CC BY
0
https://doi.org/10.17116/molgen20224003113
Системы адаптивного иммунитета бактерий: связь с самосинтезирующимися транспозонами, полифункциональность
© Т.С. ИЛЬИНА
ФГБУ «Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия РЕЗЮМЕ
Микробные клетки постоянно подвергаются угрозе вторжения чужеродных генетических элементов. Существует множество мобильных генетических элементов (МГЭ) — вирусы, плазмиды, транспозоны и др., которые проникают в них. Такое селективное давление провоцировало выработку у бактерий и других микроорганизмов различных защитных систем, таких как рестрикция—модификация, абортивная инфекция, исключение суперинфекции фагов, токсин-антитоксиновые модули, белки-аргонавты, адаптивный иммунный ответ. В представленной статье мы рассмотрим системы адаптивного иммунитета бактерий и архей (CRISPR-Cas), их сложную организацию и функционирование, данные об их происхождении, связанном с новым классом транспозонов — самореплицирующимися каспозонами и другими МГЭ, их роли в регуляции генов вирулентности и других важных бактериальных функций, а также данные о выработке у МГЭ-систем, противостоящих адаптивному иммунитету.
Ключевые слова: CRISPR-Cas системы, Cas-белки, каспозоны, анти-CRISPR, Acr белки. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРЕ:
Ильина Т.С. — https://orcid.org/0000-0003-0728-5427; e-mail: [email protected] Автор, ответственный за переписку: Ильина Т.С. — e-mail: [email protected]
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Ильина Т.С. Системы адаптивного иммунитета бактерий: связь с самосинтезирующимися транспозонами, полифункциональность. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2022;40(3):13—21. https://doi.org/10.17116/molgen20224003113
Adaptive immunity systems of bacteria: connection with self-synthesizing transposons, polyfunctionality
© T.S. ILYINA
Gamaleya National Center of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Public Health of Russia, Moscow, Russia ABSTRACT
Microbial cells are constantly threatened by invasion of foreign genetic elements. There are many mobile genetic elements (MGE), including viruses, plasmids, transposons, that invade them. This provoked the development of various defense systems in bacteria and other microorganisms, such as restriction and modification, abortive infection, exclusion of phage superinfection, toxin-antitoxin modules, argonauts proteins, and an adaptive immune response. In this article, we will consider the systems of adaptive immunity of bacteria and archaea (CRISPR-Cas), their organization and functioning, data on their origin associated with self-replicating transposons of bacteria, casposons, and other MGE, their role in the regulation of virulence genes and other important bacterial functions, as well as data on the development of MGE systems opposing adaptive immunity.
Keywords: CRISPR-Cas systems, Cas proteins, self-synthesizing casposons, anti-CRISPR Acr proteins. INFORMATION ABOUT THE AUTHOR:
Ilyina T.S. — https://orcid.org/0000-0003-0728-5427; e-mail: [email protected] Corresponding author: Ilyina T.S. — e-mail: [email protected]
TO CITE THIS ARTICLE:
Ilyina TS. Adaptive immunity systems of bacteria: connection with self-synthesizing transposons, polyfunctionality.
Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2022;40(3):13—21. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/molgen20224003113
CRISPR-Cas-системы адаптивного иммунитета бактерий
Большинство архей и многие бактерии обладают адаптивными (приобретенными) системами иммунитета, известными как CRISPR-Cas (Clastered Regularly Interspaced Palindromic Repeats —CRISPR-asso-ciated proteins), с памятью о прошлых столкновениях с чужеродной ДНК — плазмидной, вирусной, транс-позонами [1—3]. Память обусловлена сохранением уникальных спейсер-последовательностей, полученных от мигрирующих генетических элементов, внедренных между идентичными, часто палиндромны-ми, повторами нуклеотидных последовательностей (25—50 пн каждый) в составе CRISPR-рядов бактериальных геномов [4, 5].
Таких повторов в разных CRISPR-Cas-системах насчитывается от нескольких единиц до сотен. Их разделяют уникальные спейсеры из 30—40 пн каждый и, кроме того, в составе этих систем находятся прилегающие к CRISPR-ряду кластеры cas-генов, составляющие один или несколько оперонов. Системы CRISPR-Cas отличаются между собой составом генов cas, организацией геномных локусов и кодируемыми Cas белковыми последовательностями. На этих отличиях построена классификация этих систем, предложенная K.S. Makarova и соавт. в 2011 г. [6] (YI). Первоначально различали три основных типа CRIS-PR-Cas-систем: к типу I отнесены системы, включающие, помимо консервативных casl и cas2 и других cas-генов, специфический ген cas3; к типу II — системы с геном cas9; к типу III — системы с геном cas10. Большинство бактериальных штаммов содержат либо один, либо комбинации из двух CRISPR-Cas-типов, но некоторые виды стрептококков наследуют все три типа. Системы одного типа могут отличаться по составу других cas и иных генов и на этом основании они разделяются на подтипы. Для типов I и III CRISPR-Cas-систем характерна похожая организация [6], в то время как тип II в этом отношении уникален. Помимо набора генов из casl, cas2, cas9, три разных подтипа отличаются содержанием в подтипе II-A дополнительного гена csn2, в подтипе II-B — содержанием гена cas4; подтип II-C не содержит дополнительных генов. В обычном типе II cas-оперон сцеплен с CRISPR-рядом вместе с trans-активирующей CRISPR PHK(trcrRNA).
Число и разнообразие известных на сегодня CRISPR-Cas-систем значительно увеличилось в последние годы. Новая классификация включает 2 класса, 6 типов и 33 подтипа систем [7, 8].
Иммунный ответ CRISPR-Cas включает три последовательные стадии — адаптацию, экспрессию и интерференцию. В стадии адаптации определенный комплекс белков Cas связывается с проникшей в клетку чужеродной молекулой ДНК, продвигается вдоль этой молекулы до встречи с коротким (2—4 пн), отличаю-
щимся от других, мотивом РАМ (Protospacer-Adjacent Motiv), и делает два двунитевых разреза в ДНК-мишени. Вырезанный сегмент, протоспейсер, затем вставляется между двумя повторами, чаще всего в проксимальную часть CRISPR-ряда генома хозяина, превращая его в спейсер [9, 10]. CRISPR-ряд затем репарируется с помощью клеточных систем репарации, при этом образуются дупликации прилегающих повторов [11, 12].
