CC BY
103
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 14 (18)2009
IZ VESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 14 (18)2009
УДК 577.3
скрининг МУТАЦИЙ ГЕНА-ОНКОСУПРЕССОРА Р53 МЕТОДОМ ТЕМПОРАЛЬНО-ТЕМПЕРАТУРНОГО ГРАДИЕНТНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКРОФОРЕЗА (TTGE)
© А. К. ВЕЛИЧКО*, А. А. НЕДОРУБОВ*, М. Т. ГЕНГИН*, В. Г. БЕЗЛЕПКИН** *Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г.Белинского,
кафедра биохимии **Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН е-mail: [email protected]
Величко А.К., Недорубов А.А., Генгин М.Т., Безлепкин В.Г. - Скрининг мутаций гена-онкосупрессора методом темпорально-температурного градиентного гель-электрофореза // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского.
2009. № 14 (18). С. 49-52. - Представлена методика детекции мутаций в гене-онкосупрессорер53 с помощью метода темпорально-температурного градиентного гель-электрофореза (TTGE). TTGE - метод скрининга мутаций, позволяющий разделить фрагменты ДНК, отличающиеся только одной парой оснований, в соответствии с их температурами плавления в денатурирующих условиях. Метод основан на постоянной концентрации денатуранта и температурном градиенте на протяжении всего процесса электрофоретического разделения. Это обеспечивает преимущество TTGE перед другими методами, делая его более точным и надёжным. Ключевые слова: детекция мутаций
Velichko A.K., Nedorubov A.A., Gengin M.T., Bezlepkin B.G. - Mutation screening of the p53 gene-oncosup-pressor by temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) method// Inz. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2009. № 14 (18). С. 49-52. - A protocol for detection of mutation in the p53 gene using temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) is described. TTGE is a mutation detection technique that separates DNA fragments differing by single base pairs according to their melting properties in a denaturing gel. It is based on constant denaturing conditions in the gel combined with a temperature gradient during the electrophoretic run. The results is a rapid and sensitive screening that is easily set up in smaller laboratory environments. Keywords: mutation detection
Недавние исследования показали, что мутации в гене-онкосупрессоре р53 могут быть общим генетическим маркером для большинства онкологических заболеваний человека [13, 18] и вовлечены во многие формы неопластической трансформации клеток [13, 24, 8]. Мутации гена р53 могут происходить на всём его протяжении [17]. Однако существуют так называемые «горячие точки», в которых уровень изменчивости повышен [21, 23].
Для р53 установлено множество полиморфизмов, при этом полиморфизмы 3, 6 интронов и 4 экзо-на считаются вовлеченными в канцерогенез [30, 2, 32]. наиболее широко изучен полиморфизм в кодирующем участке гена р53 (4 экзон, А^72Рго полиморфизм). Есть сведения о его ассоциации со злокачественными новообразованиями различных локализаций [25, 3].
В большинстве случаев неоплазии дисфункция р53 связана с мутациями в ДНК-связывающем домене гена [27].
данные о полном спектре возможных мутаций р53 могут дать понимание различных эндо и экзогенных процессов вызывающие эти дефекты [19]. Эта информация необходима для оценки степени агрессивности опухоли или терапевтического ответа [1, 6, 10, 28, 29].
В дополнение к последующему сиквенсу, используются различные методы детекции мутаций в р53: SSCP (метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) [15, 20], DDGE (метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза) [9], CDGE (метод постоянно денатурирующего гель-электрофореза) [5, 14], CDCE (метод постоянно денатурирующего капиллярного гель-электрофореза) [4, 16], а также ТTGE (метод темпорально-температурного градиентного гель-элекрофореза).
Метод TTGE основан на различии характеристик плавления нормальных и мутантных копий фрагментов ДНК в форме их гомо- и гетеродуплексов, и соответственно на изменении их электрофоретической подвиж-
ности в геле при повышении температуры в определённом диапазоне. Он сочетает в себе максимальное разделение ПЦР-продукта, которое достигается расчётом константы денатурации, используемым в CDCE, в сочетании с временным температурным градиентом [11, 22]. В ходе электрофореза за счёт создания денатурирующих условий фрагменты ДНК плавятся в соответствии со специфичной нуклеотидной последовательностью, что проявляется в снижении их подвижности. В TTGE разделение фрагментов, различающихся, по меньшей мере, 1 парой оснований, улучшается за счёт добавления к одному типу денатуранта дополнительных денатурирующих условий, а именно температурного градиента. В течение электрофореза температура равномерно
ПЦР осуществляли в амплификаторе MiniCycler PTC-150 (MJ Research, Inc., Великобритания) и «Тер-цик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия) (Techne, Duxford, Cambridge, UK). 40 циклов ПЦР включали расплавление при 940С в течение 30 секунд, отжиг для 4 экзона - 60°С, 5экзона - 64°С, 8 экзона - 60°С течение 30 секунд и элонгацию при 720С в течение 60 секунд.
