CC BY
16УДК 547.854.7:455
О. В. Непорожнева1, А. А. Головина2, Е.П. Студенцов3
АН6-Пуринил)-аминокислоты и их модифицированные нуклеозиды представляют интерес как потенциальные биологически активные вещества с широким спектром действия (противовирусные, противоопухолевые, сердечнососудистые препараты). АН6-пуринил)-1-глутаминовая кислота проявляет высокую противоопухолевую активность на карциноме 755 [1]. Особого внимания заслуживают производные аденина и аденозина, как специфические регуляторы белково-нуклеинового обмена. Некоторые из них в структурном отношении являются аналогами известных цитокининов. Аденил-9-а-аланин - эффективный активатор фермента аденилатцикла-зы, отвечающей за синтез ц-АМФ, играющие важную роль в дифференцировке клеток [2]. При этом принималось также во внимание, что производные аденина и аденозина способны в качестве лигандов взаимодействовать с аденозиновыми рецепторами мембран в разных тканях, что используется для лечения различных неврологических и психических заболеваний [3] Нуклеоаминокислоты можно рассматривать как ««двойные молекулы», объединяющие две фармакофорные группы, и поэтому они могут проявлять отличные от аминокислот и пуриновых нуклеиновых оснований фармакологические свойства.
Данная работа заключалась в расширении серии N (6-пуринил)-аминокислот и их нуклеозидов и приготовлении их в количествах, достаточных для биологических испытаний.
Известным методом получения А^-(б-пуринил)-аминокислот является взаимодействие 6-метилтиопуринов с аминокислотами [4]. Этот способ предусматривает получение исходного 6-метилтиопурина путем тионирования гипоксанти-на пентасульфидом фосфора в пиридине с последующим метилированием, при этом общий выход 6-метилтиопурина составляет менее 60 %. Следует также учесть, что конденсация его с аминокислотами проводится в относительно жестких условиях, при нагревании выше 100 °С, под давлением с выделением меркаптана и при этом возможна химическая трансформация пуриниламинокислот. Более удобным в прак-
СИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Л(б-ПУРИНИЛ)-АМИНОКИСЛОТ И ИХ Л-РИБОЗИДОВ И ДИПЕПТИДНЫХ АНАЛОГОВ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26
Методами ЯМР-Н, ИК-спектроскопии, хроматографии исследован состав и строение продуктов взаимодействия 6-хлорпурина и его рибозида с оптически чистыми формами I- и й -а-аминокислот, а также их дипептидами при нагревании в карбонатном буфере. Изучены химические свойства №(6-пуринил)-аминокислот и их N-рибозидов в реакциях этерификации и амидирования соответствующих эфиров. Установлена актопротекторная активность у некоторых синтезированных соединений.
Ключевые слова: 6-хлорпурин, №-(6-пуринил)-аминокислоты, нуклеозиды, адаптогены, ИК-, УФ-, ЯМР-'Н-спектры.
тическом отношении является использование в реакции ами-нолиза высокореакционноспособного 6-хлорпурина (3), который получается непосредственно из гипоксантина (2), доступного кислотным гидролизом или ацетолизом инозина (1) с одновременным получением й-рибозы или 1,2,3,5-3-тетраацетилрибофуранозы, широко применяемых в синтезе биологически активных нуклеозидов (схема 1).
Улучшен технологический процесс получения ключевого продукта синтеза 6-замещенных пуринов - 6-хлорпурина (3), заключающийся в установлении оптимального соотношения гипоксантина, хлорокиси фосфора и диалкила-нилина, продолжительности реакции с новым приемом выделения 6-хлорпурина в виде гидрохлорида путем обработки реакционной массы, растворенной в хлористом метилене, спиртом, а также регенерацией диалкиланилина из метилен-хлоридного раствора. Удалось предотвратить возникновение побочных продуктов, которые возникают при взаимодействии (3) с диметиланилином с образованием б-(А'-метиланилино)-пурина. Такое оформление процесса позволило совместить стадии синтеза (3) и аденина, ибо сырец гидрохлорида 6-хлорпурина мог быть без очистки подвергнут аммонолизу в среде формамида при пропускании аммиака в открытой системе (1.5-2 часа) с выходом чистого аденина 75-80 % [5].
В литературе описано взаимодействие 6-хлорпурина с некоторыми а-аминокислотами, при этом, как правило, использовались более доступные I, й-рацематы [1]. Пуринил-аминокислоты в отдельных случаях разделялись ферментативным гидролизом на оптически активные йи 1-изомеры, так как биологическая активность производных аминокислот существенно зависит от их стереохимической структуры. Например, левовращающая форма препарата сарколизина (производное фенилаланина) активна при лечении некоторых видов злокачественных опухолей, а правовращающая - неактивна, благодаря аминокислотной природе. 1-сарколизин проникает через мембраны клеток с помощью систем активного транс-
1 Непорожнева Ольга Владимировна, мл. науч. сотр., каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: [email protected]
2 Головина Анна Александровна инженер, каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ е-mail: [email protected]
3 Студенцов Евгений Павлович, канд. хим. наук, вед. науч. сотр., каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ е-mail: [email protected]
Дата поступления - 18 июня 2013 года
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
схема 2
R = Н; R' = СН2СООН R = Н; R' = CHgCHCOOH R = Н; R" = СН2СН2СООН
R = Н; R" = (СН3)2СНСООН [
R = Н; R" = L-R = Н; R' = D-
R = Н; R
R = Н; R" = DR = Н; R" = L-R = Н; R" = D.L-
•= СХ/
сн2снсоон
15
16
17
18
19
20
21 22
23
N
4-24
R = Н; R' =
ОН
R = Н; R' = НООС-СН
R = Н; R = Н;
24 R = Н: R' =
схема 3
порта Ьаминокислот, а й-сарколизин - нет. Вместе с тем й-аминокислоты и оптически неактивные аминокислоты играют важную роль в качестве промежуточных соединений при метаболических превращениях. Например, р-аланин служит предшественником одного из витаминов пантотеновой кислоты, цитруллин - промежуточный продукт синтеза аргинина, а у-аминомасляная кислота участвует в передаче нервных импульсов.
