CC BY
53
СКРИНИНГ ШТАММОВ ПАСТЕРЕЛЛ С ЦЕЛЬЮ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ
© Киркимбаева Ж.С.*, Бияшев К.Б., Макбуз А.Ж., Ермагамбетова С.Е., Кузембекова Г.Б., Кушалиева А.А.
Казахский национальный аграрный университет, Республика Казахстан, г. Алматы
Был произведен скрининг штаммов пастерелл по морфологическим, тинкториальным, биохимическим, а также вирулентным свойствам, в результате которого были отобраны Раз1еите11а шиНоШа 16 и Раз1еи-ге11а шиНоШа 21, как наиболее перспективные штаммы для конструирования диагностикумов.
Ключевые слова пастерелла, скрининг, PasteureИa multocida.
Пастереллез является одним из широко распространенных зоонозных инфекции в природе, вызывающих остро протекающее заболевание среди людей, сельскохозяйственных животных, грызунов и птиц [1-4]. Научный и практический интерес к пастереллезу животных обусловлен природной очаговостью, пастереллоносительством переболевших животных, появлению не только единичных случаев заболевания, но и крупных вспышек как среди домашних, так и диких животных [5-7]. Примером этого является гибель каспийских тюленей в 2001, 2007, 2009, 2011 г., гибель сайгаков в 2010-2011 годах в Западно-Казахстанской области. Эта проблема не только ветеринарии, но и медицины. Вспышки пастереллеза среди людей отмечены в г. Алматы 1995 г., в г. Костанае 1995, 2001, 2002 годы, при этом источником инфекции служили мясные продукты животного происхождения. Полиморфизм клинических проявлений, отсутствие специфичных тест систем, недостаточное внимание практикующих врачей к данной патологии снижает регистрацию этой нозологии, соответственно фактический уровень заболеваемости. В связи с этим растет значимость этой инфекции, которая определяет необходимость непрерывного наблюдения за эпидемиологической ситуацией с целью своевременной разработки соответствующих мероприятий.
Решение проблемы борьбы с пастереллезом еще осложняется тем, что патогенные пастереллы длительное время, сохраняясь в организме не только переболевших и бывших с ними в контакте здоровых животных, а также в организме синантропных животных, создают своеобразный стационарный эпизоотический очаг. Ввиду того, что прижизненные методы диагностики болезни до сих пор достаточно не разработаны, пастереллоносителей можно рассматривать как опасный источник возбудителя болезни [8]. Этот вопрос имеет очень важное значение при формировании групп животных и
* Профессор кафедры Биологической безопасности, доктор ветеринарных наук.
достижения эпизоотического благополучия по пастереллезу, особенно в крупных специализированных хозяйствах.
В настоящее время актуальным направлением является, разработка эффективных методов лабораторной диагностики, доступных для применения в практических лабораториях. Исходя из вышеизложенного следует, что есть необходимость разработки и внедрения новых чувствительных методов диагностики, применение которых позволит проводить мониторинг сельскохозяйственных и диких животных на пастереллез и обеспечить безопасность продуктов животного происхождения. Частичного решения этой проблемы можно добиться за счет правильного выбора штамма пастерелл. С этой целью мы поставили своей задачей первоначально изучить этиологическую структуру пастереллеза животных в Алматинской области. Затем изучить наиболее характерные для этого микроорганизма некоторые биологические, а имменно: морфологические, тинкториальные, биохимические и вирулентные свойства. По результатам исследования произвести отбор штаммов обладающих стабильными биологическими свойствами для дальнейшую работу.
Материалы и методы исследования
Научную работу выполняли в условиях лаборатории противобактериоз-ной биотехнологии Казахского национального аграрного университета. В работе использовали коллекционированные штаммы выделенные от больных или павших животных на протяжении 2009-2013 годов, содержащиеся в различных крестьянских хозяйствах Алматинской области.
Для исследования в лабораторию направляли трупы мелких животных, от крупных животных - сердце с перевязанными сосудами, части селезенки, печени, почек, экссудат из грудной полости и трубчатую кость. При поражении легких брали также их кусочки (5 х 5 см) на границе нормального и измененного участков, миндалины, бронхиальные, средостенные и заглоточные лимфатические узлы. Патологический материал брали от павших (не позднее 3-5 ч после гибели) или убитых животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Кроме того, были взяты смывы носовой, ротовой полостей, конъюнктивы животных с клиническими признаками пастереллеза.
