CC BY
20
Раздел
02.00.10 Биоорганическая химия
УДК 546.23: 54.057: 577.112.34
DOI: 10.17122/bcj-2019-2-48-54
П. А. Полубояринов (к. с.-х. н., доц.) А. А. Аниськов (к.х.н., доц.) 2, В. И. Швец (д.х.н., проф.) 3
СИНТЕЗ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ 2-АМИНО-3-(МЕТИЛСЕЛАНИЛ)БУТАНОВОЙ КИСЛОТЫ -
НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО 3,3-ДИМЕТИЛ-£-СЕЛЕНОЦИСТИНА
1 Пензенский государственный университет архитектуры и строительства, кафедра «Инженерная экология» 440028, г. Пенза, ул. Германа Титова, 28, тел. (8412) 497277, e-mail: [email protected] 2 Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского,
кафедра органической и биоорганической химии 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, е-mail: [email protected] 3 Московский технологический университет (Институт тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова), кафедра биотехнологии и промышленной фармации 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86, тел. (495)9368897, e-mail: [email protected]
P. A. Poluboyarinov 4, A. A. Aniskov 2, V. I. Shvets 3
SYNTHESIS AND ANALYTICAL CONTROL OF 2-AMINO-3-(METHYLSELANYL) BUTANIC ACID - A NEW DERIVATIVE OF 3,3-DIMETHYL-L-SELENOCYSTINE
1 Penza State University of Architecture and Construction 28, Titova Str., 440028, Penza, Russia, ph. (8412) 497277, e-mail: [email protected]
Saratov State University 83, Astrakhanskaya Str, 410012, Saratov, Russia, е-mail: [email protected]
3 Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies 78, Vernadsky Avenue, Moscow, Russia, ph. (495)9368897, e-mail: [email protected]
Синтезированы новая селенсодержащая аминокислота — 2-амино-3-(метилселанил)бутановая кислота из 3,3'-диметил^-селеноцистина, которая является структурным аналогом природных серосодержащих аминокислот, а также ¿-метил-селеноцистеин обладающий высокой противоопухолевой активностью из ¿-селеноцистина. В ходе проведенных исследований разработаны методики аналитического определения методами восходящей ТСХ и ВЭЖХ селенсодержа-щих аминокислот и подтверждены их чистота и идентичность.
Ключевые слова: аминокислоты; 2-амино-3-(метилселанил)бутановая кислота; 3,3'-диме-тил^-селеноцистин; ВЭЖХ; ¿-метилселеноци-стеин; ¿-селеноцистин; селен; ТСХ.
A new selenium containing amino acid 2-amino-3-(methylselanyl) butanic acid, a structural analog of natural sulfur containing amino acids, and L-methyl selenocystein with high antitumor activity were synthesized from 3,3'-dimethyl-L-selenocystine and L-selenocystine accordingly. Methods of TLC and HPLC for the determination of selenium containing aminoacids were developed. Purity and identity of the appropriate selenium derivatives were proved.
Key words: 2-amino-3-(methylselanyl) butanic acid; HPLC; amino acids; 3,3'-dimethyl-L-selenocystine; L-methylselenocystein, L-selenocystine, selenium, TLC.
Дата поступления 11.04.19
Селенсодержащие аминокислоты обладают высокой биологической активностью, в первую очередь антиоксид антной, иммуномодулирую-щей и гепатопротекторной, а также способностью защиты от онкологических, кардиологических и нейрогенных заболеваний, что определяет
" 1
важность исследования данных соединений .
Высокая биологическая активность метилированных форм серосодержащих аминокислот общеизвестна. К таковым относится метил-лантионин 1 — нестандартная серосодержащая аминокислота, которая впервые была обнаружена как компонент пептидных антибиотиков субтилина 2'3 и низина 4, а также присутствует в дрожжах (БассЬатошусез сетею{з{ае) 5.