Амплифицированные фрагменты гена р53 подвергали процедуре денатурации-отжига, для образования (в случае мутации) гетеродуплексов. Программа денатурация-отжига заключалась в снижение температуры от 95°С до 50°С с шагом 1°/мин. Образец ДНК (10 pl) наносится с загрузочным буфером -2х Gel Loading Dye, содержащим 2% бромфенол синий, 2% ксиленцианол, 1% глицерин.
TTGE для амплифицированных фрагментов гена р53 проводили в соответствии с следующими условиями:
Для 4 экзона - 8% акриламидный гель, 7М мочевина, диапазон температуры 62-68°С, шаг изменения 0,5°/час, напряжение 100В. 5 экзон - 12% акри-ламидный гель, 7М мочевина, диапазон температуры 62-70°С, шаг изменения 1,5°/час, напряжение - 110В. 8 экзон - 9% акриламидный гель, 7М мочевина, диапазон температуры 57-66°С, шаг изменения 1°/час, напряжение - 110В. После завершения электрофореза гель окрашивали в течение 15 мин в растворе бромистого этидия (100 мкл 1%Stock на 200 мл 1,75х ТАЕ буфера). Гели визуализировались на УФ-трансиллю-минаторе и фиксировались с помощью гельдокумен-тирующей системы Doc Print (Vilber Lourmat Systems Inc., Франция).
увеличивается, представляя собой линейную функцию зависимости от времени [7, 31, 26].
Целью нашей работы было разработать методику скрининга мутаций в гене-онкосупрессоре р53 используя TTGE.
материал и методика
ПЦР-смесь имела следующий состав: 1x ПЦР-буфер: 10 мМ Трис-HCl (pH 9.0), 50мМ KCl, 1 мл/л Triton X-100 или 15мМ Трис-HCl (pH 8.8), 67мМ (NH4)2S04, 0,01% Tween-20; MgCl2 - варьируется, 0,2 мМ каждого из dATP, dGTP, dTTP и dCTP, 10 пмоль каждого праймера, 1 U Taq-ДНК-полимера-зы и 20 нг геномной ДНК.
результаты и обсуждение
Для скрининга генетической изменчивости по конкретным локусам необходима их амплификация с помощью ПЦР. Ампликоны, подвергающиеся дальнейшему анализу не должны содержать неспецифических продуктов, для чего необходим начальный подбор оптимальных условий проведения реакции.
Одной из целей работы была оптимизация проведения ПЦР четвёртого, пятого и восьмого экзонов гена р53 с использованием сухого набора реагентов GenePak®PCR Core (kits) и систем амплификации основанных на фирменных препаратах (Fermentas) включающих TAQ-полимеразу (5 U/мкл), MgCl2 (25mM), KCl и (NH4)2S04 буферы. В качестве ДНК матрицы были использованы препараты ДНК, выделенные из периферической крови здоровых доноров методом Gupta R.S [12].
Методика оптимизации проведения PCR включает в себя несколько этапов:
1. определение температуры отжига праймеров
2. Проведение PCR используя условия рекомендованные производителем набора
3. Подбор оптимальной температуры отжига
4. Подбор оптимальной концентрации MgCl2
На рис. 1 приводится электрофореграмма продуктов ПЦР для 4, 5 и 8 экзонов гена р53 при оптимальных условиях, т.е. при получении гомогенного ПЦР-продукта. Для 4 экзона это 60°С температура отжига праймеров, 1,5 мМ Mg2+, Taq-KCl буфер. Для 5 экзона это 64°С температура отжига праймеров (прямой праймер с GC-клэмпом), 1,0 мМ Mg2+, Taq-NH4 буфер. Для 8 экзона это 60°С температура отжига праймеров, 2,0 мМ Mg2+, Taq-KCl буфер.
