых значительно меньше, такие искажения наблюдаться не будут. Тогда при разбавлении плазмы крови вид связи концентраций частиц и их радиусов будет меняться в области малых размеров частиц и оставаться неизменным в области больших частиц с малыми концентрациями, то есть форма графика должна измениться. Если же форма графика останется неизменной, то это будет означать, что приближение РГД и формула Стокса Эйнштейна адекватны для неразбавленной плазмы крови или их искажения малосущественны.
Результаты и их обсуждение. Гидродинамические радиусы частиц определялись методами ДРС путем разложения с помощью программы БунаГБ [18] по временам релаксации функций корреляции, полученных на установке, описанной в [19, 20]. Абсолютная интенсивность рассеяния света определялась путем сравнения полной интен-
сивности рассеяния в плазме крови с рассеянием в толуоле, коэффициент рассеяния которого принимался равным ЯТ = 1.2 • Ю-5 с м-1. Концентрации частиц определялись из абсолютной интенсивности рассеяния и распределений интенсивности по размерам частиц по формуле приближения РГД [21] для модели сферической формы частиц с относительной разностью показателей преломления (п1 — п2)/п2 = 0.013, где п1 - показатель преломления частиц, п2 - показатель преломления дисперсионной среды. Значения радиусов частиц и распределения интенсивности были получены под различными углами рассеяния (30, 40, 60, 90°).
На рис. 1 представлены графики соответствия концентраций частиц их размерам в двойном логарифмическом масштабе для образца неразбавленной плазмы крови (кружки), для образца плазмы, разбавленной в 10 раз (квадраты) и для образца плазмы крови, разбавленной в 100 раз (треугольники).
Рис. 1: Графики соответствия концентраций частиц их радиусам, полученные для образцов неразбавленной (кружки), разбавленной в 10 (квадраты) и 100 раз (треугольники) плазмы крови, полученные в предположении сферической формы частиц.
Для всех образцов плазмы крови графики соответствия концентраций частиц их размерам имеют вид, близкий к линейному, в области размеров от 1 до 300 им. Для образца неразбавленной плазмы крови коэффициенты а и Ь были следующими а = —3.98 ± 0.16, Ь = —4.56 ± 0.17; для образца плазмы крови, разбавлен ной в 10 раз: а = —3.91 ± 0.07,
Ь = —4.92 ± 0.09; для образца плазмы, разбавленной в 100 раз: а = —4.03 ± 0.05, Ь = —5.89 ± 0.07. Видно, что коэффнциент а, определяющий наклон прямой для полученных зависимостей, отличается незначительно в пределах погрешностей. Поскольку в области малых размеров частиц не обнаружено искажения линейной формы графика соответствия концентраций частиц их размерам по мере разбавления образцов, то можно заключить, что формула Стокса Эйнштейна для оценки гидродинамических радиусов частиц и формулы приближения РГД для оценки концентраций частиц в неразбавленных образцах плазмы крови адекватны.
Ь
гарифм концентраций) изменяется не пропорционально разбавлению. Так, для десяти-
Ь
образцом должен был бы уменьшиться на единицу, но он изменился лишь на 0.38, а для образца плазмы крови с разбавлением в 100 раз уменьшился на 1.33 (при ожидаемом изменении на 2). Такое несоответствие полученного смещения графика соответствия ожидаемому мо^кет быть объяснено отличием эффективного показателя преломления дисперсионной среды п2 от показателя преломления воды при достаточно большой концентрации белков в неразбавленной плазме крови. Если при десятикратном разбавлении значение п2 сильно меняется и приближается к значению п2 для воды п = 1.333 (изменение Ь на 0.38), то при следующем разбавлении ещё в 10 раз значение п2 изме-
Ь
равно ожидаемому изменению на 1.
В области размеров от 300 нм до 10000 нм наблюдается нарушение линеиности соответствия концентраций частиц их размерам для всех исследованных образцов (рис. 1). Такое нарушение может быть связано с тем, что реальные частицы с такими гидродинамическими радиусами имеют форму, отличную от сферы, или с тем, что реальные размеры, не попадающие в РГД минимумы, тем не менее могут быть зарегистрированы как находящиеся в области одного из минимумов из-за нестабильности разложения автокорреляционной функции по экспонентам.
Расчет концентраций частиц в предположении их цилиндрической формы [22] позволил получить графики соответствия концентраций частиц их гидродинамическим радиусам, близкие к линейным в двойном логарифмическом масштабе, во всем диапазоне регистрируемых размеров частиц (рис. 2). Такое сохранение линейности может свидетельствовать о том, что реальная форма больших агрегатов белков близка к цилиндрической.