н21^<рн-соон н21^сн-соон н21^Сн-соон
производного селеноцистина, получаемого из доступной аминокислоты, L-треонина по методике
10
и^-еиз h2i^chcooh 1
H2^HCOOH
CH2 SeH 4
H<p-CH3 SH 2
H2I^C ^COOH CH2
Se
Se C H2
H2I^C HCOOH 5
и^-еиз
S
5
hc-ch3
I 3
h2i^ch-cooh 3
H2I^CH"COOH
и^еиз
Se
Se
и^еиз H2rCHCOOH
6
H2^CHCOOH H2I"C^-COOH C H2 H^CH3
Se Se
СН3 СН3
7 8
Компонентом метиллантионина является аминокислота трео-3-метил-О-цистеин ((25, 35)-2-амино-3-меркаптобутановая кислота) 2, а ее окисленной формой — 3,3'-диметил-0-цис-тин 3 6. Данные серосодержащие аминокислоты были синтезированы из треонина. Соответствующие им селенсодержащие аналоги неизвестны, как и их биологическая активность.
Учитывая высокую антиканцерогенную активность известных метилированных производных селеноцистеина — L-метилселеноцис-теина 7 и у-глутамил-Бе-метилселеноцистеина [7-9], представляет интерес получение соответствующих производных L-селеноцистина.
Целью настоящего исследования являлся синтез 2-амино-3-(метилселанил)бутановой кислоты 8 из 3,3'-диметил-Ь-селеноцистина ((2R)-2-амино-3-[(2^)-2-амино-3-гидрокси-3-оксипро-пил] диселенилбутановой кислоты) 6 — нового
Материалы и методы исследования
Хроматографические тесты проводили на пластинах Сорбфил методом восходящей ТСХ. После элюирования в системе растворителей растворителей и-бутанол—уксусная кислота-вода (4 : 1 : 1) и высушивания пластины пятна аминокислот проявляли опрыскиванием 0.5%-ным раствором нингидрина в изопропи-ловом спирте.
Пробоподготовка и анализ аминокислот проводился по методике Для получения фенилтиокарбамильного производного (ФТК-производное), к 0.1—0.3 см3 раствора аминокислоты добавляли 0.15 мл 0.1 М раствора карбоната натрия и 0.3 мл раствора фенилизоти-оционата (ФИТЦ), тщательно перемешивали и оставляли на 35 мин. Затем растворы выпаривали досуха в струе горячего воздуха и сухой остаток растворяли в 0.5 мл дистиллированной воды. Пробу центрифугировали (5000 об./мин).
Анализ ФТК-производных аминокислот проводили методом ВЭЖХ, используя микроколоночный жидкостной хроматограф Милих-ром А-02 (ЗАО «ЭкоНова»), хроматографи-ческую колонку 2.0 х 75 мм, заполненную сорбентом ProntoSil-120-5C18AQ зернением 5.0 мкм. Элюировали в градиентом режиме: концентрация подвижной фазы Б 30—100% (по объему). Подвижная фаза А: раствор уксуснокислого аммония с рН 5.25 (подкисление орто-фосфорной кислотой), подвижная фаза Б: 35% раствор ацетонитрила и уксуснокислого аммония с рН 6.50 (подкисление ортофосфорной кислотой) согласно методике 12.
Элементный анализ аминокислот проводился на приборе Vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия).
Спектры ЯМР *Н и 13С аминокислот записаны на спектрометре Varian 400, с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно. Аминокислоты растворяли в D2O + 60 мкл 50% ортофосфорной кислоты.
Результаты и их обсуждение
Синтез исходных аминокислот L-селеноцистина (схема 1) и новой — 3,3'-диметил^-селено-цистина (схема 2) проводили по методикам, разработанным ранее 10, 13. Их физико-химические характеристики приведены в табл. 1.
