CC BY
46
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ» зз
в процессах пролиферации, дифференцировки, апоптоза, ре- на поверхность МНЧ БСА и осаждении на белковом по-гуляции клеточного цикла, репликации, транскрипции и т. д. крытии КТ. Полученные гибридные наноматериалы могут быть использованы для реализации новых подходов к ви-А.М. Дёмин1, Ю.В. Кузнецова2, В. П. Краснов1, А.А. Ремпель2 зуализации клеток (том числе опухолевых) и изучения вну-СИНТЕЗ ГИБРИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ триклеточных процессов. МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ FE3O4 И НАНОЧАСТИЦ Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ(№ 14-03-AG2S В БИОМЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЯХ 00146-а) и УрОРАН(№ 15-21-3-6). 1ФГБУН«ИОС им. И.Я. Постовского УрО РАН», Екатеринбург; 2ФГБУНИХТТУрО РАН, Екатеринбург А.М. Дёмин, М.А. Макаренко, В.П. Краснов Введение. В настоящее время магнитные наночастицы СИНТЕЗ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ RGD-ПЕПТИДА (МНЧ) и квантовые точки (КТ) достаточно часто исполь- 1ФГБУН«ИОС им. И.Я. Постовского УрО РАН», Екатеринбург зуются в качестве мультимодальных платформ для получе- Введение. Производные RGD-пептида (содержащие ния на их основе диагностических и терапевтических пре- в своей структуре фрагмент Z-Arg-Gly-Z-Asp) в настоящее паратов, в первую очередь в онкологии. МНЧ часто время используются в качестве молекулярных векторов, используют в качестве материалов, усиливающих контраст обеспечивающих специфическую доставку препарата при магнитно-резонансной томографии. Эмиссия КТ Ag2S в опухолевые ткани за счет связывания с интегринами в близкой инфракрасной (ИК) области является основным aIIb/IIIa, avß3 avß5, вовлеченными в процессы метастазирова-преимуществом в визуализации клеток оптическими ме- ния опухолей и ангиогенеза. Конъюгация RGD-пептидов тодами, так как в этой части диапазона автофлуоресценция с терапевтическими и диагностическими агентами (про-клеток минимальна. Кроме того, преимуществом наноча- тивораковыми препаратами или наночастицами) может стиц Fe3O4 и Ag2S является их низкая токсичность и воз- позволить получить высокоэффективные препараты для можность получения на их основе материалов в биомеди- использования в онкологии. цинских целях. Цель исследования — разработка синтетических подходов Цель исследования — получение гибридных наномате- для получения производных KRGD- и GRGD-пептидов, риалов на основе Fe3O4 и Ag2S, сочетающих в себе как маг- которые в дальнейшем могут быть конъюгированы с магнитные свойства МНЧ, так и оптические свойства КТ. нитными наночастицами (МНЧ) для применения в маг-Материалы и методы. КТ Ag2S и МНЧ Fe3O4 получали нитно-резонансной диагностике онкологических заболе-осаждением частиц из растворов соответствующих солей. ваний. КТ стабилизировали бычьим сывороточным альбумином Материалы и методы. В работе использовали класси-(БСА), а для стабилизации МНЧ использовали N-^ос- ческие методы пептидной химии в растворе. Синтез пеп-фонометил) иминодиуксусную кислоту (PMIDA). Методом тидов осуществляли путем последовательного наращи-динамического рассеяния света (Zetasizer Nano ZS) изуче- вания пептидной цепи, исходя из диметилового эфира ны гидродинамические характеристики полученных су- Z-аспаргиновой кислоты. Строение и чистота полученных спензий КТ и гибридных наночастиц (Fe3O4-BSA-Ag2S). продуктов подтверждена данными 1Н ядерного магнитно-Оптические свойства изучены при использовании UV-2401PC го резонанса (Bruker Avance 500), элементного анализа (Shimadzu). Fe3O4-BSA-Ag2S охарактеризованы данными (Perkin Elmer РЕ 2400), HRMS (LCMS-2010 фирмы «Shi-ИК-спектроскопии (Nicolet 6700) и РСА (STADI-P, STOE). madzu») и обращенно-фазовой высокоэффективной жид-Результаты. На 1-м этапе исследованы условия полу- костной хромотографии (Agilent 1100, колонка Phenomenex чения стабильных водных суспензий КТ на основе Ag2S Luna C-18). при использовании БСА и проведено