Конденсация 6-хлорпурина (3 с оптически чистыми формами Ь и й -а-аминокислот, а также их дипептидами проводили в мягких условиях во избежание возможной рацемизации. С учетом высокой подвижности атома хлора в положении 6 пурина реакции осуществлялись в карбонатном буфере при рН 8-9, когда аминокислота находится в форме соли со сво-
бодной аминогруппой при стехио-метрических соотношениях реагентов, а выделение продуктов осуществлялось подкислением реакционной массы муравьиной кислотой до рН 3-4. Использовалось также введение в реакцию натриевых солей аминокислот с (3 при поддерживании уровня рН 8-9 добавлением эквимольного раствора щелочи. В качестве модельной реакции первоначально исследовалось взаимодействие 6-хлорпурина с глицином, когда посредством хроматографического анализа были установлены оптимальные условия: температура 8090 °С, продолжительность реакции 3 ч. При этом продукт кристаллизовался при охлаждении из реакционной массы в виде натриевой соли 1\1-(6-пуринил)-глицина (4) (с выходом 83 %) или при подкисле-нии муравьиной кислотой продукт (4 выделялся в виде кислоты. Соединение (4) оказалось идентичным продукту спонтанной перегруппировки Л^-глициладенина в Л-(6-пуринил)-глицин [6] (схема 2). Наблюдалось полное совпадение значений УФ-спектров: максимумы поглощения 0.1н HCl - 273 нм, 0.1н NaOH - 274 нм, и идентичность значений ИК-спектров (KBr, см-1): 3370 (NH), 3150-3100 (OH acid), 1640 (С = О).
ЛЧлициладенин в водном растворе в течение нескольких часов при комнатной температуре или нескольких минут при 100 °С теряет аммиак и образуется кристаллический циклический интер-медиат - 3Н-7,8-дигидро-8-оксоимидазо-[2,1Ч]пурин. В кислой среде происходит раскрытие три-циклического кольца с образованием Л-(6-пуринил)-глицина (4).
С целью расширения круга потенциальных биологически активных веществ в реакцию с 6-хлорпурином вводились новые аминокислоты и дипептиды, в условиях, отработанных для получения (4). С помощью хроматографического анализа была установлена продолжительность реакции, когда наблюдалась полная конверсия (3): она составляла от 3 до 13 часов, то есть наблюдались различия в реакционной способности у различных аминокислот. Продукты (4, 4а, 6, 9, 11, 12, 16-18, 20, 2224) получались с удовлетворительными выходами от 51 % до 99 %, при этом все соединения кристаллизовались после под-кисления муравьиной кислотой непосредственно из реакционной массы, дополнительно пререкристаллизовывались из воды или водного спирта (схема 3).
В случае конденсации с D-валином и аргинином реакция проходила медленно, в основном выделяли непрореа-гировавший (3) после продолжительного нагрева, выход (7) составил 23 %.
Н
нх-с-сн-соон
3 I
■он
NH
//
R = Н; R' = HOOCCH(CH2)3NHC R = Н; R' = СН3СН2СНСООН R = Н; R' = СН2СН2СН2СООН R = Н; R' = CH2C(0)NHCH2C00H R = Н; R' = CH2CH2C(0)NHCH2C00H
н
NH
w соон о
Л/-(6-пуринил)-р-аминомасляная кислота (21) хорошо растворима в воде, поэтому после подкисления реакционной массы не наблюдалось выпадение осадка. После полной отгонки воды на роторном испарителе, добавления абсолютного спирта и отделении солей выделяли 10 % (21). Аналогичным образом выделяли с выходом 27 % Л^-(б-пуринил)-треонин (15).
Для выделения ^-(б-пуринил)-й-аспарагиновой кислоты (17) после конденсации (3 с й-аспарагиновой кислотой реакционную массу нейтрализовали смолой КУ-2 и после длительного охлаждения водного раствора выделяли в чистом виде (17) с выходом 53 %.
Все полученные аминокислотные производные пурина являются стабильными веществами, и лишь при кипячении в соляной кислоте отщепляют аминокислотный остаток, в щелочном растворе они более устойчивы. Синтезированные Л^-(6-пуринил)-а-аминокислоты (4-24) представляют собой бесцветные или слегка желтоватые кристаллы с относительно высокой температурой плавления, проявляющие амфотерные свойства; они дают положительную реакцию с нингидрином на а-аминогруппу, но не как обычно лилового, а оранжевого цвета.
Изучение химических свойств Л^-(б-пуринил)-аминокислот на примере получения эфиров (25-27) и амида
^-(б-пуринил)-глицина (28) и ^-(б-пуринил)-аланина показало, что они легко этерифицируются в метаноле в присутствии тионилхлорида (кислого диметилсульфита) при комнатной температуре в течение 24 часов. Соединение (27) получено конденсацией (3) с метиловым эфиром й-аланина. В свою очередь, метиловый эфир ^-(б-пуринил)-глицина (25) может быть превращен в амид (28) действием насыщенного раствора аммиака в метаноле.
