CC BY
217
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Для корреспонденции
Перова Ирина Борисовна - кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-92 E-mail: Erin.Feather@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-5975-1376
Перова И.Б., Эллер К.И., Мусатов А.В., Тумольская Е.В.
Синефрин в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции: биологическая активность, безопасность и методы анализа
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Синефрин является натуральным протоалкалоидом горького апельсина Citrus aurantium L., имеющим структурное сходство с эфедрином и адреналином. Синефрин в виде экстракта горького апельсина широко применяется в качестве ингредиента биологически активных добавок (БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (СПП), предназначенных для снижения массы тела и улучшения физической формы. Наряду с термогенным и липолитическим действием синефрин способен вызывать побочные эффекты со стороны сердечнососудистой системы, особенно в сочетании с кофеином и физической нагрузкой. Этот аспект актуален, поскольку основными потребителями продуктов для похудения являются лица с избыточной массой тела, которые подвержены риску развития сердечно-сосудистых заболеваний.
Цель работы - гигиеническая оценка использования экстракта горького апельсина и синефрина в БАД к пище и СПП, которая включает анализ подходов к техническому регулированию в Российской Федерации и за рубежом, обзор данных по биологической активности, безопасности, способах фальсификации и методов определения цитрусовых протоалкалоидов.
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания (тема 0529-2019-0058).
Конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Перова И.Б., Эллер К.И., Мусатов А.В., Тумольская Е.В. Синефрин в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции: биологическая активность, безопасность и методы анализа // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 6. С. 101-113. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-101-113 Статья поступила в редакцию 26.08.2021. Принята в печать 26.10.2021.
Funding. The research was carried out under state assignment (Theme 0529-2019-0058). Conflict of interest. The authors declare no conflicts of interest.
For citation: Perova I.B., Eller K.I., Musatov A.V., Tymolskaya E.V. Synephrine in dietary supplements and specialized foodstuffs: biological activity, safety and methods of analysis. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (6): 101-13. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-101-113 (in Russian)
Received 26.08.2021. Accepted 26.10.2021.
Synephrine in dietary supplements and specialized foodstuffs: biological activity, safety and methods of analysis
Perova I.B., Eller K.I., Musatov A.V., Tymolskaya E.V.
Результаты. Адренергическое действие горького апельсина обусловлено присутствием К-(-)-п-синефрина, который составляет 90% и более от суммы протоалкалоидов. При производстве БАД к пище и СПП используются сухие экстракты плодов горького апельсина, стандартизованные по содержанию синефрина, которое может варьировать от 4 до 98%. Синефрин является слабым адренергическим агонистом, действующим преимущественно через Руадренорецепторы, стимулируя липолиз. В связи с недостаточными данными о безопасности потребление синефрина регулируется в Российской Федерации и за рубежом. В Российской Федерации верхний допустимый уровень суточного потребления синефрина составляет 30 мг. Выявлены различные случаи фальсификации БАД к пище и СПП для снижения массы тела и питания спортсменов: недекларированное добавление синефрина в составе экстракта горького апельсина, добавление синтетического синефрина, его изомеров или аналогов. Основным методом определения синефрина и других биогенных аминов в БАД к пище и СПП является высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым и/или масс-детектированием.
Заключение. Приведенные в обзоре данные подтверждают целесообразность разработки официальной методики определения основных протоалкалоидов и проведения на его основе мониторинга БАД к пище и СПП на содержание синефрина и других цитрусовых протоалкалоидов.
Ключевые слова: синефрин, горький апельсин, БАД к пище, фальсификация, ВЭЖХ
Synephrine is a natural protoalkaloid of the bitter orange Citrus aurantium L., it has structural similarity to ephedrine and adrenaline. Synephrine in the form of bitter orange extract is widely used as an ingredient of dietary supplements (DS) and specialized foodstuffs (SF) intended for weight loss and fitness improvement. Along with thermogenic and lipolytic effects, synephrine can cause cardiovascular side effects, especially when combined with caffeine and physical activity. This aspect is important, insofar as the main consumers of weight loss products are overweight people who are at risk of developing cardiovascular diseases.
