CC BY
67
УДК 547.466.1+541.64
Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2014. Вып. 1
А.Е.Дулов1, П. С. Челушкин2, С. В. Буров2
СИНТЕЗ ПИРУВОИЛ-ПОЛИЛИЗИНА — ПОТЕНЦИАЛЬНОГО НОСИТЕЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
1 Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Российская Федерация
2 Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004, Санкт-Петербург, Российская Федерация
Разработаны методы введения в структуру полилизина реакционноспособных кетогрупп, которые могут быть использованы для иммобилизации лекарственных препаратов с помощью селективной химической лигации. Показано, что эффективным вариантом такой модификации является ацилирование полилизина W-гидроксисукцинимидным эфиром пиро-виноградной кислоты. При этом для повышения растворимости в водно-органических системах растворителей исходный полимер переводят в форму п-толуолсульфоната. Возможности практического применения пирувоил-полилизина для иммобилизации лекарственных веществ с помощью реакции образования гидразонов исследованы на примере модельного соединения — 2,4-динитрофенилгидразина. Структура полученных соединений подтверждена данными спектроскопии ЯМР и УФ. Молекулярно-массовые характеристики образцов полимера определены методами вискозиметрии и гель-проникающей хроматографии. В результате исследований предложен метод синтеза полимерных носителей на основе пирувоил-полилизина, перспективных при разработке систем направленного транспорта лекарственных препаратов. Библиогр. 8 назв. Ил. 2. Табл. 2.
Ключевые слова: полилизин, пировиноградная кислота, селективная химическая лига-ция.
A. E. Dulov1, P. S. Chelushkin2, S. V. Burov2
SYNTHESIS OF PYRUVOYL-POLYLYSINE AS A POTENTIAL DRUG CARRIER
1 St. Petersburg State University, 199034, St. Petersburg, Russian Federation
2 Institute of Macromolecular compounds, RAS, 199004, St. Petersburg, Russian Federation
Polylysine represents a promising variant of polymer carrier for targeted drug delivery. It was shown that its acylation by N-hydroxysuccinimide ester of pyruvic acid followed by selective chemical ligation is an efficient method for the immobilization of biologically active compounds. The solubility of parent polymer in water-organic solvent mixtures can be significantly improved by its conversion into p-toluenesulfonate form. The possibility of pyruvoyl-polylysine application for the immobilization of cargo molecules by the selective hydrazone ligation was verified by using the model compound — 2,4-dinitrophenylhydrazine. The structure of synthesized compounds was confirmed by NMR and UV spectroscopy. The molecular-mass distribution of polymer samples was determined using viscometry and gel-permeation chromatography methods. Suggested method of polymer carrier modification can provide some advantages in designing targeted drug delivery systems. Refs 8. Figs 2. Tables 2.
Keywords: polylysine, pyruvic acid, selective chemical ligation.
Введение. Одним из актуальных направлений химии высокомолекулярных соединений является синтез полимерных носителей для направленного транспорта противоопухолевых препаратов. Получение конъюгатов на основе природных или синтетических полимеров позволяет оптимизировать физико-химические свойства низкомолекулярных лекарственных соединений, повысить избирательность и эффективность терапевтического действия.
К числу полимерных носителей, широко используемых в системах адресной доставки противоопухолевых препаратов, относятся синтетические полиаминокислоты и, в частности, полилизин. Применение полилизина представляет особенный интерес, поскольку в данном случае низкая общая токсичность полимера сочетается со способностью к расщеплению под действием ферментов и наличием собственной противоопухолевой активности. Введение в структуру носителя реакционноспособных кето-групп открывает широкие возможности для хемоселективной иммобилизации биологически активных соединений различной природы в результате образования гидразонной или оксимной связи. Одним из наиболее перспективных вариантов такой модификации является ацилирование полилизина пировиноградной кислотой, производные которой вступают в реакцию селективной химической лигации.
Целью данного исследования является синтез полилизина, содержащего реакцион-носпособные пирувоильные группы (PL(Pyv)), и разработка методов его применения для иммобилизации биологически активных соединений.
Обсуждение результатов. Для введения пирувоильных групп в структуру полилизина существуют две принципиальные возможности: сополимеризация лизина и Же-пирувоиллизина и ацилирование полилизина производными пировиноградной кислоты. Использование карбоксиангидрида Же-пирувоиллизина при реакции сополи-меризации позволяет в широких пределах варьировать состав полимерного носителя. В то же время наличие пирувоильной группировки значительно ограничивает возможности выбора условий проведения реакции. Так, присутствие в реакционной смеси органических оснований способствует образованию димерных структур в результате аль-дольной конденсации [1]. Использование тиолов на стадии деблокирования приводит к получению дитиокеталей, а в присутствии силанов наблюдается восстановление пи-рувоильной группы с образованием производных молочной кислоты [2] (схема (1)).