Особый интерес представляет синтез Л/-(6-(9-р-й-рибофуранозил)-пуринил)-аминокислот и дипептидов. Нами был впервые получен ряд ^-(6-(9-р-й-рибофуранозил)-пуринил)-аминокислот и дипептидов (32-37).
В качестве исходного вещества использовался 6-хлор-9-рибофуранозилпурина (31), который может быть получен взаимодействием 2',3',5'-три-О-ацетилинозина (29) с хло-рокисью фосфора в присутствии диметиланилина, но при этом происходит побочная реакция деацетилирования и расщепления гликозидной связи с частичным осмолением реакционной массы, что требует хроматографической очистки 2',3',5'-три-О-ацетил-6-хлор-9-рибофуранозилпурина (30). При дальнейшем снятии ацетильной в (30) защиты метилатом натрия наблюдается образование побочного 6-метокси-пуринрибозида, что значительно снижает выход целевого (31) [7].
Таблица 1. Характеристики полученных производных N-6-пуринил)- и N-(>6-(9ф-й-рибофуранозил)-пуринил)-аминокислот
Соединение, (№) Брутто формула (М.м., г/моль) Время реакции, час. Выход, % Т пл, °С Rf (система Хл:Ме)
6-хлорпурин (3) СзНз^С! (154) - 81 178 0.43 (2 1)
Л-(6-пуринил)-глицин, (4) C7H7N5O2(193) 3 54.0 >300 (разл) 0.45 (9 1)
Л-(6-пуринил)- глицин натриевая соль, (4а) C7H6N5Ü2Na (253) 3 83.0 >300 (разл) 0.35 (6 1)
Л-(6-пуринил)-а-аланин, (5) QH9N5O2 (207) 3.5 33.0 221-225 0.15 (9 1)
Л-(6-пуринил)-р-аланин, (6) QH9N5O2 (207) 9 95.0 234-236 0.75 (5 1)
Л-(6-пуринил)-й-валин, (7) C10H13N5O2 (235) 4 23.0 172-175 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-лейцин, (8) C10H15N5O2 (249) 3 40.0 239 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-Ьфенилаланин, (9) C14H13N5O2 (283) 4 51.0 205-210 (разл) 0.66 (9 1)
Л-(6-пуринил)-й-фенилаланин, (10 C14H13N5O2 (283) 3 37.0 212-213 (разл) 0.04 (2 1)
Л-(6-пуринил)-триптофан, (11) C16H14N6O2 (322.3) 3 57.0 225-230 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-й-серин, (12) C8H9N5O3(223) 3 62.3 209-212 (разл) 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-треонин, (15) C9H11N5O3 (237) 4 27.0 215-219 0.45 (6 1)
Л-(6-пуринил)-й-тирозин, (16) C14H13N5O3 (299.3) 5 89.0 265-267 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-0-аспарагиновая кислота, (17) C9H9N5O4(251) 3 53.0 145-150 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)- Ьметионин, (18) C9H11N5O2S (253) 13 99.0 214-216 (разл) 0.19 (2 1)
Л-(6-пуринил)-аргинин, (19) C11H16N8O2 (292.3) 4 23.0 150-155 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-а-аминомасляная кислота, (20) C9H11N5O2 (223) 4 57.5 225-227 0.35 (6 1)
Л-(6-пуринил)-р-аминомасляная кислота, (21) C9H11N5O2 (223) 3.5 10.0 225-227 0.15 (3 1)
Л-(6-пуринил)-глицил-глицин, (22) C9H10N6O3 (250) 9 70.0 >280 0.15 (6 1)
Л-(6-пуринил)-р-аланилглицин, (23) C10H12N6O3 (264) 11 66.0 248-250 0.11 (3 1)
Л-(6-пуринил)-глицил-р-0-фенилаланин, (24) Q6Hi6N6O3 (340) 4 99.0 260-263 0.05 (3 1)
Метиловый эфир Л-(6-пуринил)-глицина, (25) C8H9N5O2(207) - 49 235-237 (разл) 0.45 (3 1)
Метиловый эфир Л-(6-пуринил)-р-аланина, (26) C9HnN5O2 (221) - 39 205-207 0.91 (2 1)
Метиловый эфир ЛА(6-пуринил)-Э-аланина, (27) C9HnN5O2 (221) - 30 195-198 0.53 (6 1)
Амид Л-(6-пуринил)-глицина, (28) C6H8N6O (192) - 67.4 253-255 (разл) 0.1 (3:1)
2',3',5'-три-О-ацетилинозин, (29) Cl6Нl8N4O8 (394) - 75 222-225 0.27 (9:1)
6-хлор-(9-3-Э-рибофуранозил)-пурин, (31) ^1^80 (350.5) - 55 168-170 0.38 (8:1)
Л-(6-(9-р-0-рибофуранозил)-пуринил)-глицин, (32) C11H15N5O6 (313) 2.5 52.0 95-97 0.19 (2:1)
ЛА(6-(9-р-0-рибофуранозил)-пуринил)-3-аланин, (33) C12H17N5O6 (327) 10 78.5 182-184 (разл) 0.19 (6:1)
ЛА(6-(9-р-0-рибофуранозил)-пуринил)-0-фенилаланин, (34) C18H21N5O6 (403) 3.5 31.0 96-98 0.12 (3:1)
ЛА(6-(9-р-0-рибофуранозил)-пуринил)-0-серин, (35) C12H17N5O7 (343) 4 79.6 118-120 (разл.) 0.05 (6:1)
ЛА(6-(9-р-Р-рибофуранозил)-пуринил)-глицилглицин, (36) C13N18N6O7 (370) 7 87.3 161-163 (разл.) 0.13 (3:1)
ЛА(6-(9-р-0-рибофуранозил)-пуринил)-3-аланилглицин, (37) C14H20N6O7 (384) 11 79.8 99-101 0.05 (6:1)
Более удобным и эффективным методом синтеза (31) является приготовление (29) обработкой инозина уксусным ангидридом при нагревании (150 °С, 10 минут) в присутствии ацетата натрия (вместо пиридина) с выходом 90 % и совмещение процессов взаимодействия (29) с тионилхлори-дом в присутствии диметилформамида (in situ образуется ди-метилхлорметиленаммоний хлорид), и последующего снятия ацетильной защиты 15 % раствором аммиака в метаноле при 0 °С (в течение 12 часов). Выход хроматографически чистого (31) составил 55 % (по 1) после отделения небольших примесей аденозина перекристаллизацией из спирта (схема 4).