В стадии экспрессии локус CRISPR транскрибируется в один длинный транскрипт, pre-crRNA, который затем процессируется особым комплексом Cas-белков или одним большим белком Cas [13, 14] в зрелые crRNA (направляющие, или гидовые, РНК), каждая из которых содержит спейсер и часть прилегающего повтора.
В конечной стадии, интерференции, связанная с Cas-белками crRNA используется, как гид, для узнавания проникшей в клетку близкородственной последовательности чужеродного генома вируса или плаз-миды. Геном разрезается и инактивируется Cas-нуклеазой, которая может быть компонентом того же комплекса, либо отдельным Cas-белком [15, 16].
Таким способом CRISPR-Cas-системы специфически узнают и деградируют проникающие в клетки чужеродные ДНК и/или РНК вирусного или плаз-мидного происхождения.
На молекулярном уровне CRISPR-Cas-системы обладают модульной организацией. Две основные их части представлены адаптационным и эффектор-ным модулями, которые, соответственно, включают набор генов, кодирующих белки, участвующие в приобретении спейсера (адаптация), и генов, кодирующих Cas-белки, участвующие в процессинге предшественника crRNA с последующим узнаванием мишени и ее разрезании (интерференция). Модули адаптации включают гены белков Cas1 и Cas2, образующих комплекс, в котором эндонуклеаза Cas1 (ин-теграза) разрезает как протоспейсер-содержащую ДНК, так и CRISPR-ряд, тогда как Cas2-белок является его структурной частью. В некоторых случаях в стадии адаптации участвуют другие Cas-белки, например, Cas3 или Cas4. Белки Cas1 и Cas2, играющие центральную роль в стадии адаптации, являются почти универсально консервативными у всех CRISPR-Cas-типов систем [9, 17, 18]. Эффектор-ные модули разных CRISPR-Cas-систем чрезвычайно разнообразны в отношении белковых компонентов, ответственных за процессинг транскрибируемой CRISPR-РНК (стадия экспрессии) и деградацию мишени (стадия интерференции). К классу 1 относятся системы с полисубъединичными эффекторными комплексами из нескольких Cas-белков, а классу 2 — те, у которых эффектором является один большой белок со многими доменами. Кроме того, классы 1 и 2 отличаются механизмами процессинга предшественника crRNA. В случае систем 1 класса crRNA образуются при участии комплекса из ряда Cas-белков, в систе-
мах же 2 класса процессинг может осуществляться либо внешним бактериальным ферментом, РНКа-зой III, с помощью других РНК, либо тем же эффек-торным белком, который разрезает мишени. Стадия интерференции также отличается в системах разных классов участием разных белков [18].
Модули CRISPR-Cas-систем являются частично автономными, о чем свидетельствуют данные об их участии в рекомбинационных процессах и данные о существовании изолированных адаптационных и эффекторных модулей во многих бактериальных и архейных геномах [18]. Было высказано предположение, что модуль адаптации, по-видимому, предшествовал эволюции компонентов, участвующих в стадиях экспрессии и интерференции CRISPR-Cas-ответа, которые, по всей видимости, присоединились к механизму адаптации в процессе последующих независимых событий при участии отдельных классов мобильных генетических элементов [18—20].
Детали действия Casi и Cas2 были интенсивно изучены как in vivo, так и in vitro, с помощью комбинации структурных, биохимических и генетических подходов, давших детальную картину CRISR-Cas-процесса адаптации. Однако вопрос о происхождении механизма адаптации оставался нерешенным.
Открытие нового суперсемейства Casi-кодирующих самосинтезирующихся транспозонов, названных каспозонами [18, 21—23], позволило предложить правдоподобный сценарий эволюции CRIS-PR-Cas-механизма адаптации [24] (см. ниже).
Далее также будут рассмотрены данные о разнообразии каспозонов и проведены параллели между реакциями, катализируемыми Cas1-подобными эн-донуклеазами и CRISPR-Cas-системами, а также данные об открытии анти-CRISPR-систем и роли Acr-белков в подавлении адаптивного иммунитета.
Каспозоны — самосинтезируюшиеся транспозоны архей и бактерий и их роль в происхождении модуля адаптации и адаптивного иммунитета прокариот
Транспозоны являются широко распространенным и важным видом МГЭ, способным к перемещениям из одного местоположения в другое как внутри генома хозяина, так и между разными геномами. Перемещения осуществляются с помощью транспозазы, единственного фермента, кодируемого ДНК-транс-позонами, и обычно необходимым условием действия фермента является присутствие терминальных инвертированных повторов, фланкирующих транспозон. Чаще всего миграция происходит при участии механизма «вырезания и вставки» (cut-and-paste).
Отличающаяся группа ДНК-содержащих транспозонов архей и бактерий — самосинтезирующиеся
(самореплицирующиеся) транспозоны — были обнаружены в ходе анализов геномного окружения casl-генов, которые не были локализованы внутри типичных CRISPR-Cas локусов. Одна из таких casl групп была связана с генами, кодирующими семейство ДНК полимераз B (ДНКП, ген polB) и несколько других консервативных белков. Было установлено, что локусы, включающие гены casl и polB, окружены инвертированными повторами и фланкированы короткими прямыми повторами, которые, соответственно, напоминают терминальные инвертированные повторы (TIR) и дупликации сайтов мишеней (TSD), характерные для различных ДНК- транспозонов. Однако ни один из этих предполагаемых новых транспозонов не кодировал типичной транспозазы или интегразы, которые, как известно, осуществляют интеграцию МГЭ в хромосому хозяина. Единственный белок с активностями, сходными с реакцией интеграции, был гомолог Casl эндонуклеазы, консервативной в CRISPR-Cas системах (отсюда название «каспозоны» для этих новых МГЭ). Это предположение было полностью подтверждено последующими экспериментами in vitro. Для того, чтобы отличать истинный белок Casl систем CRISPR-Cas от гомологов Casl каспозонов, последние получили название « каспозаз» (casposases) [25—27].
Каспозоны варьируют в размерах примерно от 8 тпн до 20 тпн и были идентифицированы в геномах многих архей и некоторых бактерий. На основании данных сравнительной геномики, филогенетических анализов каспозаз и таксономического распределения каспозоны классифицируются в 4 семейства [2l, 23, 28]. Семейство l элементов кодирует ДНКП, близко родственные праймерным белкам вирусов архей. Каспозоны трех других семейств кодируют дивергентные ДНКП белки, не сходные ни с ДНК-праймерными, ни с РНК-праймерными полимеразами [29]. Благодаря тому, что каспозоны кодируют главный белок, необходимый для их репликации (ДНК-полимеразу), они включены в класс самосинтезирующихся (самореплицирующихся) МГЭ, который включает также эукариотические вирус-подобные транспозоны суперсемейства Polinton/Mav-erick [23, 30].