СНз
ОН
О =/ ^ ЕВТ
О
СН
ОН
О
с
о
НО
^СНз О
О
к
(1)
Исследование различных методов синтеза Же-пирувоиллизина при использовании как свободной, так и защищённой по кетогруппе пировиноградной кислоты свидетельствует о трудоёмкости такого подхода, связанной с протеканием специфических побочных реакций, значительно осложняющих очистку промежуточных продуктов. Поэтому в ходе дальнейшей работы использовали альтернативный вариант, основанный на аци-лировании полилизина производными пировиноградной кислоты (схема (2)).
Синтез полилизина осуществляли карбоксиангидридным методом с применением бензилоксикарбонильной (2) защиты для блокирования Же-аминогруппы. Реакцию полимеризации проводили в этилацетате при использовании гексиламина в качестве инициатора. В результате варьирования соотношения мономер/инициатор получена серия образцов poly-L-Lys(Z), охарактеризованных методом вискозиметрии и ГПХ в ДМФА (табл. 1). Полученные данные хорошо согласуются между собой, за исключением образца со степенью полимеризации 140, где наблюдается заниженное значение Ыц по
БША
сравнению с Мы, что может объясняться существенным вкладом низкомолекулярной фракции. Поэтому после удаления ^-защиты действием бромистого водорода конечный продукт освобождали от примеси олигомеров с помощью диализа при использовании полупроницаемых мембран с порогом отсечения молекулярных масс 12-14 тысяч г/моль.
Таблица 1
Молекулярно-массовые характеристики образцов poly-L-Lys(.Z) по данным вискозиметрии и ГПХ
РЬ-Их Мц, г/моль Мш, г/моль М„, г/моль м.ю/мп р 1 ги Рп
РЬ-^400 203000 186000 117000 1,59 710 400
РЬ-^230 95000 104000 67000 1,56 400 230
26000 44000 40000 1,09 170 140
Для контроля полноты деблокирования и подтверждения структуры полилизина использовали метод 1Н ЯМР (рис. 1). Полученные результаты свидетельствуют о практически количественном удалении ^-защиты и полностью согласуются с литературными данными [3]. Поскольку используемые условия деблокирования не приводят к расщеплению амидной связи [4], молекулярно-массовые характеристики ро1у^^уэ рассчитывали на основании данных, полученных для защищённого полимера (табл. 2).
Таблица 2
Молекулярно-массовые характеристики образцов poly-L-Lys
РЬЛ- Мш, г/моль М„, г/моль мт/мп р 1 ги Рп
РР400 148000 93000 1,59 710 400
РЬззо 83000 53000 1,56 400 230
РЬ140 35000 32000 1,09 170 140
Для введения в структуру носителя реакционноспособных кетогрупп полученный полимер ацилировали Ж-гидроксисукцинимидным эфиром пировиноградной кислоты [5]. При этом исследование стабильности модельного соединения — пирувоил-аминокапроновой кислоты показывает, что оптимальное для проведения реакции значение рН, при котором не наблюдается образования побочных продуктов, находится в интервале от 6 до 7.
Поскольку гидробромид полилизина нерастворим в безводном ДМФА, полимер переводили в форму п-толуолсульфоната, что позволяет использовать в качестве растворителя систему ДМФА—вода с содержанием воды не более 10 %. По завершении реакции, для предотвращения образования оснований Шиффа с незамещёнными ами-
гч
ТГ
о
см
ТГ
сл
о о
т оо чо т
2, 4
5,0
4,0
—I—1—1—1—1—I—
3,0 2,0
ррт
1,0
0,0
Рис. 1. ^-ЯМР спектр PL4oo в D2O (область алифатических протонов)
ногруппами полилизина, рН реакционной смеси доводили до 2. Полученный продукт очищали с помощью диализа и лиофилизовали.
