CC BY
29УДК 615.282:547.759.32:575.22
СКРИНИНГ
ПРОТИВОГРИБКОВОЙ
АКТИВНОСТИ
К АРБ A3 OA-
ЗАМЕЩЕННЫХ
СОЕДИНЕНИЙ И ОЦЕНКА
ГЕНОТОКСИЧНОСТИ
МОЛЕКУЛ-ЛИДЕРОВ
Еремина Н.В. (специалист по доклиническим исследованиям), 2Жанатаев А.К. (с.н.с.), 2Чайка З.В. (н.с.), Васильева Н.В. (директор института), 3Елинов Н.П. (проф. кафедры), Богомолова Т.С. (зав. лаб.)*, 3Выборнова И.В. (н.с.), 3Босак И.А. (врач-лабораторный миколог), Богданова Т.В. (ассистент кафедры), 3Рябинин И.А. (аспирант), ^азей В.И. (директор по доклиническим исследованиям), ^ыдкина Е.Б. (в.н.с.), 4Пурмаль A.A. (вице-президент по химическому развитию), 5Гурова Е.В. (адъюнкт-профессор), 2Дурнев А.Д. (руководитель лаб.)
1 ООО «Панацела Лабе», МО, г. Одинцово;2 ФГБУ «НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН, Москва; 3Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург; Россия; 4Cleveland BioLabs, Inc., Нью-Йорк, США;5 Roswell Park Cancer Institute, Нью-Йорк, США
©Коллектив авторов, 2013
В ряду соединений карбазолъного ряда проведен скрининг активности в отношении ряда патогенных грибов: Microsporum canis, Trichophyton rubrum, Т. mentagrophytes, Т. tonsurans, Candida albicans в условиях in vitro в диапазоне концентраций 0,125-100 мкг/мл с целью выбора наиболее активного «кандидата» для дальнейшей разработки антимикотического препарата. Наиболее низкими минимальными ингибирующими концентрациями (3,14-100 мкг/мл) обладали три соединения (CBL0100, CBL01S9, CBL02S3), антифугальные свойства самого активного соединения CBL0100 были подтверждены методом серийных микроразведений по протоколу CLSIМ38-А2 на культуре Т. mentagrophytes.
Оценка генотоксичности трех указанных соединений была проведена в тесте Эймса на штаммах Salmonella typhimurium ТА98, ТА100 и TA1S37 в вариантах с метаболической активацией S9 и без таковой в концентрациях 1,25-40 мкг/мл. Соединение CBL0100 не проявило мутагенной активности в этом тесте. Ее отсутствие у этого соединения было подтверждено методом учета повреждений ДНК (метод ДНК-комет) и хромосомных аберраций в культурах лимфоцитов периферической крови человека in vitro и клетках костного мозга мышей in vivo.
Таким образом, в результате фармакологического и геноток-сического скрининга было отобрано перспективное соединение
* Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна,
Тел.: (812) 303-51-40
CBL0100, которое обладает противогрибковой активностью и не проявляет мутагенных свойств.
Ключевые слова: антифунгальная активность, генотоксич-ность, карбазольные соединения
ANTIFUNGAL ACTIVITY SCREENING OF CARBAZOLE-SUBSTITUTED COMPOUNDS AND ASSESSMENT OF GENOTOXICITY OF LEAD MOLECULES
^erjomina N.V. (preclinical research associate), 2Zhanatayev A.K. (senior scientific collaborator),2 Chayjka Z.V. (scientific collaborator),3 Vasilyeva N. V. (director of the institute), 3Yelinov N.P. (professor of the chair), 3BogomolovaT.S. (head of the laboratory), 3 Vybornova I.V. (scientific collaborator), 3Bosak I.A. (physician - laboratory mycologist), 3Bogdanova T.V. (assistant of the chair), 3Ryabinin I.A. (postgraduate student), ^azey V.I. (preclinical director), ^ydkina E.B. (program director),4 Purmal'A.A. (vice president of chemistry),5 Gurova E.V. (associate professor), 2Durnev A.D. (head of the laboratory)
USC Panatsela Labs, MO, Odintsovo; 2V.V. Zakusov Scientific Research Institute of Farmakology of RAMS, Moscow; 3North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Medical Microbiology, St. Petersburg; Russia; Cleveland BioLabs, Inc., NY, USA; 5Roswell Park Cancer Institute, NY, USA
©Collective of authors, 2013
In order to select a lead compound for antimycotic drug development the in vitro antifungal activity of series of compounds with carbazole core was tested at concentrations 0,125-100 mg/ml against a number of pathogenic fungi (Microsporum canis, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Candida albicans). Three compounds (CBL0100, CBL0159, CBL0253) revealed the lowest minimum inhibitory concentrations (3,14-100 fig/ ml). Antifungal properties of the most active compound CBL0100 were confirmed by the microdilution method according to CLSI M38-A2 Protocol using T. mentagrophytes.