последовательности праймеров для PCR
Таблица 1.
район прямой праймер обратный праймер размер ампликона
P53(4) 5'TGCTCTTTTCACCCATCTAC3' 5'ATACGGCCAGGCATTGAAGT3' 353
P53(5) 5'GC . - TTCCACACCCCCGCCCG3' clamp 5'GCCCTGTCGTCTCTCCA3' 181
P53(8) 5'TTCCTTACTGCCTCTTGCTT3' 5'CGCTTCTTGTCCTGCTTGCT3' 201
Последовательность GC , - 5'CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG3'
^ clamp
БИОХИМИЯ ►►►►►
довательности. С помощью полученного графика можно определить температуры начала и конца плавления, а также установить скорость нагрева и время проведения TTGE-анализа индивидуально для каждого исследуемого фрагмента ДНК.
Рис.1. Амплификация 4, 5 и 8 экзонов гена р53. Электрофорез в 7% РДДв геле. Гель окрашен бромистым этидием.
Область температур плавление амплифициро-ванных фрагментов гена р53 определяли с помощью программного обеспечения WinMelt (Bio-Rad Laboratories). Программа строит график зависимости температуры плавления фрагмента от нуклеотидной после-
Рис.2. ТТвЕ-анализ продуктов амплификации 4, 5 и 8 экзонов гена р53 у людей контрольной и онкологической групп. Регистрируемая мутация (+), отсутствие мутации (-).
В табл. 2 приведены условия TTGE-анализа подобранные для 4, 5 и 8 экзонов.
таблица 2.
условия проведения TTGE-анализа
район диапазон Температур, °с скорость нагрева °с/Ь мочевина, м Акриламид, %
Р53(4) 62-68 0,5 7 8
Р53(5) 62-70 1,5 7 12
Р53(8) 57-66 1 7 9
Для проверки работоспособности метода PCR-TTGE по выявлению мутаций в гене р53, подобный анализ был проведён на нескольких донорах. Образцы крови были взяты у пациентов с раком молочной железы в период до и после радио и химиотерапии, а также у здоровых доноров.
На рис. 2 представлена TTGE-электрофореграм-ма продуктов амплификации 4, 5 и 8 экзонов гена р53. Видно, что методом PCR-TTGE можно детектировать мутации в исследуемых локусах геномной ДНК, которые в подавляющем большинстве присутствуют в образцах онкологических больных, как до, так и после химио- и радиотерапии. В группе здоровых доноров мутации также выявляются, но с меньшей частотой.
Таким образом, подобранные условия ПЦР-TTGE позволяют осуществлять этим методом эффективный скрининг мутаций ядерной ДНК и конкретно генов, дефекты которых приводят к злокачественному перерождению клеток.
список литературы
1. Aas T., Borresen A,-L., Geisler S. et al. Specific p53 mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast, cancer patients // Nat. Med. 1996. №2. P. 811-814.
2. Avigad S., Barel D., Blau О., Malka A., Zoldan M., Mor C., Fogel M., Cohen I.J., Stark B., Goshen Y., SteinJ., Zaizov R. A novel germ line p53 mutation in intron 6 in diverse childhood malignancies // Oncogene. 1997. №14(13). P. 1541-1545.
3. Biros M.H., Adams J.G. AEM-state of the journal, 2001. Academic emergency medicine // Acad. Emerg. Med. 2001. V. 8. P. 904-906.
4. Bjorheim J., Gaudernack G., Ekstron P. o. Mutation analysis of TP53 exons 5-8 by automated constant denaturant capillary electrophoresis // Tumour Biol. 2001. № 22. P. 323-327.
5. Borresen A.-L., Hovig E., Smith-Sorensen B. et al. Constant denaturant gel electrophoresis as a rapid screening
technique for p53 mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. № 88. P. 8405-8409.
6. Borresen-Dale A.-L., Lothe R. A., Meling, G. L., Hainaut, P., Rognum, T. O., Skovlund et al. TP53 and long-term prognosis in colorectal cancer: mutations in the L3 zinc-binding domain predict poor survival // Clin. Cancer Res. 1998. №4. P. 203-210.
7. Borresen-Dale A.-L., Lystad S., Langeroed A. Temporal temperature gradient electrophoresis on the DCode system // Biorad Bull. 1997. P. 2133.
