CC BY
27
Раздел - Молекулярная медицина
Содержание и динамика в процессе лечения некоторых молекулярно-генетических маркеров в плазме крови у больных глиальными опухолями мозга по данным «жидкостной биопсии»
Регентова О.С., Щербенко О.И., Джикия Е.Л., Захаренко М.В., Сенчукова А.Л., Измайлов Т.Р., Кулинич Т.М., Боженко В.К.
ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, Москва 117997, ул. Профсоюзная, 86 Сведения об авторах
Регентова Ольга Сергеевна - к.м.н., врач-онколог детского онкологического отделения радиотерапии и комплексных методов лечения ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России
Щербенко Олег Ильич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий научно-организационным отделом ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России
Джикия Екатерина Левановна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России Захаренко Маргарита Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России
Сенчукова Анна Леонидовна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России
Измайлов Тимур Раисович - д.м.н., заведующий дневным радиотерапевтическим стационаром ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России
Кулинич Татьяна Михайловна - к.м.н., заведующая лабораторией иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России Контактное лицо
Джикия Екатерина Левановна, e-mail: [email protected] Резюме
Диффузно растущие срединные глиомы (ДГСМ) у детей - высокозлокачественные опухоли с плохими клиническими исходами. Проведение хирургического лечения, даже в объеме стереотаксической биопсии, удается лишь в 12 -15% случаев ввиду расположении опухоли в жизненно важных структурах, а ребиопсия во время прогрессирования практически не возможна. Эти сложности можно преодолеть с помощью метода «жидкостной биопсии», который позволяет определить наличие в циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) специфичных для глиальных опухолей молекулярно-генетических маркеров и проследить их динамику в процессе лучевой терапии с возможным использованием полученных данных в прогнозировании течения заболевания.
Ключевые слова: глиома, диффузные опухоли ствола голосного мозга, цифровая капельная ПЦР (ddPCR, Droplet Digital PCR), маркерные гены глиом IDH1, H3F3A, BRAF, циркулирующая в плазме крови опухолевая ДНК (цоДНК)
Content and dynamics of certain molecular genetic markers in blood plasma of patients with glial brain tumors during treatment according to "liquid biopsy" data
Dzhikiya E.L., Zakharenko M.V., Senchukova A.L., Izmailov T.R., Kulinich T.M., Bozhenko V.K. Federal State Budgetary Institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR), Moscow 117997, Profsoyuznaya, 86 Regentova O.S. - PhD, oncologist of the children's Oncology Department of Radiotherapy and Complex Methods of Treatment of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Shcherbenko O.I. - MD, Professor, Head of the Scientific - Organizational Department of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Dzhikiya E.L. - PhD, senior researcher of the Laboratory of Immunology and Oncocytology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Zakharchenko M.V. - researcher of the Laboratory of Immunology and oncocytology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Senchukova A.L. - PhD, junior researcher of the Laboratory of Immunology and Oncocytology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Izmailov T.R. - MD, Head of the day radiotherapy hospital of the FSBI "Russian Scientific Center
of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Kulinich T.M. - PhD, Head of the Laboratory of Immunology and Oncocytology of the FSBI
"Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian
Federation
Bozhenko V.K. - MD, Professor, Head of the Department of Molecular Biology and Experimental Tumor Therapy of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Summary
Diffusely growing median gliomas (DGSM) in children are highly malignant tumors with poor clinical outcomes. Surgical treatment, even in the volume of stereotactic biopsy, is possible only in 12 - 15% of cases due to the location of the tumor in vital structures, and rebiopsy during progression is almost impossible. These difficulties can be overcome with the method of "liquid biopsy", which allows to determine the presence of molecular genetic markers of cDNA specific to glial tumors in the blood plasma and track their dynamics during radiation therapy. The obtained results allow to predict the effectiveness of the treatment.