По аналогии с синтезом модельного соединения (4) мы исследовали взаимодействие нуклеозида (31) с глицином, а-аланином, D-серином, D-фенилаланином, глицил-глицином и в-аланил-глицином (схема 5).
По данным хроматографии продолжительность реакций (31) с аминокислотами и дипептидами сопоставима со скоростью взаимодействия 6-хлорпурина с соответствующими аминокислотами. Выделение хроматографически чистых N-(6-(9-р^-рибофуранозил)-пуринил)-аминокислот в кристаллическом виде из реакционной массы проходило после продолжительного охлаждения, за исключением продуктов (32) и (34), которые представляли собой густые масла. Их удалось выделить в аморфном виде после переосаждения из абсолютных спиртов эфиром с последующей выдержкой в вакууме до состояния однородной «твердой пены».
Строение синтезированных N-^-пуринил)-ам инокислот и их рибозидов доказано на основе данных ЯМР-Н1, УФ- и ИК- спектроскопии, характеристики некоторых из них представлены в таблице 2.
В спектрах ЯМР-1Н соединений (3-16, 18, 20, 2224, 31-37) присутствуют характерные пики протонов С2 и Св около В. 14 и 8.03 м.д. соответственно. Интегральная интенсивность сигналов аминокислотного фрагмента соответствует числу протонов, а химические сдвиги отвечают их строению. Основным отличием спектров ЯМР-1Н N9-рибофуранозилпуринов (32-37) от соответствующих аглико-нов является наличие сигналов в области 3.17-5.42 м.д., относящихся к протонам рибозного фрагмента, а также химического сдвига аномерного протона - 5.85-5.90 м.д. с КССВ 1-2 Гц, что соответсвует ß-конфигурации гликозидной связи.
В ИК спектрах ^-(б-пуринил)-аминокислот (4, 6, 9, 10, 12-14, 18, 22-24) в KBr наблюдаются характеристичные полосы поглощения NH-, OH- и СН-групп в высокочастотной области около 3440-3010 и 2900-2810 см-1, соответственно. В области валентных колебаний присутствуют интенсивные полосы при 1670-1630 и 1590-1520, которые относятся к поглощению карбонильных групп аминокислотных остатков и двойных связей С = С и C = N пуринового кольца (таблица 2). ИК спектры рибонуклеозидов (31-37) содержат полосы в области 1120-1170 см-1, которые могут быть отнесены к валентным колебаниям рибозного фрагмента С1'- O - C4.
В УФ спектрах растворов соединений (4, 6, 9, 10, 12-14, 18, 22-24) наблюдаются интенсивные максимумы поглощения в 0.1н NaOH и 0.1н HCl в области 274-276 нм, обусловленные п^п* переходом в пуриновом цикле и наличием ауксохромной группы - аминокислотного фрагмента, лишь в спектре серосодержащего (18) наблюдается батохромный сдвиг максимума поглощения на 5 нм. В УФ спектрах растворов рибонуклеозидов (31-37) наблюдаются характеристические максимумы поглощения как в 0.1н NaOH, так и в 0.1н HCl
Таблица 2. Спектральные характеристики производных '6-пуринил)- и Ы-(6-(9-(3-0-рибофуранозил)-пуринил)-аминокислот.