Таким образом, в настоящей работе показано, что формула Стокса-Эйнштейна и приближение РГД применимы для определения размеров и концентраций частиц в неразбавленной плазме крови при исследовании ее методами ДРС. Установлено, что для образцов неразбавленной и разбавленной плазмы крови графики соответствия концентраций частиц их размерам могут быть аппроксимированы прямыми линиями в диапазоне от 1 до 300 нм в предположении сферической их формы и в диапазоне от 1 до 10000 нм - для цилиндрической формы частиц. Сохранение линейности графика во всем диапазоне регистрируемых размеров свидетельствует о том, что модель цилиндров лучше подходит для описания формы частиц большого размера, чем модель сфер. Особенности, проявившиеся при использовании разных моделей для расчета концентраций, являются предметом отдельного исследования.
Т-1-1-1 I 1 I I |-1-1-1-1 I I И |-1-1-1-1 I I I I |-1-1-1-11111
г, нм
Рис. 2: Графики соответствия концентраций частиц их размерам (длине цилиндров), полученные для образцов неразбавленной (кружки), разбавленной в 10 (квадраты) и 100 раз (треугольники) плазмы крови, полученные в предположении цилиндрической формы частиц.
Полученные результаты могут быть использованы при исследовании многокомпонентных образцов с большой концентрацией белков или иного вещества с помощью методов ДРС и для разработки диагностических методик в медицинской практике.
ЛИТЕРАТУРА
[1] К). П. Ковальчук, Л. А. Носкин, С. Б. Ланда и др.. Клинико-лабораторньтй консилиум, № 7, 21 (2005).
[2] О. Н. Здраевская, В. А. Дюк. С. Б. Ланда и др.. Клиническая лабораторная диагностика. Л"2 5, 21 (2006).
[3] Y. М. Petrusevich and G. P. Petrova, Proc. SPIE 2728(2), 2 (1996).
[4] S. G. Alekseev, A. V. Ivanov, S. V. Sviridov, et al., Proc. SPIE 5973, 597301 (2005).
[5] A. S. Lawrie, A. Albanyan, R. A. Cardigan, et al.. Vox Sang. 96(3), 206 (2009).
[6] X.-H. Zheng, C. Cui, X.-X. Zhou, et al., Chin. J. Cancer, 32(12), 667 (2013).
[7] M. Muler and W. Burchard, Int. J. Biol. Macromol. 3, 71 (1981).
[8] P. Wiltzius, G. Dietler, W. Kauzig, Biopolymers 21, 2205 (1982).
[9] R. Kita, A. Takahashi, M. Ivaibara, Biomacromolecules 3, 1013 (2002).
[10] Y. V. Ivanov. A. R. Ivarimov, L. X. Pyatnitsky, et al., J. Russ. Laser Res. 26(5), 363 (2005).
[11] В. H. Лопатин, А. В. Приезжаев, А. Д. Апонасенко и др.. Методы светорассеяния, в анализе дисперсных биологических сред (Москва, Физматлит, 2004).
[12] Н. С. Van de Hülst, Light Scattering by Small Molecules (Sew York, Wiley, 1957).
[13] J. W. S. Rayleigh, Proc. R. Soc. London A84, 25 (1911).
[14] M. Smoluchowski, Ann. Phys. 326(14), 756 (1906).
[15] A. Einstein, Ann. Phys. 324(2), 371 (1906).
[16] M. H. Маслова, И. С. Бурханов, "Статистический анализ данных, получаемых для образцов плазмы крови методами динамического рассеяния света," в: тезисы XXI Международная, научная, конференция, студентов, аспирантов и молоды, х ученых "Ломоносов-2014" (МГУ, Москва, 2014), с. 13. http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2014/2471/2471.pdf
[17] В. Марри, Р. Греннер, Д. Мейес, П. Родуэлл, Биохимия, человека (Москва, Мир, 2003); R. К. Murray, D. К. Granner, P. A. Mayer, V. W. Rodwell, Harper's Biochemistry (Xorwalk/San Mateo, Appleton and Lange, 1988).
[18] http://www.photocor.com/download/dynals/dynals-white-paper.htm.
[19] К. В. Коваленко, С. В. Кривохижа, А. В. Масалов, Л. Л. Чайков, Краткие сооб-щсния по физике ФИАН 36(4), 3 (2009).
[20] Н. Ф. Бункин, А. В. Шкирин, И. С. Б урханов и др.? Квантовая электроника 44(11), 1022 (2014).
[21] И. С. Бурханов. Л. Л. Чайков. Н. А. Булычев и др.. Краткие сообщения по физике ФИАН 41(10), 38 (2014).
[22] Т. Xeugebauer, Aun. Phys. 42(7-8), 509 (1943).
Поступила в редакцию 30 января 2015 г.
