CC BY
3
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 541.64:678.5
СИНТЕЗ И ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА НАНОАСКОРБАТА ХИТОЗАНА BOMBYX MORI
Кудрат Кадамбаевич Пирниязов, Дилором Ибрагимовна Асракулова, Сайёра Шарафовна Рашидова
Институт химии и физики полимеров АН РУз
Автор, ответственный за переписку: Кудрат Кадамбаевич Пирниязов, [email protected]
Аннотация. Описан синтез суспензионным методом наноаскорбата хитоза-на Bombyx mori на основе низкомолекулярного хитозана (НМХЗ). Изучены его физико-химические и противомикробные свойства по отношению к Fusarium oxysporum, вызывающего заболевания тутовых деревьев. Полученный нано-аскорбат хитозана на основе низкомолекулярного хитозана обладает большей зоной подавления по сравнению со всеми вариантами против культуры Fusarium oxysporum тутовника. Установлено, что при обработке семян пшеницы нано-аскорбатом хитозана при соотношении компонентов НМХЗ : АК = 4 : 1 снижается уровень заболеваемости головнёвым грибком на 6,6 и 2,4% по сравнению с кон -тролем и эталонам соответственно. Определено влияние соотношения компонентов хитозана и аскорбиновой кислоты на образование наноаскорбата хитозана. Методом ИК-спектроскопии изучены структурные характеристики наноаскорбата хитозана Bombyx mori.
Ключевые слова: наноаскорбат хитозана Bombyx mori, наночастицы, антимикробные свойства, степень связывания
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2024-65-5-424-430
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Республики Узбекистан «Фундаментальные исследования по синтезу и выявлению кинетических закономерностей формирования нанополимерных систем» 2022 года.
Для цитирования: Пирниязов К.К., Асракулова Д.И., Рашидова С.Ш. Синтез и противомикробные свойства наноаскорбата хитозана Bombyx mori // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2024. Т. 65. № 5. С. 424-430.
ORIGINAL ARTICLE
SYNTHESIS AND ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF CHITOSAN NANOASCORBATE BOMBYX MORI
Kudrat K. Pirniyazov, Dilorom I. Asrakulova, Sayyora Sh. Rashidova
Institute of Chemistry and Physics of Polymers
Corresponding author: Kudrat Kadambaevich Pirniyazov, [email protected]
Abstract. This paper describes the synthesis of chitosan nanoascorbate Bombyx mori based on low molecular weight chitosan (LMWC) by the suspension method. Its physicochemical and antimicrobial properties against Fusarium oxysporum, which causes diseases of mulberry trees, have been studied. The resulting chitosan nanoascorbate based on low molecular weight chitosan has a larger suppression zone compared to all
© Пирниязов К.К., Асракулова Д.И., Рашидова С.Ш., 2024
variants against the culture of Fusarium oxysporum mulberry and melon, which makes it possible to use it in presowing seed treatment at a ratio of LMWC:AA components 4:1. It was found that when wheat seeds were treated with chitosan nanoascorbate, the incidence of smut fungus decreased by 6.6 and 2.4 % compared to the control and the standard, respectively. The effect of the ratio of the components of chitosan (CS) and ascorbic acid (AA) on the formation of chitosan nanoascorbate (CSNA) was determined. IR spectroscopy established the structural characteristics of chitosan nanoascorbate Bombyx mori.
Keywords: chitosan nanoascorbate Bombyx mori, nanoparticles, antimicrobial properties, degree of binding
Financial Support. The work was carried out with the financial support of the grant of the Republic of Uzbekistan "Fundamental research on the synthesis and identification of kinetic patterns of formation of nanopolymer systems" in 2022.
For citation: Pirniyazov K.K., Asrakulova D.I., Rashidova S.Sh. Synthesis аnd Antimicrobial Properties оf Chitosan Nanoascorbate Bombyx mori // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. 2024. T. 65. № 5. S. 424-430.
Во всем мире увеличивается потребность в экологически безопасных препаратах, полученных на основе природных полимеров, которые ускоряют рост растений и являются эффективными в борьбе с грибковыми заболеваниями. Такие препараты высокоэффективны в малых концентрациях и благодаря их активному действию используются в сельском хозяйстве в качестве комплексного средства против болезней [1, 4-5]. Нанопроизводные хитозана, в частности наноаскорбат хитозана, являются нетоксичными и экологически безопасными, в составе почвы полностью разлагаются под действием микроорганизмов [2, 3, 8]. В связи с этим большое значение приобретают научно-практические исследования, направленные на изучение условий синтеза и производства наноаскорбата хитозана Bombyx mori, определения его структуры и свойств, а также его применения в сельском хозяйстве. Известно, что производные хитозана, в том числе наноаскорбат хитозана, обладают антимикробными свойствами к патогенам и росто-стимулирующими свойствами, что делает их эффективными при обработке семян сельскохозяйственных культур [6-8].