о Ш _ ИК спектры (КВг), см-1 ЯМР-1Н (ДМСОd6), б, м.д. УФ-спектры, Амакс, нм (!де)
и | * ^ ¡11 ^ ш V (N4, ОН, СН) V (С=О, С=С, C=N) V (другие полосы поглощения) 0.1н NaOH 0.1н HCl
3 3430(ср), 3101(ср), 3056(ср), 3005(ср), 2956(ср), 2930(ср), 2807(ср), 2699(ср), 2541(ср) 1604(с), 1566(с) 1492 (ср), 1444 (с), 1433 (ср), 1390 (с), 1325 (с), 1285 (с), 1234 (с), 1144 (ср), 1115 (ср), 988 (ср), 937 (ср), 919 (ср), 857(ср), 793(ср), 635(ср), 604(ср), 592(ср) 8,73 (1Н, С8-Н), 8,81 (1Н, С2-Н) 275 (3.95) 265 (3.98)
4 3371(с), 3147 (с), 3127(с), 3083 (с), 1991(с), 2956(с), 2913(ср), 2840(ср) 1639(с), 1539(с) 1483 (с), 1443 (с), 1421 (с), 1384(с), 1335(с), 1302(с), 1279(с), 1196(ср), 1161(ср), 1138(ср), 999(сл), 940(ср), 911(ср), 899(ср), 838(ср), 793(ср), 778(ср), 741(ср), 695(с), 678(ср), 652(ср), 645(ср), 623(ср), 592(ср), 563(ср), 544(сл) 4.14 (2Н, уш.с., СН2), 7.72 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.08 (1Н, с, С8Н), 8.18 (1Н, с, С2Н), 12.81 (1Н, уш.с., NHэндо) 274 (3.89) 274 (4.33)
6 3420(ср), 3278(ср), 3219(ср), 3122(ср), 3071(ср), 2974(ср), 2922(ср), 2817(ср) 1707(ср), 1629(с), 1522(сл) 1467(ср), 1460(ср), 1383(ср), 1325(ср), 305(ср), 1252(ср), 1338(ср), 1171(сл), 1153(сл), 1137(сл), 1034(сл), 961(сл), 306(сл), 793(сл), 675(сл), 665(сл), 537(сл) 2.59 (2Н, уш.с., СН2NH), 3.71 (2Н, уш.с., СН2СООН), 7.47 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.04 (1Н, с, С8Н), 8.17 (1Н, с, С2Н), 12.85 (1Н, уш.с., NHэндо) 274 (4.19) 274 (4.17)
9, 10 3432(сл), 3177(ср), 3064(ср), 3026(ср), 2938(ср) 1679(с), 1619(с), 1597(с), 1546(ср) 1469(сл), 1407(ср), 1351(ср), 1324(ср), 1231(ср), 1129(сл), 1085(сл), 932(ср), 879(ср), 862(сл), 694(ср), 678(сл), 645(сл) 3.25 (4Н, м., СН2+Н2О), 4.79 (1Н, уш.с., СН), 7.157.3 (5Н, м, РИ), 7.47 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.07 (1Н, с, С8Н), 8.16 (1Н, с, С2Н), 12.9 (1Н, уш.с., NHэндо) 276 276
12, 13, 14 3420(ср), 3191(ср), 3100(ср), 3067(ср), 2955(ср) 1677(с), 1620(с), 1596(с), 1546(с) 1501(сл), 1413(с), 1337(ср), 1256(ср), 1130(ср), 1104(сл), 1070(ср), 941(сл), 885(ср), 769(сл), 693(ср), 645(ср), 562(ср) 3.93 (2Н, м., СН2), 4.76 (1Н, уш.с., СН), 7.24 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.13 (1Н, с, С8Н), 8.19 (1Н, с, С2Н), 12.84 (1Н, уш.с., NHэндо) 275 275
18 3447(ср), 3184(ср), 3066(ср), 2925(ср) 1676(с) 1620(с), 1546(с) 1413(с), 1345(с), 1319(ср), 1272(ср), 1336(ср), 1191(ср), 1129(ср), 1089(сл), 1015(сл), 931(ср), 888(ср), 846(ср), 782(сл), 691(ср), 644(ср), 622(сл), 561(сл), 458(сл), 418(сл) 2.08 (3Н, м, СН3), 3.05-3.07 (2Н, д., СН2), 4.91 (1Н, уш.с., NHэкзо) 7.48 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.06 (1Н, с, С8Н), 8.15 (1Н, с, С2Н), 12.80 (1Н, уш.с., NHэндо) 274 (3,92) 280 (4,26)
22 3395(с), 3338(с), 3285(с), 3229(с), 3198(с), 3113(с), 2944(ср), 2919(ср), 2887(ср) 1725(ср), 1638(с), 1551(с) 1493(ср), 1412(с), 1333(с), 1310(с), 1264(с), 1224(с), 1164(ср), 1138(с), 1096(с), 1031(с), 985(ср), 894(ср), 867(ср), 819(ср), 791 (ср), 770(ср), 749(сл), 724(ср), 708(ср), 672(ср), 665(ср), 639(с), 627(ср), 558(сл) 3.77, 3.79 (2Н, д, СН2СООН), 4.15 (2Н, уш.с., СН2NH), 7.68 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.14 (1Н, с, С8Н), 8.20 (1Н, с, С2Н), 12.81 (1Н, уш.с., NHэндо) 272 (4,21) 276 (4,44)
23 3427(ср), 3283(ср), 2924(сл) 1640(с), 1566(ср) 1431(ср), 1389(ср),1347(ср), 1333(ср), 1217(ср), 1166(ср), 1144(ср), 1049(ср), 951 (сл), 880(сл), 787(сл), 714(ср), 612(ср), 603(сл) 2.51 (2Н, д, СН2СООН), 3.74 (2Н, уш.с., СН2NH), 7.26 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.03 (1Н, с, С8Н), 8.13 (1Н, с, С2Н), 12.92 (1Н, уш.с., NHэндо) 275 274
24 3459(с), 3299(с), 3112(с), 3063 (с), 3031(с), 2926(с) 1648(с), 1546(с) 1500(с), 1402(с), 1332(с), 1269(с), 1239(с), 1178(с), 1114(ср), 1079(ср), 1041(ср), 952(с), 790(с), 749(с), 702(с), 664(с), 614(с), 568(ср), 488(сл) 2.89-3.05 (2Н, д, СН2СООН), 4.05-4.1 (2Н, уш.с., СН2NH),), 4.44-4.49 (1Н, м., СН), 7.11-7.23 (5Н, м, РИ), 8.0 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.03 (1Н, с, С8Н), 8.14 (1Н, с, С2Н), 12.91 (1Н, уш.с., NHэндо) 274 275
