CC BY
19
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2017, том 60, №11-12_
ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 615.9; 615.012
М.Шухратзода, У.Р.Раджабов, А.У.Козихонов, Ш.А.Турдиев*, М.М.Шарифова*, М.Н.Давлатов
СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕТРАРГА
Таджикский государственный медицинский университет им. Абуали ибн Сино, Институт проблем биологической безопасности Таджикской академии сельскохозяйственных наук
(Представлено академиком АН Республики Таджикистан К.Х.Хайдаровым 27.10.2017 г.)
Приведены результаты определения токсичности нового синтезированного соединения серебра (I) с метронидазолом Метрарга. Установлено, что Метрарг обладает высокой антимикробной активностью, превышающей таковую у ампициллина по отношению к Escherichia coli, Salmonella, Pasterella, Trichophyton и Staphylococcus.
Ключевые слова: координационные соединения, серебро, метронидазол, Метрарг.
Эффективность терапевтических свойств соединений серебра определяется его способностью подавлять факторы персистенции представителей патогенных микропаразитоценозов. Особое внимание уделяется адгезивной и антилизоцимной активности микроорганизмов как определяющей характер и длительность инфекционного процесса при паразитировании в организме хозяина. Также отмечено влияние различных физических факторов, химических веществ и лекарственных препаратов на широкий круг биологических свойств микроорганизмов, что необходимо учитывать при проведении лечебно-профилактических мероприятий при инфекционных заболеваниях животных [1].
Высказано предположение, что летальная концентрация ионов серебра в клетке эквивалентна количеству имеющихся бактериальных клеточных ферментов. Это подтверждалось тем, что чувствительные к серебру бактерии имеют способность поглощать и концентрировать в себе его ионы.
Скорость антимикробного действия является практически мгновенной, как только серебро достигнет микроорганизма. Изучение антимикробного эффекта серебра проводится наряду с рассмотрением вопросов его токсичности. Как и большинство тяжелых металлов, серебро очень медленно выводится из организма и при постоянном поступлении накапливается. Поэтому исследование и изучение фармакологических свойств новых координационных соединений - производных азолов представляют большую практическую ценность [2].
Исходя из этого, в Таджикском государственном медицинском университете им. Абуали ибн Сино (ТГМУ) совместно с Институтом проблем биологической безопасности ТАСХН синтезировано и исследовано новое координационное соединение серебра (I) с метронидазолом, именуемое Метрар-гом, который проявляет высокую антимикробную активность [3].
Целью данной работы явилось изучение биологических свойств синтезированного координационного соединения серебра (I) с метронидазолом (Метрарг), изыскание новых более эффективных антимикробных средств, проведение лабораторных испытаний.
Адрес для корреспонденции: Раджабов Умарали. 734003, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 139, Таджикский государственный медицинский университет. E-mail: [email protected]
Экспериментальная часть
Синтезированы координационные соединения серебра (I) с мет- ронидазолом. При этом для нахождения оптимальных условий выделения комплексов с заранее заданными физико-химическими и биологическими свойствами были использованы результаты оксредметрических исследований комплексообразования металлов в водных растворах азолов [4]. Полученные координационные соединения Метрарга, активными компонентами которых являются металл - комплексообразователь серебра (I) и координированный лиганд метронидазола [2,4]. Химическое название Метрарга согласно номенклатуре координационных соединений ЮПАК - тетраметронидазол серебра(1) сульфат со следующей общей формулой: [AgL4] HSO4, где L - метронидазол. Состав синтезированного соединения в общем виде установлен методами оксредметрии, элементного анализа и ИК-спектроскопией. Теоретическая молекулярная масса Метрарга равна 781, а экспериментально найденная методом криоскопии - 779.
Безвредность комплексов изучена и показана в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсичных свойств препаратов» [5]. Противомикробную и противогрибковую активность препаратов определяли методом серийных двукратных их разведений в МПБ. Использовали суспензии односуточных тест-культур (музейные штаммы и изоляты E.coli, Salmonella dublin, Pasterella multocida, Proteus vulgaris, выделенные от больных диареей телят в животноводческих хозяйствах РТ) в изотоническом растворе хлорида натрия в количестве 2х108 м.к. в 1 мл. Концентрацию соединения, которая вызывала задержку роста культуры (прозрачный бульон), считали минимальной бактериостатической (МБсК). При пересеве на МПА определяли минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК), которая вызывала гибель микроорганизмов (отсутствие роста в течение 48 - 72 ч). Параллельно изучались контрольные варианты МПБ и МПА без препарата. Поставленная цель будет достигнута тем, что будет применяться новое координационное соединение серебра с метрони-дазолом Метрарг, который синтезируется взаимодействием сульфата серебра(1) с метронидазолом, в водной среде [4]. Работа проводилась в ЦНИЛ ТГМУ и в лаборатории Таджикского института проблем безопасности РТ. Безвредность Метрарга изучали в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсичных свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (М., 1988). Опыт проводили на 30 кроликах и 30 белых мышах [5].