The genotoxic activity of three active compounds was evaluated using the Ames test (strains Salmonella typhimurium TA98, TA100 and TA1537 both with and without S9 metabolic activation) in concentrations of 1.25-40 mg/ml. CBL0100 did not show mutagenic activity in this test. Lack of CBLlOO-indiced mutagenicity was confirmed by DNA-comet assay and chromosome aberrations assay in vitro in human peripheral blood lymphocytes and in vivo in mouse cells.
Thus, based on the results of pharmacological and genotoxic screening CBL0100 was selected for further development because of its antifungal activity and lack of mutagenic properties.
Key words: antifungal activity, carbazole compounds, genotoxicity
ВВЕДЕНИЕ
Грибковые заболевания кожи и слизистых оболочек являются одними из наиболее распространенных инфекционных заболеваний [1]. Поверхностными микозами поражены почти 25% населения, поэтому поиск новых антифунгальных агентов является крайне важным [2]. Высокая токсичность многих антимикотических препаратов, используемых в медицинской практике, ограничивает их применение
[3]. Эти причины, а также возникновение резистентности возбудителей к существующим антимикоти-кам делает актуальным поиск новых веществ, оказывающих фунгицидное действие и не обладающих выраженной токсичностью, в том числе, генотоксич-ностью.
Перспективной группой соединений, проявляющих противомикробную активность в отношении ряда бактерий и грибов, являются производные кар-базола. Эти соединения были открыты и охарактеризованы компанией Cleveland Biolabs, Inc. [4, 5]. Механизм действия этих соединений, заключающийся в интеркаляции молекулы в двойную спираль ДНК
[4], позволяет сделать предположение об аналогичном механизме их действия против различных возбудителей инфекционных заболеваний, что снижает вероятность возникновения резистентности, однако повышает вероятность мутагенности.
Цель данного исследования - скрининг противогрибковой активности 11 производных карбазола в отношении ряда патогенных грибов и оценка гено-токсичности наиболее активных молекул-фунгицидов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все соединения выбранной группы были синтезированы компанией Dalton Pharma (Canada). Ядро всех соединений представляет собой замещенный по атому азота и нескольким атомам углерода карбазол [6]. Препарат сравнения (изоконазол) для тестов in vitro был предоставлен сотрудниками НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова Минздрава России.
Для in vitro скрининга антифунгальной активности были выбраны следующие виды грибов как наиболее часто встречающиеся возбудители поверхностных микозов [7] (по пять различных штаммов каждого вида): Microsporum canis, Trichophyton rubrum, Т. mentagrophytes, Т. tonsurans, Candida albicans. Тест-культуры были получены из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России и представляли собой клинические изоляты. Исследование осуществляли методом серийных разведений в жидкой среде Са-буро [8]. Исходные растворы готовили последовательными двукратными разведениями исследуемых веществ в диметилсульфоксиде (ДМСО), начиная с максимальной концентрации соединений - 4 мг/мл
и до минимальной концентрации - 0,0078 мг/мл. В пробирки, содержащие 975 мкл жидкой среды Сабу-ро, добавляли по 25 мкл каждого из приготовленных разведений. В каждом исследовании ставили 3 контроля: 1. культуры (975 мкл среды + 25 мкл ДМСО + 100 мкл рабочей взвеси тест-культуры); 2. питательной среды (975 мкл среды + 25 мкл ДМСО); 3. субстанции (975 мкл среды + 25 мкл исходного раствора субстанции). Все ряды подготовленных разведений с тест-культурами дерматомицетов и контрольные пробирки выдерживали при 28 °С в течение 10-14 суток до появления роста гриба в первом контроле, а подготовленные разведения с тест-культурами грибов рода Candida - при 37 °С в течение 48 часов. Минимальной фунгистатической (ингибирующей или подавляющей) концентрацией (МИК) исследуемого вещества считали разведение в последней пробирке ряда, в которой визуально отсутствовал рост микромицета. Минимальной фунгицидной концентрацией (МФК) считали минимальное разведение соединения в пробирке с визуально отсутствующим ростом тест-культуры, высев из которой на плотную питательную среду Сабуро не сопровождался ростом культуры.