Посевы из патологического материала делали в МПБ и на МПА или бульон и агар Хоттингера рН 7,2-7,4 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади. Посев в пробирки с жидкими и твердыми питательными средами проводили пастеровской пипеткой. Пробирки с посевами инкубировали при 37-38 градусов в течение 20-48 часов. Одновременно с посевами из каждого органа делали мазки - отпечатки, фиксировали 10-15 мин смесью равных объемов этилового спирта и эфира, окрашивают по Леффлеру или
Романовскому-Гимза и микроскопировали. Идентификацию выделенных культур проводили по ферментативным свойствам и подвижности.
Суточную агаровую культуру высеивали в среды Гисса с глюкозой, маннитам, сахарозой, маннозой, в ПМА, молоко, желатин, на кровяной сывороточной МПА или агар.
Хоттингера, в МПБ с 1 % нитрата калия, в среду с мочевиной Для определения редукции нитратов исследуемые культуры засевали в МПБ с 1 % нитрата калия и выращиванием в течение 48-72 ч. Затем в пробирку добавили 1 куб см 2 %-ного водного раствора крахмала, 1куб см 1 %-ного раствора йодистого калия и 1-2 капли 5 %-ного водного раствора серной кислоты и взбалтывали. Индол выявляли по методу Легаль-Вейла. Для определения уреазы в пробирку, содержащую среду с мочевиной, закапывали 2-3 капли 24-часовой изучаемой бульонной культуры. Посевы культивировали 20-24 ч. при 37 °С.
Для дифференциация серовариантов пастерелл, изучаемую 18-часовую бульонную культуру бактериологической петлей высевали на чашку Петри со свежеприготовленным 1,5 %-ным агаром Хоттингера. Посев проводили, не отрывая петли от поверхности агара, параллельными штрихами на расстоянии 7-10 мм один от другого. Затем бактериологической петлей одним штрихом по диаметру чашки, перпендикулярно нанесенным штрихам, высевали суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus (культура должна обладать хорошей гемолитической активностью, что определяют высевом ее на кровяной сывороточный МПА). Чашки с посевами инкубировали при 37 °С и через 18-24 час учитывают результаты.
Биологическое исследование проводили для определения патогенности выделенной культуры пастерелл и при необходимости с целью обнаружения возбудителя в патологическом материале. Патогенность культур определяют на белых мышах массой 16-18 °С этой целью двум белым мышам вводят подкожно по 0,2 куб. см 18-24-часовой бульонной культуры. Культуру считают патогенной, а биопробу положительной при гибели через 24-72 ч хотя бы одного из зараженных животных и выделении от него культуры пастерелл. Срок наблюдения за зараженными животными - 7 сут.
Результаты исследования
Всего к бактериологическому исследованию были подвергнуты 52 проб материала, из которых 22 получены от крупного рогатого скота, 14 - от лошадей, 9 - от мелкого рогатого скота, 3 - от свиней, 4 - от птиц. Всего было выделено 37 культуры. Из них 7 по морфологическим, физиолого-биохими-ческим, антигенным и патогенным свойствам были идентифицированы как Str. Pneumonia, 9 - P. multocida, 4 - St. aureus, 9 - Salmonella, 5 - E. coli, 3 -неидентифицированные культуры. Результаты бактериологического исследования представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты бактериологического исследования патологического материала, полученного от различных видов животных и птиц
Количество «
Вид животного проб выделенных культур ,g S о.; Str рпептот St. aureus -3 s о S CS ^ E. coli Неидентифицированные культуры
Кр. рог. скот 22 16 4 4 2 3 1 2
Лошади 14 9 1 1 1 3 2 1
Овцы 9 7 2 2 - 2 1 -
Свиньи 3 3 2 - - - 1 -
Птиц 4 2 - 1 1 -
Всего 52 37 9 7 4 9 5 3
Культурально-морфологические свойства культур пастерелл, выделенных от различных видов животных, в основном сходны. В мазках, окрашенных по Граму, имели вид мелких грамотрицательных биполярных эллипсовидных палочек, располагающихся по парно. Некоторые культуры имели палочковидную форму.
В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, обнаруживали биполярные палочки с интенсивным окрашиванием полюсов, бактерий имеют заметную капсулу.