Результаты и их обсуждение
Оксредметрические исследования показали, что в изученной системе в области рН=3.0-9.0 в растворах доминируют моноядерные координационные соединения. На основании анализа зависимостей окислительного потенциала от концентрационных переменных, предположено, что в изученной системе в равновесии находятся комплексы серебра (I) - метронидазол различного состава.
Установление состава координационных соединений серебра (I) в водном растворе метрони-дазола в широкой области рН методом оксредметрии выполнено в области концентрации серебра (I) =1-10 - 1-10"4 моль/л, ионной силе 0.1 моль/л и температуре 308 К. Результаты оксредметрических исследований были использованы при синтезе координационных соединений серебра (I) с метрони-дазолом (Метрарг).
Для этого к 20 мл Н2О, в которой содержалось 0.3 г Ag2SO4, при интенсивном перемешивании добавляли 0.6 г метронидазола. После нескольких минут перемешивания наблюдали полное растворение Ag2SO4 в избытке метронидазола. Через час из раствора выпал осадок жёлто-зелёного цвета. Образовавшийся осадок отфильтровали, промыли холодной водой и высушили в вакуумном эксика-
торе над твёрдым КОН. Выход 94%. Комплекс растворяется в воде, не растворяется в спирте, ацетоне и в ДМСО при 25 градусах.
С целью оценки безвредности Метрарга в ориентировочнотерапевтической дозе 0.03 г/кг массы тела с водой перорально (в виде 10% раствора) в объеме 0.5 мл вводили белым мышам (массой 18 - 20 г, п=5), 10 мл - кроликам породы шиншилла (массой 2.5 - 2.7 кг, п=5) 2 раза в сутки в течение 7 дней.
За лабораторными животными наблюдали в течение 14 дней, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.
О безвредности ориентировочно-терапевтической дозы Метрарга свидетельствуют результаты наблюдения за животными в течение 14 дней: не было ни одного случая падежа животных.
Острую токсичность Метрарга изучали в опытах на кроликах (массой 1.5 - 2.0 кг, п=4), из которых по принципу парных аналогов сформировали по 7 групп.
Перед началом исследований за лабораторными животными, которых содержали в обычных условиях, наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали вечером накануне опыта, прием воды не ограничивали.
Кроликам Метрарг в виде 10% раствора вводили однократно перорально. В объеме 0.2 мл, в дозе 0.25 г/кг массы тела (1 группа), 0.4 мл в дозе 0.5 г/кг (2 гр.), 0.6мл в дозе 2.5 г/кг (3 гр.), 1.0 в дозе 5.0 г/кг (4 гр.), 1.2 в дозе 6.0 г/кг (5 гр.), 1.5 в дозе 7.8 г/кг массы тела (6 гр.) и 7-я группа контрольная, которым вводили дистиллированную воду. Через 6 ч после введения препарата производили очередную дачу корма кроликам, которых в дальнейшем переводили на обычный режим. При наблюдении (14 дней) за лабораторными животными учитывали общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.
Таким образом, по результатам токсикологических исследований было определено, что Метрарг в дозе 7.8 г/кг массы тела вызывает гибель всех опытных животных (ЛД100 - 7.8 г/кг) и в дозе 6.0 г/кг вызывает гибель 50% (ЛД50 - 6.0 г/кг) животных.
Таблица 1
Результаты испытаний острой токсичности препарата Метрарг
Доза Метрарга г/кг веса лаб. ж-х Фактический эффект LD (%)
0.25 0/6 00
0.5 0/6 00
2.5 0/6 00
5.0 1/6 16.7
6.0 3/6 50
7.8 6/6 100
Примечание: цифра в числителе - количество погибших животных; цифра в знаменателе - количество животных в группе.