8. Brash D.E., Rudolph A.R., Simon J.A., Lin A. et al. A role for sunlight in skin cancer: UV-induced p53 mutations in squamous cell carcinoma //Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. №88. P. 10124-10128.
9. Fischer S. G., Lerman L. S. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. № 80. P. 1579-1583.
10. Geisler S., Lining P. E., Aas T. et al. Influence of TP53 gene alterations and c-erbB2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer // Cancer Res. 2001. № 61. P. 2505-2512.
11. Gelfi C., Cremonesi L., Ferrari M., Righetti P. G. Temperature-programmed capillary electrophoresis for detection of DNA point mutations // BioTechniques. 1996. № 21. P. 926-932.
12. Gupta R.S. Griseofulvin resistance mutation of Chinese hamster ovary cells that affects the apparent molecular weight of a congruent to 200,000-dalton protein // Mol Cell Biol. 1984. № 4(9). P. 1761-1768.
13. Hollstein M., Sidransky D., Vogelstein B., Harris C.C.. p53 mutations in human cancers // Science. 1991. № 253. P. 49-53.
14. Hovig E., Smith-Sorensen B., Brogger A., Borresen, A.-L. Constant denaturant gel electrophoresis, a modification of denaturing gradient gel electrophoresis in mutation detection // Mutat. Res. 1991. № 262. P. 63-71.
15. Karim S., Ali A. // WorldJ Gastroenterol. 2009. № 15(11). P. 1381-1387
16. Khrapko K., Hanekamp J. S., Thilly, W, G., Belenkii A., Foret F., Karger B. L. Constant denaturant capillary electrophoresis (CDCE): a high resolution approach to mutational analysis // Nucleic Acids Res. 1994. № 22. P. 364-369.
17. Krypuy M., Ashour A.A., Etemadmoghadam D. // BMC Cancer. 2007. № 7. P.168
18. Levine A.J., Momand J., Finlay C.A.. The p53 tumour suppressor gene // Nature. 1991. №351. P. 453-456.
19. Martin A., Facchiano A.M., Cuff A.L. et al. Integrating mutation data and structural analysis of the TP53 tumor-suppressor protein // Hum. Mutat. 2002. P. 149-164.
20. Orita M., Suzuki Y., Sekiya T., Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction // Genomics. 1989. № 5. P. 874-879.
21. Petitjean A., Mathe E., Kato S., Ishioka C., Tavtigian S.V., Hainaut P., Olivier M. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor pheno-type: lessons from recent developments in the IARC TP53 database //Hum Mutat. 2007. № 28(6). P. 622-629.
22. Riesner D., Steger G., Zimmat E. et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of con-formational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions // Electrophoresis. 1989. № 10. P. 377-389.
23. Royds J.A., Iacopetta B. p53 and disease: when the guardian angel fails // Cell Death Differ. 2006. №13(6). P. 1017-1026.
24. Sidransky D., Eschenbach A.V., Tai Y.C. et al. Identification of p53 mutations in bladder cancer and urine samples // Science. 1991. № 252. P. 706-709.
25. Själander A., Birgander R., Hallmans G. et al. p53 polymorphisms and haplotypes in breast cancer // Carcino-genesis. 1996. Vol. 17. P. 1313-1316.
26. Sorlie T., Johnsen H., Vu P. et al. Mutation screening of the TP53 gene be temporal temperature gradient gel electrophoresis // Methods Mol. Biol. 2005. V. 291. P. 207-216
27. Vogelstein B., Lane D., Levine A.J. Surfing the p53 network // Nature. 2000. № 408(6810). P. 307-310.
28. Wallace-Brodeur R. R., Lowe S. W. Clinical implications of p53 mutations // Cell. Mai Life Sci. 1999. № 55. P. 64-75.
29. Wattel E., Preudhomme C., Hecquet B. et al. p53 mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignancies // Blood. 1994. № 84. P. 3148-3157.
30. Wu M.H., Yung B.Y. UV stimulation of nucleophos-min/B23 expression is an immediate-early gene response induced by damaged DNA // J. Biol. Chem. 2002. № 277(50). P. 48234-48240.
31. Zoller P., Redila-Flores T., Chu D., Patel A. Temporal temperature gradient electrophoresis-a powerful mutation screening technique // Biomed. Prod. 1998. №9.
32. Гервас П. A. // Автореф. дисс. ... к.м.н. Томск, 2007.