31 3448(с), 3260(ср), 3104(ср), 3082(ср), 2975(сл), 2958(сл), 2915(сл), 2864(сл) 1597(с), 1562(с) 1494(сл), 1449(ср), 1414(ср), 1384(ср), 1342(ср), 1321(сл), 1252(сл), 1211(ср), 1199(ср), 1143(ср), 1120(ср), 1090(с), 1046(с), 1036(ср), 986(ср), 935(ср), 877(сл), 857(сл), 819(ср), 742(сл), 715(сл), 677(сл), 656(сл), 630(ср), 599(сл), 537(сл) 3.67-5.27 (м, рибоза), 6.08 (1Н, д, С1'Н), 8.86 (1Н, с, С8Н), 9.0 (1Н, с, С2Н) 265 266
32 3635(с), 3392(с), 3001(с), 2930(с) 1620(с), 1478(с), 1401 (с), 1389(с), 1330(с), 1306(с), 1227(с), 1183(ср), 1160(ср), 1122(с), 1082(с), 1054(с), 985(с), 928(ср), 893(с), 865(с), 847(ср), 824(ср), 793(с), 746(с), 694(с), 687(с), 672(с), 553(с), 535(с), 512(с), 505(с), 494(ср), 480(ср) 3.54-4.57 (13Н, м, СН2, рибоза), 5.85-5.87 (1Н, д, С1'Н), 7.11 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.14 (1Н, с, С8Н), 8.27 (1Н, с, С2Н) 266 265
33 3297(с), 3151(с), 2926(с) 1629(с), 1587(с), 1542(с) 1389(с), 1333(с), 1310(с), 1247(с), 1220(с), 1185(с), 1129(с), 1094(с), 1058(с), 985(с), 946(ср), 862(с), 823(с), 792(с), 762(с), 709(с), 672(с), 629(с), 467(ср) 2.59, 2.61 (2Н, уш.с., NHCH2CH2COOH), 3.28-5.46 (9Н, м, рибоза), 5.87-5.89 (1Н, д, С1'Н), 7.75 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.21 (1Н, с, С8Н), 8.37 (1Н, с, С2Н), 12.18 (1Н, уш.с., СООН) 267 (4,28) 266 (4,33)
34 3396(с), 2932(ср) 1710(ср), 1619(с) 1483(ср), 1407(ср), 1333(ср), 1297(ср), 1224(с), 1120(ср), 1081(с), 1051(ср), 984(сл), 866(сл), 795(сл), 741(сл), 701(ср), 681(сл), 645(сл), 635(сл) 1.04-1.08 (2Н, д, С^), 3.25-4.9 (9Н, м, рибоза), 5.85-5.86 (1Н, д, С1'Н), 7.1-7.26 (5Н, м, РИ), 7.58 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.15 (1Н, с, С8Н), 8.28 (1Н, с, С2Н) 270 (4,41) 267 (4,32)
35 3397(ср), 3101(ср), 2924(ср) 1611(с) 1471(ср), 1413(ср), 1330(ср), 1302(ср), 1230(сл), 1126(ср), 1057(ср), 1015(ср), 918(сл), 897(сл), 862(сл), 792(сл), 611(сл), 532(сл), 414(сл) 3.17-4.57 (10Н, м, СН2, Рибоза), 5.45 (1Н, уш.с., ОН), 5.85-5.87 (1Н, д, С1'Н), 7.16 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.17 (1Н, с, С8Н), 8.30 (1Н, с, С2Н) 266 266
36 3253(с), 3288(с), 3117(с), 2967(сл) 1657(с), 1562(с) 1406(с), 1330(с), 1243(с), 1167(с), 1035(с), 987(ср), 952(ср), 928(ср), 793(ср), 742(ср), 689(ср), 660(с), 614(с), 567(ср), 538(ср) 3.98, 4.16 (2Н, д, С^), 3.28-3.77, 4.6-5.42 (9Н, м, рибоза), 5.89-5.9 (1Н, д, С1'Н), 7.87 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.14 (1Н, с, С8Н), 8.21 (1Н, с, С2Н) 265 (4,27) 265 (4,21)
37 3299(с), 3152(с), 2940(с) 1629(с), 1587(с) 1413(с), 1389(с), 1333(с), 1310(с), 1221(с), 1185(с), 1159(с), 1129(с), 1095(с), 1058(с), 1037(с), 985(с), 946(ср), 862(с), 823(с), 792(с), 761(с), 705(с), 673(с), 633(с), 558(с) 3.02-4.56 (9Н, м, рибоза), 5.36 (2Н, д, С^), 5.865.88 (1Н, д, С1'Н), 7.69 (1Н, уш.с., NHэкзо), 7.95 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.17 (1Н, с, С8Н), 8.26 (1Н, с, С2Н) 266 (4,16) 266 (4,20)
ЯМ Р-Н (ДМСОсС)), ' б, мд
4а 3.7 (2Н, уш.с., СН2), 7.28 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.02 (1Н, с, С8Н), 8.15 (1Н, с, С2Н)
5 1.49-1.50 (3Н, м, СН3), 4.65 (1Н, уш.с., СН), 7.54 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.08 (1Н, с, С8Н), 8.17 (1Н, с, С2Н), 12.9 (1Н, уш.с., NHэндо)
7 0.96-1.03 (6Н, м, 2СН3), 1.91 (1Н, с, СНСООН), 2.20 (1Н, с, СН(СН3Ъ), 7.24 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.02 (1Н, с, С8Н), 8.7 (1Н, с, С2Н)
8 0.90-0.94 (6Н, м, 2СН3), 1.66 (1Н, с, СНСООН), 1.81 (1Н, с, СН(СН3^), 4.73 (2Н, с., СН2), 7.59 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.1 (1Н, с, С8Н), 8.17 (1Н, с, С2Н), 12.91 (1Н, уш.с., NHэндо)
11 5.04 (1Н, уш.с., СН), 6.95-7.34 (6Н, м, РИ^^, 7.57-7.58 (1Н, д., NHэкзо), 8.07 (1Н, с, С8Н), 8.20 (1Н, с, С2Н), 10.78 (1Н, уш.с., NHиндол), 12.83 (1Н, уш.с., NHэндо)
15 1.06 (3Н, м, СН3), 3.12 (1Н, с, ОН), 3.96-4.06 (м, 2СН), 7.25 (1Н, уш.с, NHэкзо), 8.08 (1Н, с, С8Н), 8.15 (1Н, с, С2Н)
16 3.05-3.2 (4Н, м., СН2+Н2О), 4.72 (1Н, уш.с., СН), 6.56-7.17 (5Н, м, РИ), 8.02 (1Н, с, С8Н), 8.15 (1Н, с, С2Н), 8.3 (1Н, уш.с., NHэкзо), , 12.93 (1Н, уш.с., NHэндо)
20 0.98 (3Н, м, СН3), 1.95 (2Н, м, СН2), 4.61 (1Н, с., СН), 7.46 (1Н, уш.с., NHэкзо), 8.11 (1Н, с, С8Н), 8.18 (1Н, с, С2Н), 12.87 (1Н, уш.с., NHэндо)
при 265-267 нм, то есть наличие рибозного фрагмента не вызывает батохромный сдвиг в спектрах полученных соединений по сравнению с их нерибозидными аналогами.