2
Таблица 1
Физико-химические характеристики 3,3'-диметил-£-селеноцистина и £-селеноцистина
Показатель 3,3'-Диметил-^-селеноцистин ^-селеноцистин Литературные данные для 1 14 ^-селеноцистина
С,% 25.97 (26.53)* 22.30 (21.58) 20.30-22.70** 21.19
Н,% 4.63 (4.45) 3.61 (3.59) 3.70
7.32 (7.74) 8.64 (8.38) 7.90-8.80** 8.37
Спектр 1Н-ЯМР (3 м. д.,) СН31.31. (3Н, д., и 8 Гц, СН), 3.583.64 (1Н м, СН (СН-\1Нэ+)), 4.06. (1Н, д, и 7.25 Гц) 3.18. (2Н дд, и 14 и 8 Гц, СН2), 3.32 (дд, и 14 и 5 Гц, СН- группы), 4.18 (1Н, д.д., и 8 и 5 Гц)
Спектр 13С-ЯМР 18.2 (СН3), 37.6 (СН), 57.7 (СН), 170.1 (СООН) 26.6 (СН2), 52.9 (СН), 170.5 (СООН)
*— в скобках приведены расчетные значения; ** — данные фирмы «Б1дта-ЛМпсН>>.
2Н2^СН"СООН
>Н2
+ Na2Se2
С1
С Н2
Se
Se
С Н2
Н2^СНСООН
Схема 1. Синтез Ь-селеноцистина 5.
+ Na2Se2
2Н2^С
|^СООН
Н^СНэ С1
о к, Н2^С^-СООН
-2 NaCl 2 Т
Н^СН3
Se
Н^СН3 Н2^СН~СООН 6
Схема 2. Синтез 3,3'-диметил-Ь-селеноцистина 6.
Метод
14
¿-метилселеноцистеина (схема 3). ¿-Селено-цистин (101.5 мг) растворяли в 10 мл 0.1 м Ма2С03 затем восстанавливали боргидридом натрия (12.5 мг) в инертной атмосфере (Аг) и перемешивали в течение 0.5 ч до образования селеноцистеина. При активном перемешивании в течение 1 ч, в три приема добавляли по 1 мл иодметана и перемешивали в течение еще 3 ч. Затем раствор подкисляли до рН 1.5 с помощью 6 М НС1 и трехкратно проводили экстракцию остатков иодметана гексаном. Полученный ¿-метилселеноцистеин очищали путем адсорбции на колонке с ионообменной смолой КУ-2-8 в Н+ форме, подкисляли и уже гидрохлорид метилселеноцистеина переосаждали метанолом.
Аналогично был проведен и синтез новой 2-амино-3-(метилселанил)бутановой кислоты (схема 4).
Анализ методом тонкослойной хроматографии показал наличие нингидрин-
положительного пятна ¿-метилселеноцистеина (Я,1 = 0.56) и 2-амино-3-(метилселанил)бута-новой кислоты (Я,1 = 0.57) (рис. 1). Исходный ¿-селеноцистин полностью вступил в реакцию и отсутствует на хроматограмме, как и 3,3'-диметил^-селеноцистин, который был добавлен в качестве вещества-стандарта (рис. 1б).
Дальнейшее исследование аминокислоты ¿-селеноцистина проводили методом БЭЖХ (рис. 2—5).
Ы2№С№ СООЫ[Н1/СНз1» Н2№С№СООЫ
СЫ2 ?е
СЫ2
Н2№СН-С00Н
СЫ2
Бе ¿Н3
был использован для синтеза
Схема 3. Синтез Ь-метилселеноцистеина 7.
г[ы]/СНз1
Н2№СЫС00Н 1 2 1
НССНз
2Н2№СНС00Н 2 1
НС-СНз
Бе
СНз 8
НС-СНз Н2№СЫС00Н 6
Схема 4. Синтез 2-амино-3-(метилселанил)бута-новой кислоты 8.
ФТК-производные исходных аминокислот: ¿-селеноцистина и 3,3'-диметил^-селеноцистина проявляются как пики с объемом удерживания 1455 и 1758 мкл.
ФТК-производные метилированных аминокислот: ¿-метилселеноцистеина и 2-амино-3-(метилселанил)бутановой кислоты проявляются как пики с объемом удерживания 174 и 175 мкл.