Последние кодируют ДНКП, семейство интеграз RVE (ретровирус-подобных) и набор белков, требуемых для образования вирионов. Соответственно было высказано предположение, что полинтоны действительно образуют вирусные частицы и, возможно, должны рассматриваться как полинтовирусы.
Первоначально не были идентифицированы ка-спозоны, кодирующие вирусные структурные белки, вовлекаемые в процесс морфогенеза вирионов, и поэтому их считали типичными транспозонами [2l, 23]. Однако позднее была обнаружена небольшая группа каспозонов, кодирующих вирусный капсидный белок, что указывало на то, что некоторые из этих эле-
ментов являются действительно «касповирусами», аналогичными полинтонам [31].
Транспозиции каспозонов еще не были доказаны зкспериментально, но сравнительные геномные анализы многих штаммов архейной бактерии Meth-anosarcina mazei привели к обнаружению явных следов недавней мобильности, указывающих на то, что, по крайней мере, некоторые каспозоны являются активными транспозонами [32].
Кроме каспозазы и ДНКП, каспозоны семейств 2, 3 и 4 имеют различные наборы генов, кодирующих, главным образом, нуклеазы и ДНК-связывающие HTH-содержащие (helix-turn-helix) домены белков, Некоторые каспозоны несут гены Cas4-подобных нуклеаз, другого белка, присутствующего во многих CRISPR-Cas-системах, хотя не так широко распространенного, как Casl, которые вовлекаются в процесс адаптации.
Показано близкое сходство между механизмами реакций, катализируемых Casl во время интеграции спейсеров в ряды CRISPR, и реакций с участием ин-теграз во время интеграции транспозонов, что дало возможность заключить, что Casl функционирует как интеграза [21, 23].
Каспозоны интегрируются в различные сайты генома [32]. В отличие от типичных транспозонов каспозоны присутствуют только в нескольких (часто в одной) копиях на геном хозяина.
Каспозоны конкурируют с другими МГЭ за сайты интеграции и иногда внедряются в МГЭ, которые в этих случаях выполняют роль векторов в горизонтальном распространении каспозонов [32].
Филогенетическое дерево семейства Casl-белков разделяется на две основные ветви, одна из которых включает каспозазы, а другая — CRIS-PR-ассоциированные белки Casl [21, 24]. Топология этого дерева вполне совместима с основополагающей ролью каспозазы в эволюции CRISPR-Cas-систем. Весь модуль адаптации этих систем произошел, по-видимому, от каспозонов, привнесших casl и, возможно, другие гены, кодирующие, например, cas4, компонент модуля адаптации в нескольких подтипах CRISPR-Cas-систем, а также дополнительные нуклеазы [21, 23]. Белок Cas2 также мог быть кодирован этим предковым каспозоном, хотя до настоящего времени в каспозонах не были идентифицированы гены cas2. Первоначально предполагалось, что последовательности TIR каспозонов могли давать начало повторам систем CRISPR. Однако дальнейшее биохимическое и структурное изучение CRIS-PR-Casl и каспозаз позволило предположить, что повторы CRISPR эволюционировали непосредственно от дуплицированного сайта мишени интегрированного предкового каспозона [25]. Этот сценарий похож на предполагаемый путь происхождения адаптивных иммунных систем позвоночных с участием транспозонов [24, 33].
Роль каспозонов в происхождении CRISPR-Cas-систем убедительно подтверждается данными о близком сходстве реакций, катализируемых каспозазой во время интеграции, и Casl во время включения спейсера в CRISPR-ряд [27].
Каспозоны являются первым семейством самореплицирующихся транспозонов, идентифицированным у прокариот. В некоторых отношениях их геномная организация напоминает таковую полинтонов эу-кариот. В обеих группах мобильных элементов только два универсальных гена — интеграза (транспозаза) и ДНКП, но интегразы являются неродственными, а ДНКП — отдаленно родственны и явно не одинакового происхождения. Иными словами, генный состав в каждом семействе сильно отличается.
Эндонуклеазы семейства Cas1
Эндонуклеазы, Casl-каспозазы и CRISPR-Casl-белки, до начала интенсивных исследований CRIS-PR-Cas-систем оставались малоизученными, но после проведения сравнительного анализа составили новое семейство нуклеаз [34, 35]. Относительно высокое сходство в последовательностях Casl и каспозаз и консервативность активного сайта позволили заключить, что общая структура ферментов одинакова.
Несмотря на строгие доказательства мобильности каспозонов, полученных путем сравнительной гено-мики [28] и экспериментального изучения реакции интеграции, механизм вырезания каспозона из хромосомы хозяина и участие каспозазы в этом процессе остаются недоказанными. Попытки определить разрезание субстратов ДНК в соответствующей прилегающей TIR-TSD-области не были успешными [26]. Не исключено, что каспозаза действует исключительно как интеграза, а новые линейные копии каспозона синтезируются de novo с использованием интегрированного каспозона и кодируемого им фермента ДНКП.
Интегразные активности каспозазы и Cas1. Эффективная интеграция протоспейсера, осуществляемая Casl эндонуклеазой, требует присутствия Cas2-белка. Два димера Casl соединены с димером Cas2 в гетерогексамерный комплекс. Casl — энзима-тически активный компонент этого комплекса, тогда как нуклеазная активность Cas2 не является необходимой. Показано, что мутантный Cas2 в комплексе Cas1—Cas2 не влияет на активность интеграции in vivo и in vitro [36, 37]. Интеграция протоспейсера может происходить даже в отсутствие Cas2, хотя и с меньшей эффективностью. Спейсеры интегрируются в 5'-ко-нец CRISPR-ряда, приводя к дупликации соответствующего повтора [5, 9].