Keywords: glioma, diffuse tumors of the spinal cord, digital droplet PCR (ddPCR), marker genes of glioma IDH1, H3F3A, BRAF, circulating plasma tumor DNA (cDNA)
Введение
Поиск генетических маркеров опухоли в биологических жидкостях является перспективным для разработки методов диагностики, прогнозирования, создания таргетных препаратов и персонификации методов лечения при опухолях центральной нервной системы [1]. Это особенно важно при диффузно растущих глиомах ствола мозга (ДГСМ), при которых процедуры получения образца ткани опухоли в ходе операции или биопсии связаны с опасностью развития тяжелых осложнений [2 - 4]. Эта форма опухолей остается наиболее тяжелой онкологической патологией в детском возрасте. Многолетние поиски вариантов лечения ДГСМ пока не привели к существенным сдвигам в результатах. Фактически единственным реальным методом помощи для этой категории детей остается лучевая терапия, позволяющая в 80 - 85% случаев получить уменьшение выраженности
неврологических нарушений. Но у большинства больных достигаемый эффект имеет временный характер: через различные интервалы времени опухоль возобновляет рост и двухлетний срок переживают только 10 - 15% больных [5].
Достигнутые в последние годы успехи в использовании молекулярно-генетических характеристик опухоли для диагностики и прогнозирования течения эмбриональных опухолей мозга [6] дают надежду для достижения прогресса и при глиальных опухолях. Становится реальной перспектива использования информации о молекулярных особенностях глиом для прогнозирования течения, индивидуализации тактики и создания таргетных препаратов. В связи с этим нам представилось целесообразным при помощи метода «жидкостной биопсии» по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) изучить содержание и динамику в процессе лучевой терапии некоторых молекулярно-генетических маркеров опухоли при ДГСМ и других локализациях глиом мозга у детей.
Задача исследования состояла в изучении при помощи цифровой капельной ПЦР (ddPCR) в цоДНК частоты встречаемости мутаций в маркерных генах глиом ЮИ1, И3¥3Л, БЕЛГ и их динамики в процессе лечения, а также в сопоставлении полученных данных об изменении концентраций этих маркеров в процессе лечения с дальнейшим течением заболевания в целях определения возможности их использования в планировании и индивидуализации лечения. Материалы и методы
Были исследованы 146 образцов плазмы периферической крови, полученные от 60 пациентов, из них у 31 был установлен диагноз ДГСМ и у 29 - другие глиальные опухоли головного мозга. Определялось наличие или отсутствие мутаций БЯЛЕ (V600E), И3¥3Л (К27М) и ЮИ1 ^132Ц) в цоДНК, их концентрация и динамика в процессе лучевой терапии. Для подтверждения адекватности использования метода ddPCR в исследовании мутационного статуса опухоли, в 11 случаях результаты ddPCR сравнивались с результатами
исследования мутационного статуса по гистологическим препаратам опухоли, полученных методом секвенирования нового поколения (NGS).
Высокочувствительный скрининг мутаций BRAF (V600E), H3F3A (K27M) и IDH1 (R132H) проводили методом Digital Droplet PCR (ddPCR) с использованием наборов BRAF V600E Screening Kit (Bio-Rad, USA), ddPCR H3F3A (K28M) Screening Kit (Bio-Rad, USA) и ddPCR IDH1 (R132H) и Screening Kit (Bio-Rad, USA) и системы QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Результаты
При сравнении результатов исследования мутационного статуса по плазме крови 11 больных различными локализациями глиом методом ddPCR и их же гистологических препаратов, полученных в результате операции, методом NGS установлено полное совпадение как положительных, так и отрицательных данных. Это дало основание для использования метода ddPCR при оценке мутационного статуса опухоли по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК.
По данным ddPCR выявлена достоверная разница в частоте обнаружения мутировавших генов при ДГСМ в сравнении с другими локализациями глиом (Табл.1). Таблица 1. Сравнительная частота обнаружения соматических мутаций исследованных генов в плазме крови при диффузных опухолях ствола мозга и других локализациях глиом
Локализация опухоли Частота мутаций в исследованных генах (в %)
IDH1 H3F3A BRAF
Опухоль ствола мозга (п=31) 58,1 51,6 61,3
Другие локализации глиом (п=29) 20,0 33,3 33,3
Как видно из Табл. 1, при ДГСМ частота выявления мутаций во всех исследованных генах была почти в два раза выше, чем при других локализациях глиом.
При ДГСМ достоверно чаще, чем при глиомах других локализаций, встречалось одновременное сочетание мутаций в двух и трех генах (Табл. 2).