МИК соединения-лидера CBL0100 в отношении культуры Т. mentagrophytes, в сравнении с изокона-золом, определяли методом серийных микроразведений по протоколу CLSI М38-А2 [9]. Тест-штамм Т. mentagrophytes РКПГ F 1457 субкультивировали на картофельно-глюкозном агаре в течение 5 суток при 30 °С, с интенсивно спорулирующей культуры делали смыв 0,85% стерильным раствором NaCl. Через 5-10 мин после оседания в пробирке крупных частиц мицелия концентрацию микроконидий гриба определяли с помощью гемоцитометра и доводили путем разбавления 0,85 % стерильным раствором NaCl до концентрации 2-103 - 6-103 КОЕ/мл (конечная концентрация в лунках микропланшета - 103- 3-103 КОЕ/мл). Исходные растворы CBL0100 в ДМСО готовили в концентрациях 12,5-6400 мкг/мл путем последовательного двукратного разбавления. Дальнейшие разведения препарата осуществляли, приливая по 0,1 мл соответствующего разведения CBL0100 в пробирки, содержащие по 4,9 мл среды RPMI-1640. Полученные разведения в объеме 100 мкл переносили в лунки 96-луночного U-образного микропланшета, после чего вносили по 100 мкл инокулюма тест-штамма. Контроли для исследования готовили следующим способом: 1) 100 мкл смеси ДМСО в среде RPMI1640 1:50 без CBL0100 и 100 мкл инокулюма (контроль инокулюма); 2) 200 мкл смеси ДМСО в среде RPMI1640 1:50 без CBL0100 (контроль среды); 3) 100 мкл 0,85 % стерильного раствора NaCl и 100 мкл смеси ДМСО и среды RPMI 1640 в соотношении 1:50 (контроль среды для спектрофотометрического определения МИК). Планшет инкубировали в течение 4 суток при 35 °С.
МИК100 (концентрацию субстанции в последней лунке, в которой отсутствует видимый рост культу-
ры гриба) определяли визуально, МИК50 (наименьшую концентрацию субстанции, при которой рост культуры уменьшается на 50% от положительного контроля) определяли спектрофотометрически (при Х=405 нм). Показатели задержки роста тест-штамма (%) для опытных лунок рассчитывали по формуле:
Y= iooo/o._^'-D^)xlOO% (Dkk — Dkc)
где: Y - величина задержки роста, выраженная в %, Dkc - значение оптической плотности неинокули-рованной среды («контроль среды»); Dkk - оптическая плотность тест-культуры в среде RPMI1640 без препарата («контроль культуры»); Di - оптическая плотность в опытной лунке с известным разведением антифунгального препарата.
Для определения МФК делали высевы на чашки Петри со средой Сабуро из лунок, в которых отсутствовал видимый рост культуры, а также из контрольных лунок, после чего инкубировали при 28 °С в течение 4 суток.