исследование влия- Результаты. На 1-м этапе был оптимизирован метод ния количества БСА на стабильность получаемых суспен- синтеза RGD-пептида. Путем его конденсации с Fmoc-L— зий Ag2S-BSA. Показано, что для стабилизации 1 мг Ag2S Lys (Boc) — OH или Fmoc-Gly при использовании TBTU в воде (0,35 мг/мл) достаточно 0,1 мг БСА. В работе предло- в качестве конденсирующего агента получены избиратель-жен новый метод синтеза гибридных наночастиц на основе но защищенные производные KRGD и GRGD соответст-Fe3O4 и КТ Ag2S, заключающийся в нанесении на поверх- венно. Fmoc-группы удаляли 20 % пиперидином в мета-ность МНЧ БСА и осаждении в дальнейшем на белковом ноле, в результате чего получали пептиды со свободными покрытии КТ Для этого к коллоидному раствору Fe3O4- аминогруппами. Далее проводили конденсацию с глутаро-PMIDA добавляли раствор БСА. Молекулы БСА содержат вым ангидридом и получали целевые производные KRGD-в своем составе как свободные карбоксильные, так и ами- и GRGD-пептидов, содержащие спейсеры со свободными ногруппы. Использованные в реакции Fe3O4-PMIDA име- карбоксильными группами соответственно. Защита функ-ют высокий отрицательный поверхностный заряд, что уве- циональных групп пептида была выбрана таким образом, личивает силу связывания молекул БСА с поверхностью чтобы сохранить их биологические свойства и при этом за счет ионного взаимодействия между карбоксильными обеспечить возможность их связывания с другими биомо-группами PMIDA и аминогруппами БСА. Осаждение КТ лекулами или материалами, например с поверхностью МНЧ проводили по аналогии с методикой, разработанной на в целях создания МРТ-контрастных препаратов для визу-1-м этапе работы путем добавления к наночастицам Fe3O4- ализации опухолевых тканей. PMIDA-БСА последовательно Ag+ и S - . Заключение. Разработаны синтетические подходы для Заключение. Предложен новый метод синтеза МНЧ получения производных защищенных KRGD- и GRGD-на основе Fe3O4 и КТ Ag2S, заключающийся в нанесении пептидов, содержащих остатки глутаровой кислоты, при-
№1 I том 15 I 2016 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
34 МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»
годных для их последующей конденсации с другими био- Заключение. Проведена иммобилизация pHLIP на МНЧ молекулами или МНЧ. на основе Fe3O4. pHLIP был закреплен на поверхности Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ(№ 14-03- 3-аминопропилсилан-модифицированных МНЧ при ис-00146-а) и УрОРАН(№ 15-21-3-6). пользовании гетерофункционального линкера EMCS. Полученные МНЧ-pHLIP малотоксичны, а по своим МР-кон- A.М. Дёмин1, А. Г. Першина2, В. В. Иванов2, трастным свойствам сопоставимы с рядом коммерческих О. Б. Шевелев3, К. В. Невская2, Д. О. Ащеулова2, препаратов и могут быть использованы для создания в даль- B.П. Краснов1, А.Э. Сазонов2, Л.М. Огородова2 нейшем препаратов для МР-диагностики. СИНТЕЗ НАНОГИБРИДНОЙ КОНСТРУКЦИИ Работа выполнена при финансовой поддержке Российского на-НА ОСНОВЕ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ FE3O4, учного фонда (проект № 14-15-00247). ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ рН-ЗАВИСИМ I4! М ПЕПТИДОМ (PHLIP), ДЛЯ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ А.М. Дёмин1, А.Г. Першина2, А.Э. Сазонов2, ВИЗУАЛИЗАЦИИ ЗОН ЛОКАЛЬНОГО АЦИДОЗА Л. М. Огородова2, В. П. Краснов1 1ФГБУН«ИОС им. И.Я. Постовского УрО РАН», Екатеринбург; ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ МАГНИТНЫХ 2ГБОУВПО СибГМУМинздрава России, Томск; НАНОЧАСТИЦ ПЕПТИДАМИ И БЕЛКАМИ 3ФГБНУИЦГ СО РАН, Новосибирск 1ФГБУН«ИОС им. И.