В спектре поглощения ¿-метилселеноцис-теина и 2-амино-3-(метилселанил)бутановой кислоты в остановленном потоке имеется максимум 225-230 нм (рис. 6, 7).
5
7
5
а б
Рис. 1. Проявление хроматограмм: а — с Ь-метилселеноцистеином; б — с 2-амино-3-(метилселанил)бута-новой кислотой и 3,3'-диметил-Ь-селеноцистином.
Рис. 2. Хроматограмма Ь-селеноцистина.
Рис. 3. Хроматограмма 3,3'-диметил-Ь-селеноцистина.
Рис. 4. Хроматограмма Ь-метилселеноцистеина.
Рис. 5. Хроматограмма 2-амино-3-(метилселанил)бутановой кислоты.
Рис.6. Спектр поглощения Ь-метилселеноцистеина в остановленном потоке.
Рис.7. Спектр поглощения 2-амино-3-(метилселанил)бутановой кислоты в остановленном потоке.
В целом, характер спектра поглощения ФТК-производных аминокислот имеет схожий характер, что говорит о близком строении синтезированных аминокислот.
Таким образом, на основе известной методики из L-селеноцистина был синтезирован L-
Литература
1. Fairweather-Tait S.J., Bao Y., Broadley M.R., Collings R., Ford D., Hesketh J.E., Hurst R. Selenium in Human Health and Disease // Antioxidants and Redox Signal.— 2011.— V.14.— Pp.1337-1383.
2. Alderton G.A. New Sulfur-containing Amino Acid from Subtilin 2. // J. Am. Chem. Soc.— 1953.- V.75.— Pp.2391-2392.
3. Gross E., Kiltz H.H., Nebelin E. Die Struktur des Subtilins // Hoppe Seylers Z Physiol Chem.— 1973.— V.354.— Pp.810-812.
4. Gross E. Morell J.L. Structure of nisin. // J. Am.Chem. Soc.— 1971.— V.93.— Pp.4634-4635.
5. Downey P. F., Black S. A new naturally occurring isomer of ß-methyllanthionine // J. Biol. Chem.— 1957.— №228.— Pp.171-179.
6. Wakamiya T., Fukase K., Shimbo K., Shiba T. An Improved Synthesis of threo-3-Methyl-D-cysteine. // Chem. Soc. Jap.— 1983.— V.56.— Pp.1559-1560.
7. Dong Y., Lisk D., Block E., Ip C. Characterization of the biological activity of y-glutamyl-Se-methylsele-nocysteine: a novel, naturally occurring anticancer agent from garlic// Cancer Res.— 2001.— V.61, №7.— Pp.2923-2928.
8. Kim T., Jung U., Cho D.Y., Chung A.S. Se-Methylselenocysteine induces apoptosis through caspase activation in HL-60 cells // Carcinogenesis.— 2001.— V.22.— Pp.559-565.
9. Weekley C.M., Aitken J.B., Finney L., Vogt S., Witting P.K., Harris H.H. Selenium Metabolism in Cancer Cells: The Combined Application of XAS and XFM Techniques to the Problem of Selenium Speciation in Biological Systems // Nutrients.— 2013.— V.5, №5.— Pp.1734-1756.
метилселеноцистеин и 2-амино-3-(метилселе-нил)бутановая кислота — новое метилированое производное 3,3'-диметил^-селеноцистина, новой селенсодержащей аминокислоты, являющейся структурным аналогом природных серосодержащих аминокислот.
References
1. Fairweather-Tait S.J., Bao Y., Broadley M.R., Collings R., Ford D., Hesketh J.E., Hurst R. [Selenium in Human Health and Disease]. Antioxidants and Redox Signal, 2011, vol. 14, pp.1337-1383.
2. Alderton G.A. [New Sulfur-containing Amino Acid from Subtilin 2]. J. Am. Chem. Soc., 1953, vol.75, pp.2391-2392.
3. Gross E., Kiltz H.H., Nebelin E. [Die Struktur des Subtilins]. Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 1973, vol.354, pp.810-812.