В случае каспозонов единственным белком, требующимся для интеграции in vitro, является каспозаза [27]. Первоначально считали, что каспозаза катализирует внедрения каспозона в случайные сайты
генома хозяина, но последующее изучение показало, что существует выраженное предпочтение в присутствии точного сайта мишени. Важно, что последовательности, соответствующие сайтам мишеней при интеграциях протоспейсера (лидерная последовательность, расположенная перед СМ8РК-рядом с прилегающим сегментом из 18 п.н.) и каспозона, имеют большое сходство. Такое предпочтение подтверждено также обнаружением тандемных внедрений каспозонов, где каждый новый внедряющийся каспозон располагался перед предшествующим внедренным каспозоном [27]. Несмотря на различия ин-теграз, реакции интеграции протоспейсеров и каспозонов, катализируемые Са81—Са82 и каспоза-зами, соответственно, очень похожи [38, 39]. Этим еще больше подчеркивается очевидная прямая эволюционная связь двух систем.
Полифункциональность С^БР^СаБ-систем
СМ8РК-Са8 системы имеют сложную и разнообразную молекулярную организацию и, по всей видимости, участвуют в осуществлении разных функций, которые отличаются от адаптивного иммунитета. СМ8РК-Са8-системы оказывают влияние на горизонтальный перенос генов, связаны с системами репарации ДНК, программированной гибелью клеток, влияют на регуляцию генов вирулентности и ответа на стресс, групповое поведение бактерий и другие клеточные функции [40—43]. В этом разделе статьи мы рассмотрим лишь некоторые примеры таких функций.
К настоящему времени накоплено множество доказательств, что СМ8РК-Са8-системы, помимо защиты от МГЭ, включая вирусы, плазмиды и транспозоны, ингибируют горизонтальное распространение генов как при конъюгативном переносе плазмид и с их помощью хромосомных фрагментов донора, так и при трансформации. В случае же трансдукционного переноса генов бактериофагами часто имеется повышение частоты трансдукции из-за подавления фаговой репродукции системами СМ8РК-Са8 и увеличения частоты выживаемости трансдуктантов. Стимулирующий эффект СЯКРК-Са8-иммунитета на трансдукцию объясняется низким содержанием трансдуцирующих частиц в фаговой популяции, из-за которого СККРК-Са8-системы приобретают спейсеры против фаговых частиц значительно чаще, чем спейсеры против трансдуцируе-мой ДНК [44]. Наряду с этим было открыто явление СККРЯ-толерантности, при котором бактерии сохраняют МГЭ, хотя их СМ8РК-Са8-система содержит специфические спейсеры в отношении данных МГЭ [45]. Механизм такой толерантности пока непонятен, но предполагается, что в этих случаях эффект зависит от концентрации эффекторного бел-
ка (в случае систем типа II — cas9). При достижении высокой концентрации белка генетический материал МГЭ элиминируется.
CRISPR-Cas-системы связаны с системами репарации и их механизмами действия, эта связь существует на разных уровнях и может оказывать большое влияние на жизнедеятельность бактерий. Биохимические процессы, участвующие в репаративных процессах и в CRISPR-Cas опосредованном иммунитете практически перекрываются. В обоих случаях происходит разрезание ДНК, сопровождаемое заполнением бреши и лигированием. Cas-белки содержат домены, гомологичные доменам белков репарирующих систем [46]. Прямая функциональная связь CRIS-PR-Cas с репарацией существенна на стадии адаптации при восстановлении репарирующей системой целостности CRISPR-ряда после внедрения спейсе-ра [47]. Кроме того, было показано, что белок Cas3a, транскрипционный регулятор, активирующий гены CRISPR-адаптации, дополнительно ко-активирует множество репарирующих генов, что свидетельствует о функциональной координации между механизмами систем CRISPR-Cas и репарации [48].
Многие патогены млекопитающих содержат в составе своих геномов системы CRISPR-Cas II типа, включая такие важные патогенные бактерии, как Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Neisseria meningitides, Campilobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori. Эти патогены способны вызывать как острые, так и хронические заболевания хозяина или связаны с появлением осложнений.
Общей характеристикой для перечисленных бактерий является их способность экспрессировать си-алированную структуру липоолигосахарида (LOS) клеточной оболочки,являющуюся важным фактором вирулентности этих бактерий (адгезия, вторжение, перемещение по клеткам эпителия и уклонение от ответа иммунной системы хозяина). На примере C. jejuni показано, что делеция cas9 гена ведет к утрате способности бактерий перемещаться по эпителиальным клеткам хозяина, к более эффективному связыванию с сывороткой человека, что указывает на роль cas9 и LOS в вирулентности [41, 43]. Дополнительные доказательства получены при введении гена cas9 в геном изолята патогена, не имеющего CRISPR-Cas-системы, результатом которого являлось значительное увеличение вирулентности.
Показано также, что экспрессия нескольких ло-кусов CRISPR-Cas типа I индуцируется стрессом оболочки бактерий, который может быть вызван вирусной инфекцией, антибиотиками или другими факторами [49].
Хорошо изученным случаем влияния CRISPR-Cas на бактериальную оболочку является система подтипа II Francisella novicida, усиливающая целостность оболочки и придающая устойчивость к определенным ан-
тибиотикам [50]. У этой бактерии избыточная продукция специфического бактериального липопротеина (BLP) в бактериальной мембране значительно снижает выживаемость бактерий в макрофагах хозяина и регуляция его продукции оказывает влияние на их уклонение от врожденного иммунитета.
Опосредованная белком Cas9 деградация мРНК BLP активируется после фагоцитоза бактерий макрофагами. Эффект обусловлен подавлением выработки липопротеина белком Cas9 в комплексе с двумя видами малых РНК — кодируемыми в локусе CRIS-PR-Cas транс-активирующей CRISPR RNA (tracrR-NA), а также scaRNA (small CRISPR-Cas-associated RNA) [41]. Подавление продукции липопротеина позволяет клеткам F.novicida избегать иммунного ответа хозяина и таким образом влиять на вирулентность бактерий [41, 43, 51].
Механизмы повышения вирулентности у других бактерий пока еще недостаточно изучены. Однако в случае Streptococcus agalacticae было показано, что Cas9 подавляет экспрессию регулятора транскрипции RegR, репрессора гена гиалуронидазы, фермента, существенного для вирулентности [43].
Регуляция состояния бактериальной оболочки особенно важна во время мембранного стресса, чтобы противостоять этому стрессу и бороться с ним, а также способствовать выживанию бактерий. Были получены данные, что экспрессия CRISPR-Cas-компонентов у некоторых видов бактерий может быть индуцирована оболочечным стрессом. Так, у E. coli при сверхэкспрессии белка GFP следующий за этим оболочечный стресс-ответ запускает повышенную экспрессию CRISPR-Cas-системы. У других видов бактерий и архей, включая Streptococcus thermophilus и Sulfolobus islandicus, эти системы индуцируются бактериофагами [52, 53]. Оболочечный стресс часто сигнализирует о повышении проницаемости оболочки для проникновения в клетки чужеродных нуклеиновых кислот и способствует индукции экспрессии защитных систем бактерий.