Проверку мутагенной активности трех наиболее активных соединений осуществляли с помощью теста Эймса в соответствии с Руководством по доклиническим исследованиям [10] и инструкцией производителя тест-наборов [11]. Исследование было проведено на штаммах Salmonella typhimurium ТА98, ТА100 и ТА1537 с применением наборов AmesMPFTM производства XenometrixAG (Швейцария). В экспериментах с метаболической активацией (МА) использовали лиофилизированную микросомальную фракцию S9 печени. Для предотвращения возможного токсического действия фракции S9 на штаммы ТА100 и ТА1537, в среду для экспозиции добавляли раствор S9 100/1537 Booster. Соединения исследовали в концентрациях 40,20,10, 5, 2.5 и 1.25 мкг/мл. Все тестируемые соединения растворяли в ДМСО; конечная концентрация ДМСО в среде для экспозиции составила 2%. В экспериментах без метаболической активации в качестве положительного контроля для штамма ТА98 использовали 2-нитрофлуорен (2 мкг/ мл); для ТА100 - 1ч[-оксида-4-нитрохинолин (0.1 мкг/ мл); для ТА1537 - 9-аминоакридин (15 мкг/мл). В экспериментах с метаболической активацией S9 для всех штаммов применяли 2-аминоантрацен, в конечной концентрации 5 мкг/мл. В качестве негативного контроля во всех сериях эксперимента использовали 2% ДМСО. Статистическую обработку проводили с помощью одностороннего, непарного f-критерия Стьюдента.
Перед in vitro исследованием генотоксичности была проведена прескрининговая оценка цитоток-сичности соединения, которую осуществляли методом комбинированной окраски смесью красителей акридиновый оранжевый/этидиум бромид и методом ДНК-диффузии [12].
Для оценки ДНК-повреждающей активности методом ДНК-комет в клетках периферической крови человека in vitro [10] соединение вносили в конечных
концентрациях 0.2, 0.02 и 0.002 мг/мл в суспензию клеток, включающую 1 часть цельной крови, 3 части эмбриональной телячьей сыворотки и 12 частей среды RPMI1640. В экспериментах с метаболической активацией использовали микросомальную фракцию S9 в конечной концентрации в среде 2%. В качестве позитивного контроля в эксперименте без метаболической активации применяли метилметансульфонат в конечной концентрации 4 мкг/мл, в эксперименте с метаболической активацией - 7,12-диметилбензо[а] антрацен (7,12-ДМБА) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Непосредственно перед микроскопировани-ем препараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (1:10000 в ТЕ-буфере с 50% глицерином) в течение 20 минут в темноте. Полученные с микропрепаратов изображения ДНК-комет анализировали при помощи программного обеспечения CometD (ДиаМорф, Россия). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте). С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток. Полученные показатели сравнивали с показателем для негативного контроля. Результаты обрабатывали с применением одностороннего, непарного f-критерия Стьюдента.
Культивирование клеток цельной крови для оценки кластогенной активности методом учета хромосомных аберраций в клетках периферической крови человека in vitro выполняли согласно рекомендациям [10]. Культуральная среда содержала следующие компоненты: среда RPMI 1640 - 75%, телячья эмбриональная сыворотка - 15%, цельная кровь - 10% объема. Для стимуляции деления лимфоцитов в среду вносили фитогемагглютинин в конечной концентрации 10 мкг/мл. Общее время культивирования клеток до фиксации клеточного материала составило 54 часа. Эксперименты проводили в двух вариантах:
1) тестируемое соединение в конечных концентрациях 0.2, 0.02 и 0.002 мг/мл вносили в культуру клеток на 50 час культивирования, спустя 4 часа проводили фиксацию клеточного материала; в экспериментах с метаболической активацией использовали микросомальную фракцию S9 в конечной концентрации в среде 2%, в качестве позитивного контроля в эксперименте без метаболической активации - ди-оксидин в конечной концентрации 10 мкг/мл, в эксперименте с метаболической активацией - цикло-фосфамид в конечной концентрации 20 мкг/мл;
2) тестируемое соединение в конечных концентрациях 0.5, 0.05 и 0.005 мкг/мл вносили в культу-ральную среду с покоящимися клетками перед началом культивирования (0 час) и инкубировали в течение 1 часа, по окончании клеточные суспензии дважды отмывали от тестируемого соединения (а также компонентов S9) средой RPMI-1640, добавляли фитогемагглютинин, чем стимулировали выход клеток (лимфоцитов) из стадии G0 (стадия покоя) в стадию Gl, S и далее в фазу митоза - М, и культивировали 54 часа (максимальное накопление клеток на стадии
митоза); в качестве позитивного контроля в эксперименте без метаболической активации применяли митомицин С в конечной концентрации 0.1 мкг/мл, в эксперименте с метаболической активацией — ци-клофосфамид в конечной концентрации 20 мкг/мл.