Выходы, температуры плавления, значения Яг (424, 32-37) приведены в таблице 1, спектральные характеристики некоторых синтезированных соединений приведены в таблице 2.
Биологические испытания синтезированных N-(6-пуринил)-аминокислот и их рибозидов, проведенные в ФГУП
«НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, показали, что эти соединения малотоксичны и обладают адаптогенной активностью. Наиболее выраженным акто-протекторным действием в эксперименте обладают: N-(6-пуринил)-глицил-р-й-фенилаланин, ^(6-(9-р-й-
рибофуранозил)-пуринил)-глицилглицин, ^(6-пуринил)-Ь серин, его рацемат и й-стереоаналог; последний проходит расширенные предклинические испытания.
Экспериментальная часть:
Спектры ЯМР в сухом диметилсульфоксиде DMSOds записаны на спектрометре Bruker WM с рабочей частотой 400 МГц. В качестве внутреннего стандарта использован сателлит 13С-Н диметилсульфоксид. Электронные спектры растворов соединений сняты на приборе «UV-1800» в кварцевых кюветах (толщина слоя 1 см., концентрация веществ в растворе 10-4-10-5 моль/л). ИК-спектры веществ сняты в дисках KBr на приборе «Shimadzu FTIR-8400 S». Индивидуальность синтезированных соединений доказана методом тонкослойной хроматографии на пластинках Merck Kieselgel 60 F254. Температура плавления определена на приборе ПТП (г. Клин). Очистка растворителей проводилась в соответствии с прописями указанными в [8].
Гипоксантин (2).К 200 г (0.74 моль) чистого инозина (1) приливали 560 мл 0.1 н серной кислоты и смесь кипятили при 110 °С при сильном перемешивании в течение 4 ч. Контроль ТСХ. Вначале наблюдается полное растворение инозина, и через 30 минут происходит кристаллизация (2) в виде бесцветного осадка. Реакционную массу охлаждали до 0-2 °С, выдерживали в течение 5 ч и в холодном состоянии отфильтровывали осадок (2), который промывали ледяной водой (2х90 мл). Хорошо отжатый осадок (2) высушивали при 100-110 °С в сушильном шкафу до постоянного веса. Получают 97 г (97 %) (2) в виде бесцветных кристаллов с т. пл. > 300 °С; хроматографически однороден: R = 0.33 на силуфоле УФ-254 в системе хлороформ : метанол (2 : 1). Из водного маточника полностью выпаривали воду на роторном испарителе при температуре не выше 60°С и после длительной выдержки в вакууме сиропообразный остаток растворяли в абсолютном этиловом спирте, обрабатывали при кипячении осветляющим углем, фильтровали и оставляли на кристаллизацию в холодильнике с затравкой D-рибозы. Вьход кристаллической D-рибозы составлял в среднем 75 %.
6-хлорпурин (3) В реактор загружали 290 мл (3.18 моль) хлорокиси фосфора и приливали в течение 20-30 минут при перемешивании 122 мл (1.91 моль) сухого димети-ланилина при комнатной температуре. Наблюдали незначительный тепловой эффект. К образовавшемуся желто-зеленому раствору присыпали 48.5 г (0.35 моль) сухого порошкообразного (2). Смесь нагревали при перемешивании до 70-80 °С, при этом наблюдался тепловой эффект, масса самопроизвольно нагревалась до 90-95 °С и происходило растворение (2). Темный раствор кипятили при перемешивании в течение 10 минут (температура бани 120-125 °С). Избыток хлорокиси фосфора отгоняли в вакууме при 70-75 °С. Теплый сиропообразный остаток растворяли при перемешивании в 250 мл хлористого метилена. Раствор охлаждали ледяной водой и медленно прикапывали 90 мл этилового спирта. Реакционную массу дополнительно насыщали хлористым водородом и затем выдерживали в течение ночи при охлаждении. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали небольшим количеством хлористого метилена для удаления хлоргидрата диметиланилина, сушили до постоянного веса на воздухе. Для выделения свободного основания 6-хлорпурина (3) полученный гидрохлорид 6-хлорпурина суспендировали в 150 мл воды и нейтрализовали 20 % водным раствором аммиака при температуре 10-15 °С, доводя рН реакционной массы до 5.5-6. При этом наблюдали кристаллизацию (3) в виде желтого обильного осадка. Смесь охлаждали до 0-5 °С в течение 2-3 ч, фильтровали, отжимали, промывали ледяной водой и сушили до постоянного веса. После перекристаллизации из воды получали 45 г (81 %) (1) в виде желтых кристаллов с т. пл. 178 °С (разл): хроматографически однороден, Rf 0.43 в системе хлороформ : метанол (2 : 1). Найдено, %: С 38.85, Н 2.04, N 36.43, Cl 22.79. Q^INCl .Вычислено, %: С 38.90, Н 1.95, N 36.36, Cl 22.70. Метиленхлоридный маточник промывали водой, водной щелочью и перегоняли вначале при атмосферном давлении, а затем в вакууме для регенерации диметиланилина.