Идентифицированы также другие белки и другие механизмы CRISPR-Cas-систем бактерий, влияющие на вирулентность бактерий. Например, Cas2, присутствующий в системе типа II CRISPR-Cas, важен для обеспечения способности бактерий Legionella pneumophila выживать внутри амеб [54].
Анализ вирулентности на модели мочевого тракта мышей двух изолятов Enterococcus faecalis, из которых один содержал тип II CRISPR-Cas-системы, а другой не имел ее, показал, что при заражении мышей CRIS-PR-Cas-содержящий штамм вызывал смертность мышей быстрее. Гистологические исследования показали, что этот штамм обладал повышенной способностью образовывать биопленки, что позволяло бактериям быстрее колонизировать органы мышей по сравнению со штаммом, утратившим CRISPR-Cas систему [55]. Установлено также, что тип 1 CRISPR-Cas-системы
Pseudomonas aeruginosa играет роль в модулировании образования биопленок [56]. Точный механизм регуляции в данном случае неизвестен, но предполагается, что CRISPR-Cas-система взаимодействует со специфическим геном интегрированного в хромосому профага, ингибируя образование биопленки. Эти авторы обнаружили также, что инфицирование изолята РА14 бактериофагом DMS3 блокирует как образование биопленки, так и подвижность, и эти изменения зависят от присутствия типа I-F CRISPR-Cas-системы. Позже было показано, что в этом типе системы присутствует спейсер, транскрипция которого, по предположению, ведет к образованию антисмысловой РНК, участвующей в выключении гена, ответственного за образование биопленки [57].
Таким образом, системы CRISPR-Cas могут влиять на патогенность бактерий посредством двух, не исключающих друг друга процессов: с одной стороны, защиты от мобильных элементов, способных привносить потенциальные факторы вирулентности (гены антибиотикорезистентности, токсинов), приводящей к потенциальному снижению вирулентности, с другой — контроля экспрессии генов, способствующего повышению вирулентности, например, в результате стимулирования процесса колонизации хозяина бактериями.
Одной из особенностей организации локусов адаптивного иммунитета бактерий и архей является обычное присутствие в них генов, связанных с программируемой клеточной смертью (PCD), таких как модулей токсин-антитоксин и абортивной инфекции [58, 59]. Такая локализация генов иммунитета и PCD может свидетельствовать о функциональном объединении двух защитных систем с общим участием их белков в иммунном ответе [60]. Помимо указанного ряда функций, CRISPR-Cas-системам свойственно утрачивать свойства адаптации и интерференции, инициировать появление дефектных вариантов, выполняющих отличающиеся от адаптивного иммунитета роли [18, 61]. Также системы CRIS-PR-Cas или их отдельные составляющие обнаружены в вирусах, транспозонах и плазмидах [18]. Они являются либо полноценными вариантами систем, действующими в этих случаях против защитных систем хозяина [62, 63], либо мини-вариантами, утратившими ряд функций этих систем. До сих пор роль таких вариантов в большинстве случаев не исследована экспериментально и пока недостаточно данных для суждения об их вкладе в эволюцию микроорганизмов.
Анти-CRISPR-Cas-гены (acr) мобильных генетических элементов
CRISPR-Cas-локусы идентифицированы в секве-нированных геномах примерно у 40% бактерий и 85% архей и часто распространяются с помощью МГЭ [64, 65]. Они способствуют сохранению памяти
об определенных инфицирующих элементах, их узнаванию, и препятствуют инфекции.
В ответ на проявление иммунного ответа, обусловленного системами CRISPR-Cas, многие МГЭ выработали ингибиторы этих систем, ан-ra-CRISPR-белки (Acr) [66]. Первые acr-гены были открыты у Mu-подобных фагов, благодаря их способности ингибировать тип I-F CRISPR-Cas-систем Pseudomonas aeruginosa [67]. Позднее появились сообщения о многих других негомологичных Acr-белках, подавляющих разные типы CRISPR-Cas-систем (II, III, V) [68], включая Acr, кодируемые не фаговыми МГЭ, такими как конъюгативные плазмиды и конъ-югативные острова (ICEs), профаги, транспозоны, интегроны и другие неохарактеризованные элементы различных бактериальных видов [64, 69]. На сегодня известны 46 различных семейств Acr-белков, подавляющих различные подтипы CRISPR-Cas, из которых 11 являются ингибиторами системы типа II-A Cas9. Белки разделены на классы 1 и 2 ингибиторов, имеют небольшие размеры (обычно 50— 330 аминокислот) и не имеют сходства по последовательностям или белковым доменам ни между собой, ни с каким-либо белком с известной функцией [70].
Гены этих белков образуют кластеры с генами, получившими название aca (anti-CRISPR-asso-ciated genes), кодирующими более консервативные Aca-белки (Aca). Их функции еще на совсем ясны, но тот факт, что часто эти гены кодируют белки, содержащие НТН-мотив (helix-turn-helix), свидетельствует о том, что они выполняют регуляторные функции, являясь репрессорами транскрипции acr-генов. Гены aca широко распространены и часто используются для открытия новых acr-локусов [64, 71—73].
Основываясь на общей характеристике известных Acr-белков и анализе доступных прокариотиче-ских последовательностей, гомологи acr-генов были обнаружены в составе хромосом и мигрирующих генетических элементов многих бактериальных семейств, таких как Enterobacteriaceae, Pseudomonada-ceae, Burkholderiaceae, Halomonadaceae, Yersiniaceae, Vibrionaceae и др. [64].
Получение структурных и биохимических характеристик Acr-белков выявило отличающиеся по направленности ингибирующие активности, включающие вмешательство в образование crRNA, подавление узнавания ДНК-мишени и разрезания ДНК. Вновь открытые семейства Acr-белков проявляют существенные различия в биохимических свойствах — молекулярной массе, колеблющейся от 7,5 до примерно 20 кД, и прогнозируемых средних изоэлектрических точках от кислотного заряда (pH — 4) до основного (pH — 10). Эти данные вместе с наблюдаемым отсутствием у них гомологичных последовательностей указывали на наличие существенных отличий в их механизмах действия.