11ри ци то генетическом анализе учитывали клетки с одиночными и парными фрагментами хромосом, хромосомными и хроматидными обменами, согласно методическим рекомендациям (1974). (Статистическую обработку данных выполняли путем сравнения (j-критерий Фишера) долей поврежденных метафаз в контрольной и каждой из экспериментальных групп.
Исследование генотоксичности в экспериментах in vivo выполняли на самцах и самках мышей Ь", СВАхС57В1/6 массой 18-20 г в возрасте 8-12 недель. Метод ДНК-комет проводили в щелочной версии [13]. Исследуемое соединение растворяли в дистиллированной воде и в дозах 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили подкожно в область холки животного. В качестве негативного контроля использовали мышей, которым вводили дистиллированную воду в эквивалентных объемах. Эвтаназию животных осуществляли смещением шейных позвонков через 18 часов после введения. В качестве позитивного контроля использовали мышей, которым вводили внутрибрюшиннО метилметансульфонат, в дозе 40 мг/кг, за 3 часа до эвтаназии.
Для оценки ц итоге нети чес кой активности в клетках костного мозга мышей in vivo тестируемое соединение вводили подкожно в область холки животного: однократно, в дозах 1 и 10 мг/кг самцам мышей, с фиксацией клеточного ма териала через 24 часа после введения и в дозе 1 мг/кг самцам и самкам мышей, один раз в сутки в течение 5 дней, с фиксацией клеточного материала через 6 часов после последнего введения [10]. В экспериментах с многократным введением ВО избежание индукции локального отека тканей тестируемое соединение растворяли в физиологическом растворе. В эксперименте с однократным введением в дозе К) мг/кг, ввиду плохой растворимости в физиологическом растворе соединение растворяли в дистиллированной воде. Мышам контрольной группы вводили эквивалентный объем физиологического раствора. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид, который вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг, с эвтаназией через 24 часа после обработки. Во всех вариантах экспериментов за 2,5 часа до убоя животным вводили колхицин из расчета 2,5 мг/кг с целью подавления формирования ахроматинового веретена клеточного деления и накопления метафаз. Ци-тогенетические препараты костного мозга бедренных костей готовили стандартным суховоздушным методом (Preston R.J., 1987). Анализ проводили при увеличении хКЮО в иммерсионном масле. Учитывали клетки с ахроматическими пробелами (генами), одиночными и парными фрагментами хромосом и обменами различного типа, В отдельную категорию - клетки с множественными повреждениями
— выделяли метафазы, имеющие более пяти хромосомных повреждений. Статистическую обработку (¡-критерий Фишера) проводили путем сравнения долей поврежденных метафаз в контрольной и экс-пери ме нгальн о й гру н пах.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рисунке 1 представлены результаты скрининга фунгистатической активности соединений in vitro в виде средних значений МИК. Наибольшей фунгистатической активностью обладают соединения CBL0100, С ВТ,0159 и CBL0253. Минимальные фунги-цидные концентрации для э тих соединений находятся в пределах 3,14-25 мкг/мл - для CR 1,0100, 12,5-100 мкг/мл — для CBI.0159 и для CR1,0253 в отношении различных патогенных грибов, включенных в исследование, Эти три наиболее активных соединения были выбраны для дальнейших исследований гено-токсической активности.
Ш1
J» л"1 J? J? „-<? sS' А*
<? </ / у / <f <é é / /
Испытуемые соединения
о Wcrosporum п Trichophyton ш Trichophyton ■ Trichophyton ■ Candida
canls mentagrophytes tonsurans nibrvm albtcains
Рис. 1. Фунгистатическая активность {МИК, мкг/мл) наиболее эффективных соединений в отношении дер матом и-цетов и Calbicans in vitro
Результаты определения минимальной ингиби-рующей и минимальной фунгистатической концентраций CBL0100 и изоконазола в отношении тесг-культуры Т. mentagrophytes PKI IT F 1457 представлены в таблице 1,
Таблица 1.