Влияние на кожу и слизистые оболочки. Алергенные и раздражающие свойства вещества проверяли на кроликах (самках, массой 2.5 - 2.7 кг, п=8), которым ежедневно на кожу наносили по 2 капли 5%, 1%, 0.5%, 0.1% раствора Метрарга в течение 21 дня, также изучали повторное местное действие Метрарга. Животным контрольной группы (п=8) по той же методике наносили по 2 капли подсолнечного масла. Наблюдение за кроликами обеих групп вели в течение 60 дней. В результате
проведенных экспериментов установлено, что Метрарг не вызывает даже незначительных явлений гиперемии, отека, расчесов на месте аппликации. У животных не выявлено признаков токсикоза при накожной аппликации препарата.
Таким образом, у Метрарга не выявлено кожно-раздражающего и кожно-резорбтивного действия.
Действие Метрарга на слизистую оболочку глаза изучали на кроликах (самках, массой 2.5-2.7 кг), которых разделили на две группы (п=8). Животным первой группы в конъюнктивальный мешок однократно закапывали 0.1% раствор Метрарга в количестве одной капли, второй (контрольной) -дистиллированную воду в том же количестве. Установлено, что местное раздражающее действие Метрарга на слизистые глаз при однократном введении выражено слабо.
Хроническую токсичность изучали в опытах по кормлению Метраргом в течение 20 суток на трех группах белых мышей (массой 18-20 г) и трех группах кроликов породы шиншилла (массой 2.5 - 2.7 кг) в 2-х, 5-ти и 10-ти кратной ориентировочно-терапевтической дозе (0.03 г/кг массы тела). Животные контрольных групп испытуемого соединения не получали. За лабораторными животными наблюдали в течение 30 дней.
Противомикробная активность Метрарга в сравнительном аспекте (контроль - метронидазол и ампициллин) изучали в опытах in vitro в отношении музейных штаммов и изолятов (патогенных) микроорганизмов (E. coli, Salmonella dublin, Pasterella multocida и гриб Trichophyton), типичных по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам. Изучение противомикробной активности проводили методами серийных разведений и диффузии в агаре.
Метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Из основного раствора готовили последовательные растворы двукратного разведения в МПБ (мясопептонный бульон) в объеме 2 мл. Суточную культуру тест-микробов разводили изотоническим раствором хлорида натрия до концентрации 5 млн. микробных тел в 1 мл. Затем в каждую пробирку высеивали по 0.5 мл приготовленной взвеси микроорганизмов. Посевы инкубировали при 37оС в течение 24-48 ч. По истечении срока инкубации учитывали результат. Минимальной бактериостатической считали концентрацию (МБсК), которая вызывала задержку роста культуры по сравнению с контролем. Для изучения бактерицидного действия испытуемых соединений делали высевы из пробирок с прозрачной средой на плотные питательные среды. Минимальной бактерицидной считали концентрацию (МБцК), при которой отмечали полное угнетение роста тест-культур при пересеве их на МПА (мясопептонный агар), не содержащий испытуемых веществ (табл. 2).
Таблица 2
Антибактериальная активность Метрарга по сравнению с ампициллином и метронидазолом
Соединение Конц. (мкг/мл) Тест-культура
E.coli S.dublin P.multocida Trichophyton
Метрарг МБсК 6.25 6.25 3.12 25.00
МБцК 12.50 12.50 6.25 12.50
Метронидазол МБсК 31.20 31.20 15.60 62.50
МБцК 62.50 62.50 31.20 125.00
Ампициллин МБсК 12.50 12.50 6.25 0
МБцК 25.00 25.00 12.50 0
Установлено, что Метрарг оказывает бактериостатическое и бактерицидное действие в отношении исследованных тест-культур. Наибольшую чувствительность к Метраргу проявляет P.multocida (МБсК - 3.12 мкг/мл). В отношении E.coli и S.dublin МБсК метронидазола составила 6.25 мкг/мл. МБсК ампициллина для P.multocida - 6.25 мкг/мл и для Е.СоП и S.dublin - 12.5 мкг/мл.
Методом диффузии в агаре в качестве питательной среды использовали МПА (мясопептон-ный агар). Расплавленную питательную среду разливали в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм по 20 мл, расположенные на горизонтальной поверхности. В каждой чашке готовили по 3 лунки на расстоянии примерно 4 см друг от друга и от края чашки. В каждую лунку разливали по 1 мл испытуемых соединений из разведений 1:100. Перед посевом чашки Петри подсушивали в течение 4560 мин в термостате при 37°С с открытыми крышками. В качестве посевного материала использовали суточную бульонную культуру P.multocida, E.coli и S.dublin. Бактериальную миллиардную взвесь в объеме 1мл наносили на поверхность агара и равномерно распределяли по всей поверхности чашки. Затем чашку наклоняли для стока избытка жидкости, которую удаляли пипеткой. Чашки инкубировали в течение 24 часов при температуре 35-37°С в перевернутом положении, чтобы предотвратить размывание газона конденсационной жидкостью. Наличие зоны задержки микробного роста вокруг диска измеряли с помощью линейки (табл. 3).