Таблица 2. Сочетание двух и трех мутаций в исследованных генах в зависимости от локализации опухоли
Локализация глиомы Сочетание мутаций в генах (%)
БЕЛЕ + И3Е3Л И3Е3Л + ЮИ1 БЕЛЕ + ЮИ1 + И3Е3Л
Глиомы ствола мозга 36% 42,4% 32%
Другие локализации глиом 20% 11,1% 13,3%
Так, сочетание мутаций в генах БЕЛЕ и И3Е3Л выявлено у 36% больных против 20% при других глиомах. Сочетание мутаций в генах И3¥3Л и ЮИ1 выявлено в 42,4% случаев против 11,1%. В 32% проб больных с ДГСМ имелось сочетание мутаций в трех генах, а при других глиомах это выявлено в 13,3% случаев. Скорее всего, природа такой разницы заключается в большем разнообразии гистологических форм опухолей ствола. Такие различия должны учитываться при разработке таргетных препаратов.
При сопоставлении частоты возобновления роста в объединенной группе из 47 случаев глиом всех локализаций с числом мутировавших генов установлено, что повышение частоты обнаружения мутаций гена БЕЛЕ коррелировало с более благоприятным течением процесса (Табл. 3). Однако при отдельном анализе частоты мутаций этого гена в группе
больных с ДСГМ такой закономерности не обнаружено, что можно также объяснить гетерогенностью гистологических форм опухоли этой локализации.
Таблица 3. Корреляция между частотой выявления мутации BRAF(V600E) и частотой рецидивирования глиом всех локализаций
Возобновление роста опухоли Наличие мутации BRAF (V600E) (число случаев) Всего
Мутации не выявлено Мутация выявлена
Нет 12 16 28
Имеется 12 7 19
Всего 24 23 7
В объединенной группе 42 больных с глиомами всех локализаций было изучена корреляция между частотой рецидивирования и частотой выявления мутации К27М в гене H3F3A (Табл.
4).
Таблица 4. Корреляция между частотой выявления мутации K27M гена H3F3A и частотой рецидивирования глиомы всех локализаций
Возобновление роста опухоли Наличие мутации гена H3F3A (число случаев) Всего
Мутации не выявлено Мутация выявлена
Нет 13 13 26
Имеется 12 4 16
Всего 25 17 42
Как видно из Табл. 4, выявляется обратная, чем в случае с геном BRAF, закономерность: увеличение частоты выявления мутаций гена H3F3A коррелировало с худшим результатом
лечения. При отдельном анализе по этому параметру больных с ДГСМ такой закономерности не обнаружено.
В целях выявления возможности прогнозирования течения заболевания по молекулярно-генетическим признакам нами было проведено исследование динамики содержания опухолевой ДНК в плазме крови больных ДГСМ в процессе лучевой терапии и после ее окончания. Для этого был проведен дискриминантный анализ, в котором в качестве переменных использованы данные о концентрации циркулирующих в плазме крови мутантных и дикого типа молекул опухолевой ДНК, а также ряд клинических данных. Было установлено, что по таким параметрам как возраст пациента, концентрация мутантной ДНК генов IDH1 и H3F3A, а также по соотношению мутантной ДНК к ДНК дикого типа с вероятностью до 92,8% можно прогнозировать вероятность раннего рецидива опухоли.
Прогностическую значимость имела также динамика концентрации в плазме крови генов с мутантной ДНК и ДНК дикого типа. Установлено, что соотношение концентрация ДНК гена BRAF с мутацией V600E у больных с более благоприятным течением опухоли увеличивается в начале курса радиотерапии и снижается к концу ее. У больных с ранним рецидивом опухоли к концу курса лечения концентрация этого мутантного гена, напротив, не изменяется или возрастает (Рис. 1).
График средних для т^ БРЛР груп. по номер пробы; категор. по рецидив да/нет к27м V600E ЕЙ 31 03 19 1.sta 46^*144с
<
си т
0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05
^рецидив да/нет: 0 рецидив да/нет: 1
номер пробы
1
2
3
4
Рис.1. Динамика содержания мутантных форм ДНК гена БЯЛЕ в процессе лучевой терапии в зависимости от наличия или отсутствия прогрессирования опухоли.