Проведенные генетические, биохимические и структурные анализы привели к пониманию механизмов действия некоторых Acr белков 1 и 2 классов [64, 74]. Acr-белки 1 класса, изученные к настоящему времени, вмешиваются в работу типа I CRISPR-Cas-систем. Описаны два способа нарушения стадии интерференции — наиболее общим является непосредственное взаимодействие с множественно субъединичным Cas-белковым комплексом, предотвращающее связывание с ДНК, в то время как менее часто имеется прямое взаимодействие с нуклеазой Cas3 с последующей блокировкой разрезания ДНК. Класс 2 Acr белков активен в отношении типов II, V и VI CRIS-PR-Cas-систем. Почти все они непосредственно взаимодействуют с эндонуклеазой Cas9, хотя механизмы их взаимодействия отличаются [66, 67]. В настоящее время продолжают разрабатываться многочисленные стратегии для идентификации Acr-белков с удивительно разнообразным спектром раскрываемых механизмов ингибирования CRIS-PR-Cas-систем [75].
Открытие Acr белков объясняет, как МГЭ могут существовать и распространяться, несмотря на частое их уничтожение системами адаптивного иммунитета. Acr являются мощным стимулом появления разнообразных CRISPR-Cas-систем в природе и накопления других защитных систем в геномах прокариот. Так как МГЭ способствуют образованию геномных перестроек и обеспечивают основу обширных возможностей обмена прокариотиче-скими генами, изучение механизмов действия Acr-белков позволяет лучше понять взаимодействия МГЭ с хозяином и горизонтальное распространение генов, кодируемых МГЭ (например, резистентности к антибиотикам), среди микробиомов. Практическое значение Acr-белков определяется их способностью повышать эффективность фаготерапии или доставку генов в составе различных МГЭ-плат-форм, а также их активным использованием в арсенале биотехнологий, например, при редактировании геномов [76].
Открытие специализированных, разнообразных кодируемых МГЭ-белков, нарушающих CRISPR-Cas-иммунитет, объясняет способность МГЭ существовать, несмотря на высокую активность адаптивных иммунных систем. Они стимулируют появление разнообразных защитных систем и их накопление в геномах прокариот, а их изучение способствует лучшему пониманию взаимоотношений МГЭ с хозяином и механизмов горизонтального переноса признаков, кодируемых МГЭ у бактерий.
Финансирование работы отсутствует.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
The author declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Barrangou R, Marraffini LA. CRISPR-Cas systems: Procaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 2014;54:234-244. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.03.011
2. Marraffini LA. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 2015;526:55-61. https://doi.org/10.1038/nature15386
3. Mohanraju P, Makarova KS, Zetsche B, Zhang F, Koonin EV, van der Oost J. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 2016;353:aad5147. https://doi.org/10.1126/science.aad5147
4. Amitai G, Sorek R. CRISPR-Cas adaptation: insights into the mechanism of action. Nat Rev Microbiol. 2016;14:67-76. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2015.14
5. Sternberg SH, Richter H, Charpentier E, Qimron U. Adaptation in CRIS-PR-Cas systems. Mol Cell. 2016;61:797-808. https://doi.org/10.1016Zj.molcel.2016.01.030
6. Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Horvath P, et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2011;9(6):467-477. https://doi.org/10.1038/nrmicro2577
7. Makarova KS, Wolf YI, Koonin EV. Classification and nomenclature of CRISPR-Cas systems:where from here? The CRISPR J. 2018;1(5):325-326. https://doi.org/10.1089/crispr.2018.0033
8. Makarova KS. Wolf YI, Iranzo SA, Shmakov SA, Alkhnbashi OS, Brouns SJJ, et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol. 2020;18(2):67-83. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x
9. Amitai G, Sorek R. CRISPR-Cas adaptation: insight into the mechanism of action. Nat Rev Microbiol. 2016;14:67-76. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2015.14
10. Jackson SA, McKenzie RE, Fagerlund RD, Kieper SN, Fineran PC, Brouns SI. CRISPR-Cas: adapting to change. Science. 2017;356:eaal5056. https://doi.org/10.1126/science.aal5056
11. Killelea T, Bolt EL. CRISPR-Cas adaptive immunity and the three Rs. Bios-ci Rep. 2017;37(4):BSR20160297. https://doi.org/10.1042/BSR20160297
12. Liu I, Liu Zh, Ye Q, Pan S, Wang X, Li Y, et al. Coupling transcriptional activation of CRISPR-Cas system and DNA repair genes by Csa3a in Sulfolobus islandicus. Nucleic Acid Res. 2017;45:8978-8992. https://doi.org/10.1093/nar/gkx612
13. Koonin EV, Makarova KS. Origin and evolution of CRISPR-Cas systems. Phylos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019;374(1772):20180087. https://doi.org/10.1098/rstb.20180087
14. Charpentier E, Richter H, van der Oost J, White MF. Biogenesis pathways of RNA guides in frchaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity. FEMS Microbiol Rev. 2015;39:428-441. https://doi.org/10.1093/femsre/fuv023
15. Nishimassu H, Nureki O. Structure and mechanisms of CRISPR RNA-guid-ed effector nucleases. Curr Opun Struct Biol. 2017;43:68-78. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2016.11.013
16. Plagens A, Richter H, Charpenter E, Randau L. DNA and RNA interference mechanisms by CRISPR-Cas surveillance complexes. FEMS Microbiol Rev. 2015;39:442-463.
https://doi.org/10.10 93/femsre/fuv019
17. Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, et al. An apdated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbial. 2015;13:722-736. https://doi.org/10.1038/nrmicro3569
18. Koonin EV, Makarova KS. Mobile genetics elements and evolution of CRIS-PR-Cas systems: all the way there and back. Genome Biol Evol. 2017;9:2812-2825. https://doi.org/10.1093/gbe/evx192
19. Shmakov S, Smargon A, Scott D, Cox D, Pyzocha N, Yan W, et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2017;15(3):168-182. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.184
20. Shmakov S, Abudayyeh OO, Makarova KS, Wolf YI, Gootenberg JS, Semenova E, et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Mol Cell. 2015;60:385-397. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008
21. Krupovic M, Makarova KS, Forterre P, Prangishvili D, Koonin EV. Cas-posons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity. BMC Biology. 2014;19:12-36. https://doi.org/10.1186/1741-7007-12-36
22. Hickman AB, Dyda F. CRISPR-Cas immunity and mobile DNA: a new superfamily of DNA transposons encoding a Casl endonuclease. Mob DNA. 2014;5:23-27.