Для определения степени замещения полилизина остатками пировиноградной кислоты использовали спектрофотометрический метод, основанный на реакции взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ) в щелочной среде. При этом для гидразона, в отличие от исходного ДНФГ, наблюдается характерное поглощение при длине волны 515 нм. Следует отметить, что степень замещения аминогрупп существенно меньше рассчитанной на основании используемого соотношения исходных реагентов и изменяется в интервале от 0,4 до 1,5 мол. %, что соответствует 2-6 пирувоильным группам на макромолекулу полилизина. Тем не менее содержание реакционноспособ-ных кетогрупп достаточно для присоединения лекарственных препаратов или векторных молекул, обеспечивающих взаимодействие с рецепторами клеток-мишеней. Так, по литературным данным, оптимальной является загрузка, соответствующая 2-20 молекулам вектора на макромолекулу полимера [6].
Для оценки возможностей присоединения к пирувоил-полилизину биологически активных соединений методом селективной химической лигации использовали модельную реакцию с 2,4-динитрофенилгидразином (схема (3)).
СЫ„
о
о
кымы2
N0
СЫ3 ■=N
.N0,
о
о
(3)
3
1,0-
i з 2
0,0
300
350
Я, нм
400
450
Рис. 2. УФ-спектры ДНФГ(1), модельного гидразона (2) и гидразона PL(Pyv)(5)
Анализ УФ-спектров продукта реакции (рис. 2) свидетельствует об образовании конъюгата. При этом сдвиг максимума поглощения полученного соединения связан с равновесным характером процесса, что подтверждается данными ГПХ.
Таким образом, в результате проведенных исследований предложен метод синтеза полимерных носителей на основе пирувоил-полилизина, перспективных при разработке систем направленного транспорта лекарственных препаратов.
Экспериментальная часть. Индивидуальность полученных низкомолекулярных соединений контролировали с помощью ТСХ на пластинках «Silufol» (Чехия). Визуализацию хроматограмм проводили при облучении УФ светом с длиной волны 254 нм, хлор-бензидиновым методом или нингидрином.
Электрофорез проводили на приборе «Laboratorium Felszersek» (Венгрия) с напряжением на электродах 1500 В в течение 30 мин. Электрофореграммы детектировали с помощью хлор-бензидинового метода и проявления нингидрином.
Вискозиметрию проводили с помощью капиллярного вискозиметра «Уббеллоде». В качестве растворителя для полимера использовали ДМФА, концентрацию полимера варьировали в интервале от 0,3 до 1,5 г/дл. По полученным данным определяли характеристическую вязкость. Молекулярные массы рассчитывали на основе параметров уравнения Марка—Куна—Хаувинка
Значения характеристических вязкостей и молекулярных масс взяты из работы [7].
ГПХ осуществляли на приборе «Smartline» (Knauer) с использованием модулей: Pump 1000, UV 2600, RI 2200; обращённо-фазовую ВЭЖХ — на хроматографе «System Gold» (Beckman, США); колонка Ultrapac TSK G2000 PW (7,5 мм x 60 мм). Условия хроматографии: УФ-детекция при 220 нм, буфер 50 % ацетонитрил/0,1 % H3P04/0,2M NaCl, скорость потока 1,0 мл/мин.
УФ-спектры регистрировали на однолучевых спектрофотометрах «USB4000» и «USB650» (Ocean Optics, США), с лампой PX Pulsed Xenon Light Source, держателем для кювет CUV-ALL 4-Way. Фотометрические измерения проводили на однолуче-вом спектрофотометре «СФ-26» (Россия). Все измерения осуществляли в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм.
Спектры ЯМР получали на спектрометре «Avance-400» («Bruker», Германия) c рабочей частотой 400 МГц на ядрах XH при температуре 298 К. Спектры регистрировали с подавлением остаточного сигнала HOD (4,7 м. д.).
N-карбоксиангидрид NЕ-карбобензокси^-лизина (1) получали по методике, аналогичной предложенной в работе [8]. Выход 4,7 г (42 %).
[п] = KMa.
Poly-L-Lys(Z) (2). В ходе полимеризации карбоксиангидрида 1 варьировали соотношение полимер/инициатор для получения полимеров с различной молекулярной массой. Описание методики приводится для полимера с массой в 25 000 Да.
К раствору 1,57 г карбоксиангидрида 1 в 189 мл этилацетата прибавляли 9,45 мкл гексиламина (соотношение карбоксиангидрид/инициатор 75,9 : 1). Реакционную смесь оставляли на 18-20 ч в темноте при комнатной температуре. Выпавший густой творожистый осадок полимера отфильтровывали, промывали на фильтре 150 мл метанола и высушивали в вакууме над P2O5. Выход 1,28 г (82 %).
Анализ ММР образцов проводили с помощью ГПХ в ДМФА на колонках PLgel 10 ц MinMix-B при скорости потока 0,3 мл/мин, давлении 18 бар и температуре 25 °С.