The aim of the research is a hygienic assessment of the usage of bitter orange extract and synephrine in DS and SF, which includes an analysis of approaches to technical regulation in the Russian Federation and abroad, a review of data on biological activity, safety, types of adulteration and methods for the determination of citrus protoalkaloids. Results. The adrenergic effect of bitter orange is caused by the presence of R-(-)-p-synephrine, making up about 90% or more of the total protoalkaloids. Dry bitter orange fruit extracts, standardized to synephrine content, which can vary from 4 to 98%, are used in the production of DS and SF. Synephrine is a weak adrenergic agonist, acting primarily through fiyadrenergic receptors, stimulating lipolysis. Because of insufficient safety data, the consumption of synephrine is regulated in the Russian Federation and abroad. The upper permissible level of synephrine consumption in the Russian Federation is 30 mg per day. Various cases of adulteration of DS and SF for weight loss and sport nutrition have been revealed: undeclared addition of synephrine in the form of bitter orange extract, addition of synthetic synephrine, its isomers or analogs. The main method for the determination of synephrine and other biogenic amines in DS and SF is high performance liquid chromatography with ultraviolet and/or mass detection.
Conclusion. The data presented in the review confirm the feasibility of developing an official method for determination of main protoalkaloids and monitoring of DS and SF for the content of synephrine and other citrus protoalkaloids on its basis. Keywords: synephrine, bitter orange, dietary supplements, adulteration, HPLC
Синефрин является основным биогенным амином горького апельсина Citrus aurantium L., имеющим структурное сходство с эфедрином и адреналином. В незначительных концентрациях он может присутствовать в ряде других представителей цитрусовых Citrus spp. (мандарин, апельсин, лимон). Широкое применение синефрина в составе биологически активных добавок (БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (СПП) связывают с запретом в 2004 г. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых
продуктов и медикаментов США (FDA) использования травы эфедры и эфедрина в составе растительных препаратов и БАД к пище, предназначенных для снижения массы тела и спортивного питания. В качестве альтернативы эфедрину для БАД к пище и СПП, направленных на снижение жировой массы, подавление аппетита, повышение термогенеза, ускорение метаболизма, был предложен синефрин, обычно в виде экстракта горького апельсина. Наряду с термогенным и липолитическим действием экстракты горького апельсина и синефрин
оказывают ряд побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы [1-4]. Этот аспект особенно актуален, поскольку целевая аудитория продукции для похудения - лица с избыточной массой тела и ожирением, подверженные риску развития сердечно-сосудистых заболеваний. Экстракт горького апельсина способен ингибировать изофермент цитохрома Р450 CYP3A4, поэтому не следует исключать взаимодействия с лекарственными препаратами (ЛП), приводящие к изменению их фармакодинамических свойств. Кроме того, синергизм, наблюдаемый при одновременном приеме синефрина с кофеином, особенно в сочетании с физической активностью, может привести к усилению таких побочных эффектов, как тахикардия и гипертензия. Другие активные компоненты, содержащиеся в экстракте горького апельсина, также могут усиливать побочные эффекты синефрина.
Цель настоящего обзора - гигиеническая оценка использования экстракта горького апельсина и синефрина в БАД к пище и СПП, которая включает анализ подходов к техническому регулированию в Российской Федерации и за рубежом, обзор данных о биологической активности, безопасности, способах фальсификации и методах определения цитрусовых протоалкалоидов.
Горький апельсин Citrus aurantium L.
Горький апельсин Citrus aurantium L. [таксономические синонимы C. aurantium L. subsp. aurantium и C. aurantium subsp. amara (Link) Engler], называемый также померанцем, кислым и севильским апельсином, - вид растений рода Citrus spp. семейства Рутовые (Rutaceae). Родиной горького апельсина считается Юго-Восточная Азия, в настоящее время коммерческое культивирование горького апельсина проводится в Южной Европе, странах Средиземноморья, Карибского бассейна и США. Горький апельсин известен под различными местными народными названиями во многих странах мира, где он используется в кулинарии, парфюмерии и медицине. Плоды, кожура и эфирное масло применяются для приготовления мармеладов и других кондитерских изделий, сиропов, соков, ликеров, пива, горьких настоек, маринадов и приправ. Горький апельсин является источником многих коммерческих ингредиентов для парфюмерной промышленности, в том числе масла нероли и петигренового масла. В традиционной медицине стран Азии плоды горького апельсина в течение многих столетий использовались для лечения диспепсии.