Я. Постовского УрО РАН», Екатеринбург; Введение. Пептиды pHLIPs (pH Low Insertion Peptides) — 2ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, Томск класс гидрофобных пептидов, способных встраиваться Введение. Наноматериалы на основе магнитных нано-в мембраны клеток при низких значениях рН. Известно, частиц (МНЧ), в первую очередь Fe3O4, часто используются что опухолевые ткани имеют пониженную pH межклеточ- как диагностические (в том числе для магнитно-резонансного пространства. Поэтому pHLIP может служить моле- ной томографии или магнитной релаксометрии) и терапев-кулярным вектором для транспортировки лекарственных тические (гипертермия) агенты, в качестве систем фарма-веществ или, например, магнитных наночастиц (МНЧ) цевтической доставки лекарственных средств, применяемых в опухоль. Таким образом, можно получить высокоэффек- в онкологии и других областях. тивные диагностические препараты для использования Цель исследования — разработка подходов к модифи-в онкологии. кации МНЧ пептидами и белками визуализирующих ди-Цель исследования — разработка нанобиогибридной агностических агентов и препаратов для терапии онколо-конструкции на основе МНЧ, модифицированных сила- гических заболеваний. новыми производными и функционализированных за счет Материалы и методы. В работе использованы МНЧ формирования ковалентной связи с рН-чувствительным на основе Fe3O4 диаметром 10 нм, полученные методом пептидом, предназначенной для выявления зон локально- осаждения из растворов солей Fe3+ и Fe2+. МНЧ предвари-го ацидоза in vivo методом магнитно-резонансной (МР) тельно функционализировали 3-аминосиланом (МНЧ-томографии. NH2) (ковалентно) или ^(фосфонометил)иминодиуксус-Материалы и методы. Для получения нанобиогибрид- ной кислотой (МНЧ-СООН) (нековалентно). В работе ной конструкции использовали МНЧ Fe3O4 диаметром 10 нм, использованы методы инфракрасного, ультрафиолетового полученные методом осаждения из растворов солей Fe3+ излучения, флуориметрии и масс-спектроскопии высоко-и Fe2+. Наночастицы охарактеризованы методами инфра- го разрешения и др. красной спектроскопии, сканирующей и просвечивающей Результаты. Иммобилизацию на функционализиро-электронной микроскопии, динамического рассеяния све- ванные МНЧ можно проводить путем конденсации амино-та. Проведены исследования МР-контрастных свойств или карбоксильных групп на их поверхности со свободными in vitro и in vivo (Bruker, Biospec 117/16 USR, Германия). карбоксильными или аминогруппами белка (или пептида) Результаты. МНЧ модифицировали 3-аминопропил- соответственно при использовании карбодиимидов. На при-силаном, далее проводили конденсацию малеимидного мере конъюгации МНЧ с pHLIP флуоресцентным белком кросс-линкера EMCS, имеющего активированную гидрок- TagGFP2 и антителами к CD117 изучены процесс иммо-сисукцинимидом карбоксильную группу, с аминогруппами билизации пептидов и белков на поверхность МНЧ при на поверхности МНЧ. Иммобилизация pHLIP на МНЧ использовании 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)кар-проведена за счет нуклеофильного присоединения SH- бодиимида (EDC) и возможность протекания побочных группы L—Cys данного пептида к двойной связи остатка процессов, связанных с поликонденсацией молекул пеп-малеимида. В результате получена наногибридная кон- тидов и белков в присутствии карбодиимида. Реакции про-струкция МНЧ — pHLIP, в которой пептид закреплен водили в фосфатном буферном растворе (рН 7,5) при ис-на поверхности ковалентно. МР-контрастные свойства пользовании эквимольных количеств EDC в расчете на МНЧ подтверждены исследованиями in vitro и in vivo, эф- количество функциональных групп на поверхности МНЧ. фективное контрастирование патологической ткани дости- В случае МНЧ-СООН на 1-м этапе проводили активацию гается при введении наноконъюгата в дозе 0,6 мг/кг, сопо- карбоксильных групп EDC, после чего добавляли соответ-ставимой с дозами введения ряда коммерческих препаратов, ствующий аминокомпонент. В случае МНЧ-NH EDC до-например Feridex. По данным ЛДГ- и МТТ-тестов полу- бавляли в реакционную массу в присутствии карбоксиль-ченный наноконъюгат в концентрации до 40 мкг/мл ной компоненты. не оказывал выраженного токсического действия in vitro Заключение. Разработаны химические подходы к по-на клетки линии HTC. лучению МНЧ-конъюгатов с пептидами и белками. Пока-
№1 / том 15 / 2016 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