Обсуждение
Полученные данные свидетельствуют, что с помощью метода «жидкостной биопсии» можно определить наличие в плазме крови цоДНК специфичных для глиальных опухолей молекулярно-генетических маркеров и проследить их динамику в процессе лучевой терапии с возможным использованием полученных данных в прогнозировании течения заболевания. Тот факт, что при ДГСМ, по сравнению с глиомами других локализаций, имелась более высокая частота обнаружения цоДНК можно объяснить заведомо большей гетерогенностью структуры ДГСМ, поскольку нами использовался материал от больных ДГСМ, не имевших гистологического подтверждения структуры опухоли, в отличие от группы больных с глиомами других локализаций, все из которых имели гистологическое подтверждение. Можно предположить, что в группе больных, получавших лечение по поводу ДГСМ, имели место больные не только с глиомами, но и с опухолями, имевшими другую морфологическую структуру, хотя их клинико-рентгенологическая картина полностью
укладывалась в картину диффузно растущей опухоли ствола мозга. В любом случае различия в молекулярно-генетическом спектре ДГСМ требуют детализации этого спектра при разработке таргетных препаратов.
Различия в динамике содержания маркеров в процессе лучевой терапии у больных глиомами и ДГСМ могут быть также объяснены большей гетерогенностью структуры ДГСМ. Среди них, в частности, присутствуют опухоли, лучше поддающиеся ионизирующей радиации, в результате чего на первом этапе концентрация мутировавшей ДНК в плазме крови повышается, а по мере девитализации основной популяции клеток опухоли к концу курса лечения она снижается.
Анализ цоДНК методом цифровой ёёРСЯ выявил более высокую частоту мутаций в генах BRAF, H3F3А, IDH1 по сравнению с опухолями, локализующимися в других частях мозга (р<0,05). На основании анализа динамики уровней концентрации мутантной цоДНК в процессе лечения возможно предсказание рецидива опухоли после лучевой терапии с достоверностью 96%. Выводы
1. С помощью метода ёёРСЯ возможно выявление в плазме крови ряда молекулярно-генетических параметров глиом мозга, имеющих прогностическое значение.
2. Относительная концентрация мутаций BRAF (У600Е), IDH1(R132H), H3F3A (К27М) в плазме крови больных диффузно растущими опухолями ствола мозга выше, чем при глиомах других локализаций и отличается большим разнообразием комбинаций, что свидетельствует о большем морфологическом полиморфизме опухолей при данной локализации.
3. Повышение концентрации в плазме крови мутантной формы BRAF(V600E) и снижение концентрации мутантной формы гена H3F3A(К27М) коррелирует с лучшим прогнозом.
Список литературы
1. Fontanilles M., Duran-Peña A., Idbaih A. Liquid Biopsy in Primary Brain Tumors: Looking for Stardust! Curr Neurol Neurosci Rep. 2018. V.18. No. 3. Article ID 13. doi: 10.1007/s11910-018-0820-z.
2. Pfaff E., El Damaty A., Balasubramanian G.P., et al. Brainstem biopsy in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma in the era of precision medicine: the INFORM study experience.
Eur J Cancer. 2019. V. 114. P. 27-35. doi: 10.1016/j.ejca.2019.03.019.
3. Щербенко О.И., Кумирова Э.В., Регентова О.С. «Жидкостная биопсия» при опухолях мозга. Российский журнал детской гематологии и онкологии. 2019. Т. 6. № 2. С. 61-67.
4. Panditharatna E., Kilburn L.B., Aboian M.S., et al. Clinically Relevant and Minimally Invasive Tumor Surveillance of Pediatric Diffuse Midline Gliomas Using Patient-Derived Liquid Biopsy. Clin Cancer Res. 2018. V. 24. No. 23. P. 5850-5859. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-1345.
5. Veldhuijzen van Zanten S.E.M., Baugh J., Chaney B., et al. Development of the SIOPE DIPG network, registry and imaging repository: a collaborative effort to optimize research into a rare and lethal disease. J Neurooncol. 2017. V. 132. No. 2. P. 255--266. doi: 10.1007/s11060-016-2363-y
6. Kumar R., Liu A.P., Orr B.A., et al. Advances in the classification of pediatric brain tumors through DNA methylation profiling: From research tool to frontline diagnostic. Cancer. 2018. V. 124. No. 21. P. 4168-4180. doi: 10.1002/cncr.31583.