Наночастицы производных хитозана получают разными методами: ионотропным гелеобра-зованием, распылительной сушкой, ультразвуковым диспергированием, электроспиннингом, осадительной коацервацией и т.п. Некоторые из вышеуказанных способов являются многоэтапными и требуют недоступных реактивов. Метод ионотропного гелеобразования позволяет полу-
чить нанопроизводные хитозана при комнатной температуре в водном растворе, при этом не требуется дополнительной очистки полученных веществ с помощью перекристаллизации и диализа [2, 3, 9-11].
В работе [1] рассмотрены вопросы применения нанопроизводных хитозана, экспериментального материала и методов по созданию наносистем на основе хитозана Bombyx mori. В работах [2, 4] проведен синтез аскорбата хитозана Bombyx mori, а также оценены возможности взаимодействия хитозана Bombyx mori с аскорбиновой кислотой на основе квантово-хи-мических расчетов. Подтверждено, что в результате взаимодействия хитозана Bombyx mori с аскорбиновой кислотой образуются донорно-ак-цепторные связи за счет аминогрупп хитозана и енольной группы аскорбиновой кислоты. Ранее было подтверждено образование олигохитозана Bombyx mori методом кислотного гидролиза на основе высокомолекулярного хитозана и показано образование аскорбата олигохитозана, что доказывает формирование низкомолекулярных производных хитозана Bombyx mori [3]. Проведен анализ научной литературы по получению аскорбата и наноаскорбата хитозана на основе различных источников сырья [2]. Установлена ярко выраженная биологическая активность аскорбата хитозана и наноаскорбата хитозана к заболеваниям человека и растений. Анализ литературы свидетельствует, что методом ионотропного гелеобразования синтезируются нанопроиз-водные хитозана с органическими кислотами, в том числе с аскорбиновой кислотой [2].
В настоящей работе впервые подтверждено образование наноаскорбата хитозана на основе низкомолекулярного хитозана (олигохитозана) Bombyx mori в отсутствие стабилизатора или ионносшивателей, что сокращает многоэтап-ность процесса и длительное промывание от избыточных ионов стабилизатора. Проведено сравнительное исследование противомикроб-ных свойств наноаскорбата хитозана, полученного на основе низкомолекулярного и высокомолекулярного хитозана Bombyx mori.
Объекты и методы исследований
Синтез наноаскорбата хитозана на основе хитозана Bombyx mori мало изучен, в литературе не встречаются оптимальные условия синтеза этого производного [2]. С учетом вышеизложенного проведен синтез наноаскорбата хитозана на основе хитозана Bombyx mori методом ионотроп-ного гелеобразовании в присутствии 0,5%-го раствора стабилизатора - триполифосфата натрия (ТПФ№). Проведен также синтез на основе низкомолекулярного хитозана (олигохитозана), который состоит из наноструктурного хитозана. Молярная концентрация аскорбиновой кислоты 0,05 М. Изучено влияние соотношения компонентов на образование наноаскорбата хитозана. При этом соотношение компонентов низкомолекулярного хитозана и аскорбиновой кислоты варьировали в определенном порядке (1:1, 2:1, 3:1, 4:1). Время синтеза 30 мин. В качестве осадите-ля использовали ацетон. Степень связывания хитозана с аскорбиновой кислотой (АК) оценивали по соотношению
(МАК) эксп. / (Мак) расч. '
Избыточное количество аскорбиновой кислоты определяли методом щелочного титрования индикатором фенолфталеина с помощью уравнения [12]:
C5H7O5 - СОН + NaOH = = [C5H7O5 - œ-]Na+ + НОН.
При определении характеристической вязкости растворов хитозана поддерживали температуру 303,15 ± 0,05 К. При этом концентрация исходного хитозана составляла 0,5%. Установлено время истечения раствора (?) и растворителя (?0), отношение вязкости (п/п0), удельная вязкость (пуд = (п - П 0)/П0 и число вязкости Пуд./С = (п - П0)/П0С [1, 2, 12]. Характеристическую вязкость определяли методом графической экстраполяции величин Пуд/С к нулевой концентрации. При этом получили линейные зависимости приведенной вязкости Пуд/С от концентрации по уравнению Хаггинса:
Пуд/С = [n] + Kx[n]2 X C.