Poly-L-Lys*HBr (3). Через раствор 1,28 г полимера 2 в смеси 30 мл хлористого метилена и 2 мл трифторуксусной кислоты пропускали ток сухого бромистого водорода в течение 1,5 ч после начала выпадения осадка. Избыток бромистого водорода удаляли, пропуская ток азота. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе, остаток переносили на фильтр Шотта, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Полученный продукт растворяли в воде, диализовали в диализных мешках «Cellu Sep T2» (Orange Scientific, Бельгия) с массой отсечения (12 + 14) • 103 г/моль и лиофилизо-вали. Выход 0,384 г (30 %).
Poly-L-Lys*pTSA (4). К смоле Dowex 1х8 в OH^-форме добавляли раствор полимера 3 в воде и реакцию обмена проводили в течение 15 мин. Ионообменную смолу отфильтровывали, к фильтрату добавляли 0,5 экв. n-толуолсульфокислоты и раствор упаривали.
Poly-L-Lys(Pyv) (5). К раствору полимера 4 в смеси ДМФА : H2O (9 : 1) добавляли расчётное количество Ж-гидроксисукцинимидного эфира пировиноградной кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч и растворитель упаривали. Остаток растворяли в воде, подвергали диализу в условиях, описанных для соединения 3, и лио-филизовали.
Модельная реакция образования гидразона. К раствору полимера 5 в 1н HCl
добавляли трёхкратный избыток ДНФГ в расчёте на количество присоединённых пи-рувоильных группировок. Реакционную смесь перемешивали в течение 48 ч, осадок ДНФГ отфильтровывали, фильтрат упаривали до небольшого объёма, наносили на колонку с сефадексом G-15 и элюировали 50 % уксусной кислотой. Отсутствие примеси свободного ДНФГ в полученном полимерном конъюгате подтверждали методом ТСХ и ГПХ (0,1M NaCl; колонка BioSep-SEC-S 2000; 300 мм х 4,6 мм).
Литература
1. Marceau P., BureC., Delmas A. F. Efficient synthesis of C-terminal modified peptide ketones for chemical ligations // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. Vol. 15, N 24. P. 5442-5445.
2. Katayama H., Utsumi T., Ozo,wa C. et al. Pyruvoyl, a novel amino protecting group on the solid phase peptide synthesis and the peptide condensation reaction // Tetrahedron Lett. 2009. Vol. 50, N 7. P. 818-821.
3. Dijk-Wolthuis W., WaterL., WeteringP. et al. Synthesis and characterization of poly-L-lysine with controlled low molecular weight // Macromol. Chem. Phys. 1997. Vol. 198, N 12. P. 3893-3906.
4. Ringsdorf H. Structure and properties of pharmacologically active polymers //J. Polym. Sci. Symp. 1975. Vol. 51, N 1. P. 135-153.
5. Gaertner H., CeriniF., Kamath A. et al. Efficient orthogonal Bioconjugation of dendrimers for synthesis of bioactive nanoparticles // Bioconjugate Chem. 2011. Vol. 22, N 6. P. 1103-1114.
6. David A., Kopeckova P., Minko T. et al. Design of a multivalent galactoside ligand for selective targeting of HPMA copolymer-doxorubicin conjugates to human colon cancer cells // Eur. J. Cancer. 2004. Vol. 40, N 1. P. 148-157.
7. Applequist J., Doty P. a-Helix formation in poly-N-carbobenzoxy-L-lysine and poly-L-lysine in polyamino acids, polypeptides and proteins // Collected papers / ed. by M. A. Stahmann. Madison, WI: Univ. of Wisconsin Press, 1962. P. 161-177.
8. NotteletB., El Ghzaoui A., Coudane J., VertM. Novel amphiphilic poly(e-caprolactone)-g-poly(L-ly-sine) degradable copolymers // Biomacromolecules. 2007. Vol. 8, N 8. P. 2594-2601.
Статья поступила в редакцию 30 июня 2013 г.
Контактная информация
Дулов Алексей Евгеньевич — студент; e-mail: [email protected]; Челушкин Павел Сергеевич — научный сотрудник; e-mail: [email protected] Буров Сергей Владимирович — заведующий лабораторией; e-mail: [email protected]
Dulov Alexei A. — student; e-mail: [email protected] Chelushkin Pavel S. — Researcher; e-mail: [email protected] Burov Sergei V. — Head of laboratory; e-mail: [email protected]