https://www.mobilednajournal.com/content/5/1/23
23. Krupovic M, Koonin EV. Self-synthesizing transposons: unexpected key players in the evolution ofviruses and defense systems. Curr Opin Microbiol. 2016;31:25-33. https://doi.org/10.1016/j.mib.2016.01.006
24. Koonin EV, Krupovic M. Evolution of adaptive immunity from transposable elements combined with innate immune systems. Nat Rev Genet. 2015;16:184-192. https://doi.org/10.1038/nrg3859
25. Krupovic M, Beguin P, Koonin EV. Casposons: mobile genetic elements that gave rise to the CRISPR-Cas adaptation machinery. Curr Opin Microbiol. 2017;38:36-43. https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.04.004
26. Hickman AB, Dyda F. The casposon-encoded Casl protein from Acidulip-rofundum boonei is a DNA integrase that generates target site duplications. Nucleic Acids Res. 2015;43:10576-10587. https://doi.org/10.1093/nar/gkv1180
27. Beguin P, Charpin N, Koonin EV, Forterre P, Krupovic M. Casposon integration shows strong target site preference and recapitulates protospacer integration by CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 2016;44:10367-10376. https://doi.org/10.1093/nar/gkv821
28. Krupovic M, Shmakov S, Makarova KS, Forterre P, Koonin EV. Recent mobility of casposons, self-synthesizing transposons at the origin of the CRIS-PR-Cas immunity. Genome Biol Evol. 2016;8:375-386. https://doi.org/10.1093/gbe/evw006
29. Makarova KS, Krupovic M, Koonin EV. Evolution of replicative DNA poly-merases in archaea and their contribution to the eucaryotic replication machinery. Front Microbiol. 2014;5:354. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00354
30. Krupovic M, Koonin EV. Polintons: a hotbed of eukaryotic virus, transposon and plasmid evolution. Nat Rev Microbiol. 2015;13:105-115. https://doi.org/10.1038/nrmicro3389
31. Yutin N, Backstrom D, Ettema TJG, Krupovic M, Koonin V. Vast diversity of prokaryotic virus genomes encoding double jelly-roll major capsid proteins uncovered genomic and metagenomic sequence analysis. Virol J. 2018;15:67. https://doi.org/10.1186/s12985-018-0974-y
32. Krupovic M, Makarova KS, Forterre P, Koonin EV. Recent mobility of casposons, self-synthesizing transposons at the origin of the CRISPR-Cas immunity. Genome Biol Evol. 2018;8(2):375-386. https://doi.org/10.1093/gbe/evw006
33. Koonin EV, Krupovic M. A movable defense. Scientist. 2015;29(1):46-53.
34. Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct. 2006;1:7. https://doi.org/10.1186/1745-6150-1-7
35. Wiedenheft B, Zhou K, Jinek M, Coyle SM, Ma W, Doudna JA. Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-me-diated genome defense. Structure. 2009;17:904-912. https://doi.org/10.1016/j.str.2009.03.019
36. Nunez JK, Kranzusch PJ, Noeske J, Wright AV, Davies CW, Doudna JA. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRIS-PR-Cas adaptive immunity. Nat Struct Mol Biol. 2014;21:528-534. https://doi.org/10.1038/nsmb.2820
37. Nunez JK, Lee AS, Engelman A, Doudna JA. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature. 2015;519:193-198. https://doi.org/10.1038/nature14237
38. Arslan Z, Hermanns V, Wurm R, Wagner R, Pul U. Detection and characterization of spacer integration intermediates in type I-E CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 2014;42:7884-7893. https://doi.org/10.1093/nar/gkv510
39. Nunez JK, Kranzusch PJ, Noeske J, Wright AV, Davies CW, Doudna JA. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRIS-PR-Cas adaptive immunity. Nat Struct Mol Biol. 2014;21:528-534. https://doi.org/10.1038/nsmb.2820
40. Faure G, Makarova KS, Koonin EV. CRISPR-Cas: complex functional networks and multiple roles beyond adaptive immunity. J Mol Biol. 2019;431(issue 1):3-20. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2018.08.030
41. Sampson TR, Weiss DS. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:37. https://doi.org/10.3389/fcimb.2014.00037
42. Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS. A CRISPR-Cas system mediates bacterial innate evasion and virulence. Nature. 2013;497:254-257. https://doi.org/10.1038/nature12048
43. Louwen R, Staals RH, Endtz HP, van Baarlen P, van der Oost J. The role of CRISPR-Cas system in virulence of pathogenic bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2014;78:74-88. https://doi.org/10.1128/MMBR.00039-13
44. Watson BNJ, Staals RHJ, Fineran PC. CRISPR-Cas-mediated phage resistance enhances horizontal gene transfer by transduction. MBio. 2018;9(1):e02406-17. https://doi.org/10.1128/mBio.02406-17
45. Goldberg GW, Jiang W, Bikard D, Marraffini LA. Conditional tolerance of temperate phages via transcription-dependent CRISPR-Cas targeting. Nature. 2014;514:633-637. https://doi.org/10.1038/nature13637
46. Makarova KS, Aravind L, Grishin NV, Rogozin IB, Koonin EV. A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis. Nucleic Acids Res. 2002;30:482-496. https://doi.org/10.1093/nar/30.2.482
47. Killelea T, Bolt EI. CRISPR-Cas adaptive immunity and the three Rs. Bios-ci Rep. 2017;37:BSR20160297. https://doi.org/10.1042/BSR20160297
48. Liu T, Liu Z, Ye Q, Pan S, Wang X, Li Y, et al. Coupling transcriptional activation of CRISPR-Cas system and DNA repair genes by Cas3a in Sulfol-obus islandicus. Nucleic Acids Res. 2017;45:8978-8992. https://doi.org/10.1093/nar/gks612
49. Ratner HK, Sampson TR, Weiss DS. I can see CRISPR now, even when phage ara gone: a view on alternative CRISPR-Cas functions from prokary-otic envelop. Curr Opin Infect Dis. 2015;28(3):267-274. https://doi.org/10.1097/QC0.0000000000000154
50. Sampson TR, Napier BA, Schroeder MR, Louwen R, Zhao J, Chin CY, et al. A CRISPR-Cas system enhances envelope integrity mediating resistance and inflammasome evasion. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:11163-11168. https://doi.org/10.1073/pnas.1323025111
51. Louwen R, Horst-Kreft D, De Boer AG, Van Der Graaf L, De Knegt G, Hamersma M, et al. A novel link between Compylobacter jejuni bacteriophage defence, virulence and Guillain-Barre syndrome. Eur J Clin Microbiol infect Dis. 2013;32:207-226.
https://doi.org/10.1007/s10096-012-1733-4
52.