Молекулярная масса определена согласно формуле
Определение молекулярной массы исходного хитозана
В работе использовали хитозан Bombyx mori с молекулярной массой 101 кДа и степенью дезаце-тилирования 84%, полученный из куколок тутового шелкопряда. В целях синтеза наноаскорбата хитозана из низкомолекулярного хитозана использовали хитозан с молекулярной массой 17,1 кДа. В качестве растворителя использовали буферный раствор (0,3 М СН3СООН + 0,3 М СН3СОО№).
[n] = 1,41 X 10-4 X МП0,83.
Определение степени деацетилирования хитозана
Степень деацетилирования (СДА) исходного и низкомолекулярного хитозана определяли методом кондуктометрического титрования в растворителе (0,1 н. соляная кислота) на приборе «Metler Tolledo». Для щелочного титрования был подготовлен 1%-й раствор хитозана. Степень деацетилирования хитозана определена по формуле:
СДА = 203,3 х 100/(42 + 1000 х m0/ CNa0H х FNa0H) , где 203,3; 42; 100; 1000 - расчетные коэффициенты; m - навеска хитозана; V - объем расходуемого титранта NaOH, мл; C Na0H - концентрация NaOH.
Определение противомикробных свойства наноаскорбата хитозана
Посев производили в питательной среде: агар Чапека (состав, мг/л: сахароза - 30; NaN03 - 2,0; KH2P04 - 1,0; KCl - 0,5; MgS04 - 0,5 FeS04 -0,01; pH 7,2).
В качестве тест-культур использовали кол -лекционные штаммы микромицетов, представляющие собой фитопатогены, возбудители болезни тутовника Fusarium oxysporum. Проводили также производственные опыты в богарных условиях Кашкадарьинской области на экспериментальных полях Научно-исследовательского института зерна и зернобобовых культур против пыльной и твердой головни. В качестве объекта выбраны семена озимой пшеницы сорта «Тезпишар», районированной в Республике Узбекистан. Исследования проводили на двух гектарах опытного поля в четырехкратной
повторности. В качестве эталона использовали препарат «Далтебу». Уровень заболеваемости был проанализирован в соответствии с эталоном и Наноаскорбатом хитозана. Для предпосевной обработки семян пшеницы путем капсулирования использовали 0,5%-й раствор наноаскорбата хитозана при соотношении компонентов ХЗ : AK = 4:1.
Результаты и их обсуждение
Полученные результаты подтверждают, что при соотношении низкомолекулярного хитозана (НМХЗ) и аскорбиновой кислоты (АК), равном 2:1, содержание аскорбиновой кислоты в составе НАХЗ составляет 16,5%, а при соотношении компонентов НМХЗ : АК = 4:1 массовая доля аскорбиновой кислоты снижается до 14,6%. Полученные данные представлены в табл. 1. Полученные результаты показывают, что с увеличением мольного соотношения исходного и низкомолекулярного хитозана в реакционных средах по сравнению с аскорбиновой кислотой и стабилизатором (триполифосфатом натрия) обнаружено увеличение степени связывания (СС) аскорбиновой кислоты и выхода реакции образования наноаскорбата хитозана. Замечено, что при использовании триполифосфата натрия в качестве стабилизатора наблюдается увеличение содержания и степени связывания аскорбиновой кислоты, что не только свидетельствует о взаимодействии аскорбиновой кислоты с хи-тозаном, но и подтверждает, что аскорбиновая кислота частично нейтрализуется ионами натрия, образующимися за счет диссоциации соли триполифосфата натрия.
Результаты исследований атомно-силовой микроскопии (АСМ)
Результаты атомно-силовой микроскопии (АСМ) подтверждают, что в полученных образцах наноаскорбата хитозана сформированы нано-частицы размерами от 350 до 50 нм с равномерным распределением по поверхности (рис. 1, 2).