6-хлор-(9^-й-рибофуранозил)-пурин (31). К
смеси 118 мл абсолютного хлороформа и 13.1 мл свежепере-гнанного тионилхлорида прикапывали при охлаждении на ледяной бане 5.6 мл абсолютного диметилформамида. Перемешивали в течение 30 минут и затем небольшими порциями присыпали 23.3 г (0.06 моль) сухого 2',3',5'-три-О-ацетилинозина, выдерживали 15 мин. при комнатной температуре, нагревали при перемешивании на водяной бане до 60 °С в течение 5.5 ч. Реакционную массу охлаждали, перенесли в делительную воронку, промывали холодным раствором NaHCÜ3 (3 х 50мл) и водой (3 х 50мл), экстракт сушили Na2SÜ4 и затем обрабатывали осветляющим углем и фильтровали через слой силикагеля. Очищенный хлороформный экстракт выпаривали на роторном испарителе при 30 °С до образования «твердой пены». Продукт растворяли в 150 мл 20 % раствора аммиака в метаноле при охлаждении до 05 °С, перенесли в стальную ампулу, которую герметично закрывали и оставляли на холоде в течение ночи. На следующий день отгоняли метанольный раствор аммиака на роторном испарителе в вакууме, остаток перекристаллизовыва-ли из 90 % этанола. Получали 9.46 г (55 %) (31). в виде светло-желтых кристаллов с Т. пл. 168-170 °С, Rf 0.38 в системе хлороформ : метанол (8 : 1). Найдено, %: С 33.89, Н 2.91, N 19.48. C10H11QN4O8. Вычислено, %: С 34.01, Н 2.85, N 19.56.
Общая методика получения ЛК6-пуриниЛ)-аминокислот, их ^'-ß-D-рибозидов и дипептидов (4-24, 32-37)
К водному раствору (примерно 25-40мл) карбоната натрия (1.1 эквивалент), прибавляли аминокислоту (2 эквивалента) и после растворения аминокислоты присыпали (3) или (31) (1 эквивалент). Смесь нагревали в течение нескольких часов при 80-90 °С, поддерживая рН раствора около 9. Полноту прохождения реакции контролировали хроматографически (ТСХ). Реакционную массу охлаждали, подкисляли муравьиной кислотой до pH 3-3.5 и оставляли при охлаждении на кристаллизацию. Продукт отфильтровывали, промывали водой, спиртом, эфиром и сушили до постоянного веса. Выход хромато-графически чистых продуктов и физико-химические константы соединений {4-24, 32-37) представлены в таблицах 1 и 2.
Литература
1. D.N. Ward, J. Wade, EF. Walborg, [et a/]. The Synthesis of N-(6-Pyrinyl)amino Acids. Amino Acids with a Single Reactive Amino Group // J. Org. Chem. 1961. V. 26. P.5000-5005.
2. Швачкин Ю.П., Прокофьев М.А. Пиримидины и аминокислоты!: взаимопревращения в биологических и химических системах. // Вестник Моск. ун-та. 1964. Т. 2. С. 3-15.
3. Иванов А.А., Баскин ИИ Молекулярное моделирование аденозиновых рецепторов // Вестн. Моск. ун-та. Сер.2. Химия. 2002. Т. 43. № 4. С. 231
4. Ueda T., Fox. Pyrimidyl, Purinyl Amino Acid. // J. Med. Chem. 1963. V. 6. P. 697-701.
5. А.с. СССР 1089093. МКИ C07D 473/34. Способ получения аденина / Студенцов Е.П., Иванов ГВ., Ивин Б.А., Лаврентьев А.Н., Степных Ю.П. - №3483224/23-04; заявл. 05.08.82; опубл. 30.04.84. - Бюл. №16.
6. C. Gizish, H. Ross. Aminoacyl nucleosides. III. A Novel Rearangement: Conversion of N6-(a-Aminoacyl)adenines into N-(6-pyrinyO-aminoAcids // Biochemistry. 1966. V.5. No. 6. Р. 2082-2091.
7. Zemiicka J., Sorm F. Nucleic Acid components and their Analogues. LX. The Reaction of Dimethylchloromethyleneammonium chloride with 2', 3', 5'-tri-o-acetylinosine. A New Synthesis of 6-chloro-9-(p-D-ribofuranosyl)-purine. // Coll. Czechoslov. Chem. Cbmmun. 1965. V. 30 P. 1880-1888.
8. Гордон А., Форд Р. Спутник химика М.: Мир, 1976.
541 с.