Кожура горького апельсина содержит до 2,5% эфирного масла, основным компонентом которого является (Я)-(+)-лимонен, производные кумаринов (меранзин, умбеллиферон, эпоксибергамоттин, бергаптен), глико-зиды флаванонов и флавонолов с горьким (нарингин, неогесперидин, неоэриоцитрин) и негорьким (рутин, гесперидин, эриоцитрин) вкусами, полиметилированные флавоны (синенсетин, нобилетин, танжеретин и др.), а также тетранортритерпены (лимоноиды) [5, 6].
OH
OH
HO
NH
HO
HO
Октопамин Octopamine
NH
HO
Синефрин Synephrine
H
Nv.
HO
Тирамин Tyramine
N-метилтирамин N-methyltyramine
Горденин Hordenine
Рис. 1. Химические структуры биогенных аминов горького апельсина Fig. 1. Chemical structures of bitter orange biogenic amines
В плодах горького апельсина обнаружены фенэта-нол- и фенэтиламины: октопамин, синефрин, тирамин, Ы-метилтирамин и горденин (рис. 1). По химической классификации их относят к биогенным аминам, или протоалкалоидам. Основным действующим началом, обусловливающим адренергическое действие горького апельсина, считается п-синефрин, на долю которого приходится более 90% от суммы протоалкалои-дов. По данным литературы, концентрация синефрина в сушеной кожуре и сушеных плодах горького апельсина варьирует в диапазоне от 0,05 до 3,1% [5-7]. Наибольшее количество синефрина было обнаружено в цедре неспелых плодов [6].
Синефрин
По химической структуре синефрин (п-синефрин, ок-седрин, Я-(-)-4-[1-гидрокси-2-(метиламино)этил]фенол) представляет собой вторичный метилфенэтаноламин с фенольным гидроксилом в п-положении (см. рис. 1). Наличие алифатической аминогруппы придает сине-фрину выраженные основные свойства. Хиральный атом углерода в 1' положении обусловливает существование синефрина в виде двух энантиомеров (в)-и (Я)-конфигурации (рис. 2). Удельное вращение Я-(-)-изомера в 0,5 н. растворе соляной кислоты составляет -55,6° [8].
В плодах горького апельсина и других цитрусовых содержится Я-(-)-синефрин. В процессе переработки под действием высоких температур в кислой или щелочной средах может происходить рацемизация [9]. Полученный путем химического синтеза синефрин является рацематом.
При производстве БАД к пище и СПП используются сухие водно-спиртовые экстракты сушеных незрелых плодов или сушеной кожуры незрелых и зрелых плодов горького апельсина. Они стандартизируются по содержанию п-синефрина, которое может варьировать от 4 до 98% [5, 10]. В ряде случаев производители дополнительно стандартизируют экстракты горького апельсина по содержанию минорных протоалкалоидов (октопа-мина, горденина).
H
N
OH
OH
HO
NHCH
HO
NHCH
В-(-)-синефрин R-(-)-synephrine
Б-(+)-синефрин S-(+)-synephrine
Рис. 2. Энантиомеры синефрина Fig. 2. Enantiomers of synephrine
Применение горького апельсина в медицине
В Китайскую фармакопею включены 2 вида лекарственного растительного сырья горького апельсина: Егис-ЛигапМ и Еги&иэ ЛигапМ ¡ттаШгиэ (^ЫБЫ).
ZhiQiao представляют собой сушеные зрелые плоды, собранные в июле, ZhiShi - незрелые плоды, собранные в мае-июне (табл. 1). При этом каждый вид сырья нашел свое применение в клинической практике как средство для лечения функциональных заболеваний же-
лудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Дозировка составляет от 3 до 10 г высушенных плодов в день в виде отвара.