Результаты ИК- спектроскопических исследований
Структура полученных образцов исходного хитозана и наноаскорбата хитозана подтверждена методом ИК-спектроскопии на спектрометре «IR Bruker» (Германия). Полученные ИК-спектры приведены на рис. 3. В ИК-спектре исходного хитозана Bombyx mori выявлены основные характерные полосы поглощения при 1587 и 1640 см 1, соответствующие аминогруппам и ацетамидным группы макромолекул хитозана. Кроме того, в области 1420 см1 обнаружены соответствующие полосы деформационных колебаний для метиленовых групп. В диапазоне 3200-3350 см 1 выявлены полосы поглощения, относящиеся к валентным колебаниям гидрок-сильных групп макромолекул хитозана. В ИК-спектре полученного наноаскорбата хитозана проявляется смещение полос поглощения в сторону меньших волновых чисел от 1587 до 1550 см 1 по сравнению с полосами поглощения хитозана, что указывает на образование донорно-акцептор-ной связи аминогрупп исходного хитозана с еноль-ными группами аскорбиновой кислоты.
Установлено некоторое различие при сопоставлении полос поглощения ацетамид-ных групп хитозана и карбонильных групп
Т а б л и ц а 1
Зависимость степени связывания хитозана с аскорбиновой кислотой при образовании наноаскорбат хитозана ( Т = 25 °С, £ = 30 мин) от соотношеиня компонентов (исходная концентрация аскорбиновой
кислоты 0,05 моль/л)
Соотношение компонентов Расчетная концентрация АК (С, %) Концентрация ДАК (С, %) Степень связывания, % Выход, С % Размер частиц, нм
НМХЗ:АК 2:1 35,3 16,5 46,7 66,4 -
НМХЗ:АК 3:1 26,7 14,9 56,0 71,0 -
НМХЗ:АК 4:1 21,4 14,6 68,4 77,5 50-200
НМХЗ:АК 5:1 17,9 12,1 67,6 74,7 -
ХЗ:АК:ТПФ№ 4:1:0,25 21,4 18,8 87,8 87,5 50-350
ХЗ:АК:ТПФ№ 3:1:0,5 25,0 20,5 82,0 77,8 50-200
Рис. 1. Топография поверхности наночастиц наноаскорбата хитозана при соотношении компонентов 4:1, снятая атомно-силовым микроскопом «Agilent 5500» в полуконтактном режиме
0 20 40 60 80 100 %
Рис. 2. Топография поверхности наночастиц наноаскорбата хитозана при соотношении компонентов 3:1:0,5, снятая атомно-силовым микроскопом «Agilent 5500» в полуконтактном режиме
аскорбиновой кислоты в области 1624 см-1. В диапазоне 1400-900 см-1 проявляются полосы поглощения, характерные для хитозана. Изменение интенсивности и смещение характерных полос поглощения на ИК-спектре наноаскорбата хитозана в сравнении с ИК-спектром исходного хитозана свидетельствуют об образовании нанопроизводного хитоза-на - наноаскорбата хитозана.
Противомикробные свойства НАХЗ
Проведены исследования по определению противомикробных свойств наноаскорбата хитозана к чистым культурам Fusarium oxysporum, вызывающим заболевания сельскохозяйственных растений, в частности тутовых деревьев. Поражаемость тутовника определена общепринятыми фитопатологическими и микологическими методами [13]. Штаммы Fusarium oxysporum, полученные из корней и стеблей растений, размножены в лабораторных условиях. Выделенные штаммы выращивали в чашках Петри с помощью искусственной питательной среды Чапека с агаром. В центр чашки Петри наливали 0,3 мл
анализируемых растворов НМХЗ, НАХЗ и препарата УЗХИТАН. Эксперименты проводили в трех повторностях при температуре 30 °С. Зона подавления определена через 6 дней после посева штамма. Полученные данные представлены в табл. 2. В результате исследований установлено, что использование наноаскорбата хитозана при соотношении низкомолекулярного хитозана и аскорбиновой кислоты, равном 4:1, позволяет получить наилучшие зоны подавления по сравнению с исходным НМХЗ. Необходимо отметить, что с увеличением концентрации наноаскорбата хитозана и низкомолекулярного хитозана происходит заметное увеличение зоны подавления. Кроме того, при изучении развития грибов установлено, что грибной мицелий не развивается вокруг зон подавления наноаскорбата хитозана.