Минимальные ингибирующие и минимальные фунгицидные концентрации Изоконазола и CBL0100 в отношении штамма Г. mentagrophytes РКП Г F1457,
определенные методом микроразведений (С 1.51 М38-А2) и методом серийных разведений в жидкой среде Сабуро (МР №2)
Концентрации ¡мкг/мл)
Препарат asi М38-А2 MP №2
МИ К SO МИМО МИК 100 МФК МИК МФК
Изоконазол 0,75 1,0 4,0 4,0 1,57 6,25
сшпоо 0,375 0,5 0,5 0,5 12,5 25
МИК и МФК CBL0100 были ниже таковых для изоконазола в 2-8 раз. Как следует из представленных данных, CBL0100 проявил более высокую анти-фунгальнуЮ активность in vitro в отношений протестированной тест-культуры, чем изоконазол.
В ходе генотоксического исследования отобранных соединений в тесте Эймса было установлено, что
соединение CBL0253 проявляет мутагенную активность при тестировании на штаммах ТА98 и ТА100 с метаболической активацией S9 и без таковой и на штамме ТА1537 - в условиях с метаболической активацией; соединение CBL0159 проявляет мутагенную активность при тестировании на штаммах ТА98 без метаболической активации S9 и на штамме ТА1537 - в вариантах с метаболической активацией S9 и без таковой; соединение CBL0100 во всех тестируемых концентрациях, не вызывающих цитотоксического эффекта, не проявляет мутагенную активность при тестировании на штаммах ТА98, ТА100 и ТА1537 в вариантах с метаболической активацией S9 и без таковой.
В таблице 2 представлены результаты цитоток-сичности соединения CBL0100 in vitro. В качестве высшей концентрации при тестировании была отобрана концентрация 0.2 мг/мл. Как в тесте комбинированной окраски смесью красителей акридиновый оранжевый/этидиум бромид, так и в тесте методом ДНК-диффузии тестируемое соединение не оказывало цитотоксического действия на клетки периферической крови человека.
Таблица 2.
Цитотоксическое действие соединения CBL0100 на
клетки периферической крови человека in vitro
Метод/условия эксперимента Кони ентрация CBL0100, мг/мл
0 1 0,2 0,04 0,008 0,0016
Комбинированная окраска АО/ЭБ* 97.9** выпадение в осадок 99.3 100 99.6 96.4
Комбинированная окраска АО/ЭБ;+59 99.8 98.9 99.3 98.9 95.1
Метод ДНК-диффузии 98.7 100 100 98.2 96.7
Метод ДНК-диффузии; +59 99.0 98.7 97.6 98.0 95.7
* - акридиновый оранжевый/этидиум бромид; ** живых клеток (%)
Проведение этих экспериментов было необходимо для определения концентраций исследуемого вещества в генотоксических тестах in vitro. Исходя из представленных в таблице 2 данных, для дальнейших экспериментов в тесте на индукцию ДНК-повреждений методом ДНК-комет in vitro и в тесте на индукцию хромосомных аберраций in vitro были отобраны концентрации соединения 0.2, 0.02 и 0.002 мг/мл. В дальнейшем было выявлено, что при 1 и 3-х часовой экспозиции, в условиях с метаболической активацией S9 и без таковой, соединение CBL0100 не индуцирует ДНК-повреждения в клетках периферической крови человека в выбранных концентрациях, однако полностью подавляет митотиче-скую активность клеток, поэтому оценку кластоген-ной активности методом учета хромосомных аберраций проводили в меньших концентрациях - 0.5,0.05 и 0.005 мкг/мл, с внесением соединения перед началом культивирования и отмывкой культур от соединения через 1 час инкубирования. В концентрации 0.5 мкг/ мл соединение CBL0100 также полностью подавляло митотическую активность клеток, однако в концентрациях 0.005 и 0.05 мкг/мл соединение не проявило
антимитотической активности. При этом уровень хромосомных аберраций составил 1,7±0,7 и 3,8±1,0% аберрантных метафаз в эксперименте без метаболической активации и 2,0±0,8 и 1,8±0,7% в условиях с метаболической активацией S9 соответственно. При статистическом сравнении полученных показателей с показателем негативного контроля не выявили статистически значимых отличий.