Таблица 3
Зоны задержки роста бактерий при воздействии Метраргом по сравнению с ампициллином
Вещество Содержание в лунке, мг Диаметр зон, мм
Staph. Salmonella Pasterella
Метрарг 100 < 15-16 < 13-14 < 13-14
Ампициллин 100 < 12-13 < 10-11 < 6-8
Таким образом установлено, что Метрарг обладает высокой антимикробной активностью, превышающей таковую у ампициллина по отношению к E.coli, Salmonella, Pasterella и Trichophyton. Противомикробная активность Метрарга колебалась от 6.25 до 25 мкг/мл. Его активность по сравнению с метронидазолом выше в 2-5 раза, а с ампициллином - в 2 раза. Результаты проведённых исследований свидетельствуют о высокой антимикробной активности Метрарга.
На основании вышеизложенного можно заключить, что Метрарг относится к категории малотоксичных препаратов для лабораторных и сельскохозяйственных животных при его применении в терапевтических дозах.
Поступило 18.09.2017 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кузьмин А.А. Антигельминтики в ветеринарной медицине. - М.: «АКВАРИУМ ЛТД», 2001, 144 с.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства в 2 т.: т.1., т.2. - М.: ООО «Новая волна» , 2004, 540 и 608 с.
3. Патент РТ №TJ 1701158. Метрарг проявляющий антимикробную активность, Раджабов У.Р., Шухратзода М., Козихонов А.У., Турдиев Ш.А., Шарипова М.М., Абдуллозода Х.Ш., Ёрмамадова С.Г. В Гос. реестре зарегистрирован 10.11.2017.
4. Раджабов У.Р, Ёрмамадова С.Г., Рахимова Р.Н., Мижгон Шухратзода. Синтез и применение метал-лосодержащих биоактивных координационных соединений. - Душанбе: Ирфон, 2017, 151 с.
5. Маланин Л.П., Третьякова А.Д. Ветеринарные препараты. - М.:Агропромиздат,1988, 319 с.
М.Шухратзода, У.Р.Рачабов, Ш.А.Турдиев*, М.М.Шарипова*, М.Н.Давлатов
^ОСИЛШАВЙ ВА ХОСИЯТ^ОИ БИОЛОГИИ ПАЙВАСТА^ОИ КООРДИНАТСИОНИИ НУЦРА (I) БО МЕТРОНИДАЗОЛ
Донишго^и давлатии тиббии Тоцикистон ба номи Абуали ибни Сино,
*Институти масоили амнияти биологии Академияи илм^ои кишоварзии Тоцикистон
Дар асоси тадкикоти оксредметрй синтези пайвастагии нукра (I) бо метронидазол ба род монда шуд. Безарарй, кобилияти аллергенй ва вояи кушандагии мавод муайян карда шуд. Бо усули диффузионй хосияти зиддимикробии маводи тадкикшуда аник карда шуд. Маълум гашт, ки пайвастагии нукра бо метронидазол камзадр буда, дар меъёри муайяншуда метавонад дар хочагидои чорводорй барои муоличаи беморидои дайвонот истифода шавад. Калима^ои калиди: пайвастагиуои комплексы, нукра, метронидазол, Метрарг.
M.Shuhratzoda, U.R.Rajabov, SH.A.Turdiev*, M.M.Sharipova*, M.N.Davlatov SYNTHESIS AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE COORDINATION COMPOUND OF SILVER WITH METRONIDAZOLE
Avicenna Tajik State Medical University, Institute of biological safety problems of the Tajik academy of agricultural sciences
On the basis of oxidative capacity and oxidative function studies, a complex compound of silver (I) with metronidazole was synthesized. Was established harmlessness, an allergenic property and a lethal dose of a substance, Diffusion method was used to determine the antimicrobial property of the substance under study. It became clear that the complex with a meter is low-toxic and a certain dose can be used in agriculture for the treatment of animals. Key words: complex compounds, argentum, metronidazole, Metrarg.