Таким образом, в лабораторных условиях определены антимикробные свойства наноструктурных соединений НМХЗ и НАХЗ, а также препарата УЗХИТАН, синтезированных в Институте химии и физики полимеров на основе хитозана Bombyx mori. Полученные результаты подтверждают, что наноаскорбат хитозана при соотношении
Рис. 3. ИК-спектры исходного хитозана Bombyx mori (1) и наноаскорбата хитозана
Bombyx mori (2)
Т а б л и ц а 2
Влияние наноаскорбата хитозана на развитие Fusarium oxysporum на тутовнике
Образцы Зона подавления, мм Средняя зона подавления, мм
I II III
УЗХИТАН - - - -
НаноУзхитан 10 10 - 7,0
НАХЗ 4:1 (0,1%) синтезирован на основе НМХЗ 20 24 27 23,0
НАХЗ 4:1 (0,5%) 35 35 33 34,0
НАХЗ 2:1 (0,1%) 1б 10 14 13,0
НАХЗ 2:1 (0,5%) 20 2б 28 24,б
НМХЗ (0,1%) 32 29 35 32,0
НМХЗ (0,5%) 3б 30 30 32,0
НАХЗ 4:1 (0,1%) синтезирован в присутствии ТПФ№ 22 24 28 24,б
НАХЗ 4:1 (0,5%) 2б 20 30 25,3
компонентов ХЗ : АК = 4:1 обладает лучшей по сравнению с эталоном зоной подавления культуры Fusarium oxysporum (34 мм). Отметим, что полученный наноаскорбат хитозана на основе низкомолекулярного хитозана также обладает большей зоной подавления по сравнению со всеми вариантами культуры Fusarium oxysporum тутовника, что дает возможность использования его при предпосевной обработке семян. Также установлено, что с увеличением концентрации
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Милушева Р.Ю., Рашидова С.Ш. Хитин, хитозан Bombyx mori и наносистемы на их основе. Ташкент, 2016.
2. Пирниязов К.К., Рашидова С.Ш. // Наука и инновационное развитие. 2020. № 5. С. 47.
3. Pirniyazov K.K., Tixonov V.E., Rashidova S.Sh. // International J. Modern Agriculture. 2021. Vol. 10. N 2. P. 1244.
4. Пирниязов К.К. Синтез, свойства и применение аскорбат хитозана Bombyx mori: Дис. ... PhD. хим. наук. Ташкент, 2020. С. 67.
5. Sekara V., Rajendrana K., Vallinayagama S., Deep-akb V.S. // J. Industrial and Engineering Chemistry 62 (2018) 239-249 (https://doi.org/10.1016/j. jiec.2018.01.001).
6. Shipovskaya A.B., Zudina I.V., Fomina V.I., Malinkina O.N. // Butlerov Communications. 2015. Vol. 41. N 3. P. 82.
раствора от 0,1 до 0,5% происходит значительное увеличение антимикробных свойств наноаскорбата хитозана.
Изучены физико-химические характеристики наноаскорбата хитозана методами ИК- и АСМ-спектроскопии. Установлено, что смещенные полосы поглощения в области 1550 см1 на ИК-спектре наноаскорбата хитозана в сравнении с ИК-спектром исходного хитозана свидетельствуют об образовании наноаскорбата хитозана Bombyx mori.
7. Farhatun N.M., Mohd Z.H. // Molecules. 2020. N 25. P. 1611 (Doi:10.3390/molecules25071611).
8. Рашидова Д.К., Амантурдиев Ш.Б. // Аграрный вестник Узбекистана. 2020. № 1. С. 26.
9. Silvia R., Barbara V. et al. // Mar. Drugs. 2017. N 15. P. 319 (DOI: 10.3390 / md15100319).
10. Ahini§ik A.T. et al. // Hacettepe J. Biol. Chem. 2018. Vol. 46. N 1. P. 69 (https://doi.org/10.1016/jjiec.2018.01.001).
11. Pirniyazov K.K., Tixonov V.E., Rashidova S.Sh. // Bulletin of the Karaganda University Chemistry Series. 2021. N 1 (101). P. 91 (https://doi.org/10.31489/2021Ch1/91-98).
12. Pirniyazov K.K., Rashidova S.Sh. // Bulletin of the Karaganda University chemistry series. 2020. № 3 (99). P. 38 (DOI 10.31489/2020Ch3/38-43).
13. Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г., Семенова Е.В., Мыльникова С.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. М., 1983. С. 130.
Информация об авторах
Кудрат Кадамбаевич Пирниязов - мл. науч. сотр. Института химии и физики полимеров АН РУз ([email protected]);
Дилором Ибрагимовна Асракулова - мл. науч. сотр. Института химии и физики полимеров АН РУз ([email protected]);
Сайёра Шарафовна Рашидова - директор Института химии и физики полимеров АН РУз, докт. хим. наук, проф., академик ([email protected]). Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Соблюдение этических стандартов
В данной работе отсутствуют исследования человека и животных.
Статья поступила в редакцию 16.09.2022; одобрена после рецензирования 16.01.2023; принята к публикации 16.02.2024.