53.
54.
55.
56.
Perez-Rodriguez R, Haitjema C, Huang Q, Nam K, Bernardis S, Ke A, et al.Envelope stress is a trigger of CRISPR RNA-mediated DNA silencing in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2011;79:584-599. https://doi.Org/10.1111/j.1365-2958.2010.07265.x
Young JC, Dill BD, Pan C, Hettich RL, Banfield JF, Shah M, et al. Phage-in-duced expression of CRISPR-associated proteins is revealed by shotgun pro-teomics in Streptococcus thermophilus. PLoS ONE. 2012;7:e38077. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038077
Gunderson FF, Cianciotto NP. THE CRISPR-associated gene cas2 of Legionella pneumophilais required for intracellular infection of amoebae. mBIO. 2013;4:e00074-13.
https://doi.org/10.1128/mBio.00074-13
Bourgogne A, Garsin DA, Qin X, Singh KV, Sillanpaa J, Yerrapragada S, et al. Large scale variation in Enterococcus faecalis illustrated by the genome analysis of strain OGIRF. Genome Biol. 2008;9:R110. https://doi.org/10.1186/gb-2008-9-7-r110
Zegans ME, Wagner JC, Cady KC, Murphy DM, Hammond JH, O'Toole GA Interaction between bacteriophage DM53 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. JBacteriol. 2009;191:210-219. https://doi.org/10.1128/JB.00797-08
57. Palmer KL, Whiteley M. DMS3-42: the secret to CRISPR-dependent biofilm inhibition in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 2011;193:3431-3432. https://doi.org/10.1128/JB.05066-11
58. Makarova KS, Anantharaman S, Aravind L, Koonin EV. Live virus — free or die: coupling of antivirus immunity and programmed suicide or dormancy in prokaryotes. Biol Direct. 2012;7:40-50. https:www.biologyodirect.com/content/7Z1/40
59. Makarova KS, Wolf YI, Koonin EV. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucl Acid Res. 2013;41:4360-4377. https://doi.org/10.1093/nar/gkt157
60. Koonin EV, Zhang F. Coupling immunity and programmed cell suicide in prokaryotes: life or death choices. Bioassays. 2017;39:1-9. https://doi.org/10.1002/bies.201600186
61. Peters JE, Makarova KS, Shmakov S, Koonin EV. Recruitment of CRISPR-Cas systems by Tn7-like transposon. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:7358-7366. https://doi.org/10.1073/pnas.1709035114
62. Seed KD, Lazinski DW, Calderweed SB, Camilli A. A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity. Nature. 2013;494:489-491. https://doi.org/10.1038/nature11927
63. Villion M, Moineau S. Virology: phages hijack a host defence. Nature. 2013;494:433-434.
https://doi.org/10.1038/494433a
64. Pinilla-Redonda R, Shehreen S, Marino ND, Fagerlund RD, Brown ChM, Sorensen SJ, et al. Discovery of multiple anti-CRISPRs highlights anti-defense gene clustering in mobile genetic elements. Nature Commun. 2020;11:5652. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19415-3
65. Faure G, Shmakov SA, Yan WX, Cheng DR, Scott DA, Peters JE, et al. CRISPR-Cas in mobile genetic elements: counter-defence and byond. Nat Rev Microbiol. 2019;17(8):513-525. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0204-7
66. Borges AL, Davidson AR, Bondy-Denomy J. The discovery, vechanisms, and evolutionary impact of anti-CRISPRs. Annu Rev Virol. 2018;4:32-39. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-101416-041616
67. Bondy-Denomy Pawluk A, Maxwell KL, Davidson AR. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR-Cas bacterial immune system. Nature. 2013;493:429-432.
https://doi.org/10.1038/nature11723
68. Watters KE, Fellmann C, Bai H>B, Ren SM, Doudna JA. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 2018;362:236-239. https://doi.org/10.1126/science.aau5138
69. Mahendra C, Christie KA, Osuna BA, Redondo R, Kleinstiver BP, Bon-dy-Denomy J, et al. Broad spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer. Nat Microbiol. 2020;5:620-629. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0726-9
70. Trasanidou D, Geros AS, Mohanraji P, Nieuwenweg C, Nobrega FL, Staals RHJ. Keeping CRISPR in check: diverse mechanisms of phage-encod-ed anti-CRISPRS. FEMS Microbiol. Letters. 2019;366:fnz098. https://doi.org/10.1093/femsle/fnz098
71. Birkholz N, Fagerlund RD, Smith IM, Jackson SA, Fineran PC. The autoregulator Aca2 mediates anti-CRISPR repression. Nucleic Acids Res. 2019;47:9658-9665.
https://doi.org/10.1093/nar/gkz721
72. Pawluk A, Staals RHJ, Taylor C, Watson BNJ, Saha S, Fineran PC, et al. Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species. Nat Microbiol J. 2016;1:16085. https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.85
73. Stanley SY, Borges AL, Chen K-H, Swaney DL, Kroyan NJ, Bondy-Deno-my J, Davidson AR. Anti-CRISPR-associated proteins are crucial repressors of anti-CRISPR transcription. Cell. 2019;178:1452-1464. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.046
74. Davidson AR, Lu WT, Stanley SY, Wang J, Mejdani M, Trost CN, et al. Anti-CRISPR inhibitors of CRISPR-Cas systems. Annu Rev Biochem. 2020;89:309-332.
https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-011420-111224
75. Leon LM, Park AE, Borges AL, Zhang JY, Bondy-Denomy J. Mobile element warfare via CRISPR and anti-CRISPR in Pseudomonas aeruginosa. Nucleic Acids Res. 2021;49(4):2114-2125. https://doi.org/10.1093/nar/gkab006
76. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csorgo B, Bondy-Denomy J. Anti-CRIS-PR protein applications: natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nature Methods. 17(5):471-479. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0771-6
Поступила в редакцию 17.01.2022
Received 17.01.2022
После доработки 30.01.2022
Revised 30.01.2022
Принята к публикации 13.02.2022
Accepted 13.02.2022