Исходя из полученных данных об отсутствии ДНК-повреждающей активности соединения при 1 и 3-х часовой экспозиции, целесообразным представилось в экспериментах in vivo методом ДНК-комет соединение CBL0100 исследовать при 18-часовой экспозиции. По результатам проведенного исследования, представленного в таблице 3, можно заключить, что соединение CBL0100 в дозах 0.1, 1 и 10 мг/ кг не обладает генотоксической активностью в клетках костного мозга, печени, почек и крови экспериментальных животных.
Таблица 3.
Влияние соединения CBL0100 на уровень ДНК-повреждений в клетках костного мозга, печени, почек и крови экспериментальных животных (данные представлены в виде среднего значения поврежденных
клеток и его среднеквадратического отклонения)
Группа Клетки костного мозга Клетки печени Клетки почек Клетки крови
Негативный контроль 4.6+2.1 4.7+1.4 3.8+1.6 2.6+1.0
CBL0100,0.1 мг/кг 3.4+0.8 2.5+0.3 4.0+1.0 2.3+0.8
CBL0100, 1 мг/кг 3.2+0.5 2.8+0.8 3.3+0.9 2.4+0.5
CBL0100, 10 мг/кг 4.5+1.4 5.4+1.8 4.7+2.5 3.3+0.8
Метил метансуль-фонат, 40 мг/кг 14.7*+2.6 16.1*+1.8 20.6*+0.2
* - р<0.01 по сравнению с негативным контролем
Результаты оценки цитогенетической активности в клетках костного мозга мышей in vivo представлены в таблице 4. Соединение CBL0100 в дозах 1 и 10 мг/кг не обладает цитогенетической активностью в клетках костного мозга мышей.
Таблица 4.
Влияние соединения СВ1.0100 на уровень хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей
Условия эксперимента клеток на 100 клеток Всего поврежденных мета-фаз (%) Р
ге-пов одиночных фрагмент. парных фрагмент. обменов клеток с МП*
Самцы
Контроль 500 0.4 0.8 0 0 0 1.2+0.5
Циклофосфа-мид 20 мг/кг 500 1.2 16.6 0.6 2.4 7.6 21.6+1.8 рк <0.001
CBL0100 1 мг/кг, однократно 500 0.6 0.4 0 0 0 1.0+0.5 рк >0.05
CBL0100 10 мг/кг, однократно 500 0.2 1.4 0 0 0 1.6+0.6 рк >0.05
CBL0100 1 мг/кг, 5-кратно 500 0.4 0.8 0 0 0 1.2±0.5 рк >0.05
Самки
Контроль 500 0.8 0.4 0 0 0 1.2±0.4
CBL0100 1 мг/кг, 5-кратно 500 0.6 0.8 0 0 0 1.4+0.4 рк >0.05
Рк - при сравнении с негативным контролем
МП* - клеток с множественными повреждениями (более 5 на метафазу)
ОБСУЖДЕНИЕ
Результатом проведенных исследований стал выбор молекулы-кандидата CBL0100, а также проверка его мутагенных свойств в экспериментах in vitro и in vivo.
МИК молекулы-лидера (3,14 - 50 мкг/мл) в отношении спектра патогенных грибов сравнима с МИК субстанций, входящих в качестве активного компонента в противогрибковые препараты для лечения дерматомикозов, лидирующих в настоящее время на рынке - изоконазола (0,39-12,5 мкг/мл) [14] и итраконазола (0,0625 - 16 мкг/мл) [15]. Тот факт, что соединение активно в отношении большого числа патогенных грибов, свидетельствует о том, что препарат будет обладать широким спектром действия, а низкий МИК позволит создать препарат с низкой
эффективной концентрацией активного соединения.