Таблица 2
Биохимические свойства культур пастерелл, выделенных из патологического материала
Тесты Номера культур пастерелл
6 9 11 16 15 24 21 28 29
Ксилоза
Глюкоза + + + + + + + + +
Галактоза + + + + + + + + +
Мальтоза + ± ± + ± + + ± +
Лактоза
Сахароза + + + + + + + + +
Маннит ± + ± ± + ± + + ±
Сорбит + + ± + ± ± + + +
Дульцит
Индол + + + + + + + + +
Н 8
Гемолитические свойства
Восстановление нитратов + + + + + + + + +
Каталаза + + + + + + + + +
Подвижность
Разжижение желатина
Свертывание молока
Рост культуры в бульоне вызвал равномерное помутнение среды с образование пристеночного кольца на поверхности, при хранении среды в течение 2-х недель наблюдали на дне пробирки слизистый осадок, который поднимался при встряхивании в виде не разбивающейся косички с полным просветлением бульона. На МПА пастереллы образовали круглые серовато-белые S-формы колонии с ровными краями, диаметром от 1 до 3 мм.
Результаты идентификации пастерелл на основе биохимических свойств отражены в табл. 2.
Результат посева на среду Гисса показал, что пастереллы ферментируют с образованием кислоты без газа галактозу, глюкозу, мальтозу и маннит, не расщепляют лактозу, образовывают индол и не выделяют сероводород. При посеве на молоко пастереллы растут, не вызывая изменения. Не разжижали желатин и не обладают гемолитическими свойствами.
Патогенные свойства возбудителя определяли путем постановки биопробы на белых мышах. Результаты исследования представлены в табл. 3.
Таблица 3
Вирулентные свойства пастерелл, выделенных из патологического материала
Количество лаборатор- Доза введения Метод Результаты
ных животных (КОЕ) введения Пало Выжило % падежа
10 7 3 70
Pasteurella шultocida 6 10 30 в/брюш. 9 1 90
50 10 - 100
10 6 4 60
Pasteurella шultocida 9 10 30 в/брюш. 8 2 80
50 9 1 90
10 5 5 50
Pasteurella шultocida 11 10 30 в/брюш. 8 2 80
50 10 - 100
10 7 3 70
Pasteurella шultocida 16 10 30 в/брюш. 10 - 100
50 10 - 100
10 6 4 60
Pasteurella шultocida 15 10 30 в/брюш. 8 2 80
50 9 1 90
10 5 5 50
Pasteurella шultocida 24 10 30 в/брюш. 6 4 60
50 8 2 80
10 6 4 60
Pasteurella шultocida 21 10 30 в/брюш. 8 2 80
50 10 - 100
10 5 5 50
Pasteurella шultocida 28 10 30 в/брюш. 7 3 70
50 9 1 90
10 6 4 60
Pasteurella шultocida 29 10 30 в/брюш. 6 4 60
50 8 2 80
Гибель белых мышей мы наблюдали на 3-4 сутки. У белых мышей при патологоанатомическом исследовании обнаружили типичный для пастерел-леза признак - воспалительный очаг на месте инъекции, отечность подкожной клетчатки и мускулатуры, инъекция сосудов, кровоизлияния на эпикарде и паренхиматозных органах.
В мазках из паренхиматозных органов и из крови сердца, обнаруживали грамотрицательные короткие с закругленными краями эллипсовидной формы палочки с выраженной биполярностью. Затем было проведено выделение чистой культуры, которой были заражены белые мыши, с идентификацией по биохимическим свойствам.
Таким образом, из 39 культур, выделенных от животных и птиц, по особенностям культуральных, морфологических, биохимических и биологических свойств позволило 9 культур отнести к виду Pasteurella multocida. Для конструирования диагностикумов пастереллеза сельскохозяйственных животных лучше использовать изоляты Pasteurella multocida 16 и Pasteurella multocida 21, которые наиболее широко распространены среди сельскохозяйственных животных, а также обладают стабильными биологическими свойствами.
Список литературы:
1. Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease // Animal Health Research Reviews. - 2008. - Vol. 8 (2). -P. 129-150.
2. Буткин Е.И. Пастереллёз (холера) птиц. - М., 1972. - 149 с.
3. Сосов Р.Ф. Инфекционные болезни крупного рогатого скота. - 2-е изд. - М., 1974. - 360 с.
4. Ермагамбетова С.Е. Распространенность пастереллеза сельскохозяйственных животных // Матер. Международн. научно-практич. конференции. -Улан-Батор, 2001. - С. 314-316.
5. Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота: автореф. дисс. ... докт. вет. наук. - М., 1993.
6. Буткин И.Е., Юдаев А.П. Изучение свойств эпизооотических и вакцинных штаммов пастерелл // Ветеринария. - 1972. - № 8. - С. 56-57.
7. Выборнов С.К. Совершенствование диагностики и специфической профилактики пастереллеза птиц: автореф. дисс. ... канд. вет. наук: 16.00.03. -Оболенск, 2001. - 21 с.
8. Геведзе В.И. Пастереллез крупного рогатого скота. - Минск: Урожай, 1989. - С. 135-137.