4. Gross E. Morell J.L. [Structure of nisin]. J. Am.Chem. Soc., 1971, vol.93, pp.4634-4635.
5. Downey P.F., Black S. [A new naturally occurring isomer of ß-methyllanthionine]. J. Biol. Chem., 1957, no.228, pp.171-179.
6. Wakamiya T., Fukase K., Shimbo K., Shiba T. [An Improved Synthesis of threo-3-Methyl-D-cysteine]. Chem. Soc. Jap., 1983, vol.56, pp.1559-1560.
7. Dong Y., Lisk D., Block E., Ip C. [Characterization of the biological activity of y-glutamyl-Se-methylsele-nocysteine: a novel, naturally occurring anticancer agent from garlic]. Cancer Res., 2001, vol.61, no.7, pp.2923-2928.
8. Kim T., Jung U., Cho D.Y., Chung A.S. [Se-Methylselenocysteine induces apoptosis through caspase activation in HL-60 cells]. Carcinogenesis, 2001, vol.22, pp.559-565.
9. Weekley C.M., Aitken J.B., Finney L., Vogt S., Witting P.K., Harris H.H. [Selenium Metabolism in Cancer Cells: The Combined Application of XAS and XFM Techniques to the Problem of Selenium Speciation in Biological Systems]. Nutrients, 2013, vol.5, no.5, pp.1734-1756.
10. Патент №2669771 РФ. 3,3-диселено-бис-2-ами-номасляная кислота и способ ее получения / Полубояринов П.А. // Б.И.— 2017.- №17.
11. Методика измерений массовой доли аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель» // ООО «Люмэкс-марке-тинг».- СПб., 2014.- 49 с.
12. Массовая концентрация основных аминокислот в водном растворе. МВИ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.- МВИ №02-2002.
13. Патент № 2537166 РФ. Способ получения биологически активного вещества - селеноцистина / Полубояринов П.А. // Б.И.- 2014.- №36.
14. Chocat P., Esaki N., Tanaka H., Soda K. Synthesis of l-selenodjenkolate and its degradation with methionine y-lyase // Anal. Biochem.- 1985.- V.148.- Pp.485-489.
15. Fan T.W., Laneb A.N., Martensc D., Higashid R.M. Synthesis and structure characterization of selenium metabolites // Analyst.- 1998.-V.123.- Pp.875-884.
10. Poluboyarinov P.A. 3,3-diseleno-bis-2-amino-maslyanaya kislota i sposob yeye polucheniya [3,3-disleno-bis-2-aminobutyric acid and method for its production]. Patent no.2669771 RF, 2017.
11. Metodika izmereniy massovoy doli aminokislot metodom kapillyarnogo elektroforeza s ispol'-zovaniyem sistemy kapillyarnogo elektroforeza «Kapel' ». OOO «Lyumeks-marketing» [Methods of measuring the mass fraction of amino acids by capillary electrophoresis using the Kapel capillary electrophoresis system. Lumex-marketing LLC]. St. Petersburg, 2014, 49 p.
12. Massovaya kontsentratsiya osnovnykh aminokislot v vodnom rastvore. MVI metodom vysokoeffektivnoy zhidkostnoy khromatografii [Mass concentration of basic amino acids in aqueous solution. MVI by high performance liquid chromatography]. MVI №02-2002.
13. Poluboyarinov P.A. Sposob polucheniya biolo-gicheski aktivnogo veshchestva — selenotsistina [The method of obtaining biologically active substances — selenocystine]. Patent № 2537166 RF, 2014.- №36.
14. Chocat P., Esaki N., Tanaka H., Soda K. [Synthesis of l-selenodjenkolate and its degradation with methionine y-lyase]. Anal. Biochem., 1985, vol.148, pp.485-489.
15. Fan T.W., Laneb A.N., Martensc D., Higashid R.M. [Synthesis and structure characterization of selenium metabolites]. Analyst, 1998, vol.123, pp.875-884.