Отсутствие мутагенной активности в проведенных тестах свидетельствует о том, что соединение CBL0100 может быть допущено к дальнейшим испытаниям по программе доклинических исследований в соответствии с рекомендациями руководства [10]. Однако соединение CBL0100 проявляло цитостати-ческое влияние на делящиеся клетки в концентрациях, соответствующих его МИК и МФК, что может быть косвенно связано с его механизмом фунгиста-тического и фунгицидного действий.
Чаще всего антимикотический эффект достигается за счет взаимодействия лекарственных веществ с клеточной стенкой гриба, тогда как механизм действия CBL0100, вероятно, связан с интеркаляцией в молекулу ДНК клетки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании результатов проведенного исследования можно заключить, что CBL0100 обладает высокой антифунгальной активностью в отношении Microsporum canis, Т. rubrum, Т. mentagrophytes, Т. tonsurans, С. albicans и не проявляет нежелательные генотоксические свойства. Таким образом, представляется перспективной дальнейшая разработка соединения CBL0100 в качестве эффективного анти-микотика без генотоксической активности.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Иванова М.А., Огрызенко Е.В., Бендриковская И.А. и др. Динамика заболеваемости дерматомикозами в Российской Федерации в 2003-2007 гг. // Клиническая дерматология и венерология. - 2009. - №2 - С. 26-31.
2. Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова А.П. Дерматоматомикозы. - СПб.:МАПО, 2003. - 158 с.
3. Иванова А .В., Баранцевич Е.П., Шляхто Е.В. Резистентность грибов-патогенов к антимикотикам (обзор)//Про-блемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №1. - С. 14-17.
4. Gasparian A.V., et al. Curaxins: Anticancer Compounds That Simultaneously Suppress NF-kB and Activate p53 by Targeting FACT// Science Translation Medicine. - 2011.- Vol. 3. - 95ra74.
5. Gurova K.V., Hill J. E., Guo C., et al. Small molecules that reactivate p53 in renal cell carcinoma reveal a NF-kBdependent mechanism of p53 suppression in tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2005. - Vol. 102. - P. 17448-17453.
6. Патент PCT/US2009/0S9SS8 «Carbazole compounds and therapeutic uses of the compounds» (авторы: Tucker J., Sviridov S., Brodsky L., et al.) от 15.04.2010 г.
7. Елинов Н.П., Васильева Н.В., Разнатовский К.И. Дерматомикозы, или поверхностные микозы кожи и её придатков - волос и ногтей. Лабораторная диагностика // Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т. 10, №1. - С. 27-34.
8. Методические рекомендации №2 «Микологическое исследование объектов окружающей среды и определение противогрибковой активности различных веществ». - СПб., 2008.
9. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi M-38-A2. - CLSI, USA, 2008.
10. Руководство no экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Изд-во «Медицина», 2005.
11. Fluckiger-Islera S., Baumeisterb М., Braun К., et al. Assessment of the performance of the Ames II™ assay: a collaborative study with 19 coded compounds// Mutation Research. - 2004. - Vol. 558, №1-2. - P. 181-197.
12. Vasquez M.Z. Combining the in vivo comet and micronucleus assays: a practical approach to genotoxicity testing and data interpretation// Mutagenesis. - 2010. - Vol. 25, №2. - P. 187-199.
13. Жанатаев A.K., Никитина B.A., Воронина E.C., Дурнев А.Д. Методические аспекты оценки ДНК-повреждений методом ДНК-комет// Прикладная токсикология. - 2011. - № 2(4). - С. 28-37.
14. Васильева Н.В. и др. Результаты многоцентрового наблюдательного проспективного исследования по оценке эффективности, безопасности и переносимости крема Травоген® (изоконазол) и крема Травокорт® (изоконазол, диф-лукортолон) у больных ограниченными микозами кожи разной этиологии и локализации // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т. 11, №1. - С. 15-21.
15. Патент ЕР2293787А1 «Nanoemulsions for treating fungal, yeast and mold infections» (авторы: Baker J.R., Flack M.R., Ciotti M., Sutcliffe J.A) от 16.03. 2011 г.
Поступила в редакцию журнала 19.09.2013
Рецензент: О.В. Аак