Фармакопейные статьи на незрелые плоды
горького апельсина Еги^иэ аигапШ ¡тта^гиэ включены в Тайваньскую травяную фармакопею 2-го издания, на цедру - в Японскую фармакопею 17-го издания (см. табл. 1). Европейская фармакопея 7-го издания содержит монографии на цветки, масло цветков, эпикарп-мезокарп и настойку эпикарпа-мезокарпа горького апельсина (см. табл. 1). Незрелые плоды стандартизуют по содержанию синефрина, а зрелые - по содержанию флаванонгликозидов или эфирного масла.
В современной европейской фитотерапии кожура горького апельсина используется для стимуляции аппетита и лечения диспепсии и связанных с ней состояний. Согласно рекомендациям Немецкой комиссии Е при Федеральном институте лекарственных средств и медицинских устройств суточная доза для высушенной цедры составляет 4-6 г, для настойки - 2-3 г и для экстракта - 1-2 г [5].
Следует отметить, что традиционное применение горького апельсина в качестве средства для лечения
6
Таблица 1. Фармакопейное лекарственное растительное сырье горького апельсина Table 1. Bitter orange herbal drugs included in Pharmacopoeias
Фармакопея Pharmacopoeia Лекарственное растительное сырье/препарат Individual monograph on herbal drug Качественный анализ Identification Количественный анализ Assay
Государственная фармакопея Китайской народной республики (ГФКНР) 2010 Сушеные незрелые плоды горького апельсина Fructus Aurantii immaturus (ZhiShi) Обнаружение синефрина методом ТСХ Определение содержания синефри-на методом ВЭЖХ (>0,3%)
Сушеные зрелые плоды горького апельсина Fructus Aurantii (ZhiQiao) Цветная реакция на флаванонгликозиды Определение содержания нарин-гина и неогесперидина методом ВЭЖХ (не менее 4 и 3% соответственно)
Тайваньская травяная фармакопея 2-го издания Сушеные незрелые плоды горького апельсина Fructus Aurantii immaturus ZhiShi Обнаружение синефрина методом ТСХ Определение содержания этанолрастворимых экстрактивных веществ (>12%), водорастворимых экстрактивных веществ (>20%), определение содержания синефрина методом ВЭЖХ (>0,3%)
Японская фармакопея 17-го издания Цедра горького апельсина Aurantii pericarpium Обнаружение нарингина методом ТСХ Определение содержания эфирного масла экстракционным методом
Европейская фармакопея 10-го издания Эпикарп и мезокарп горького апельсина Aurantii amari epicarpium et mesocarpium Обнаружение кофейной кислоты и нарингина методом ТСХ Определение содержания эфирного масла (>20%)
Настойка эпикарпа и мезокарпа горького апельсина Aurantii amari epicarpii et mesocarpii tinctura Обнаружение кофейной кислоты и нарингина методом ТСХ -
Цветки горького апельсина Aurantii amari flos Обнаружение нарингина и гесперидина методом ТСХ Определение суммарного содержания флавоноидов в пересчете на нарингин (>8%) методом спектрофотометрии
Эфирное масло цветков горького апельсина Aurantii amari floris aetheroleum Идентификация компонентов эфирного масла методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием -
функциональных заболеваний ЖКТ принципиально отличается от его применения в качестве ингредиента БАД к пище и СПП для снижения массы тела.
Синефрина тартрат (Окседрин, Симпатол, Симпалепт) зарегистрирован в качестве рецептурного лекарственного препарата для лечения астмы и гипотензии в ряде стран Европейского союза (ЕС). Дозировка для взрослых составляет 100-150 мг 3 раза в день, для детей в возрасте от 4 до 10 лет - 75-100 мг 3 раза в день, от 1 года до 4 лет - 50-75 мг 3 раза в день и 15-25 мг 3 раза в день для детей в возрасте от 3 мес.
Применение синефрина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции
На территории Таможенного союза с 2011 по 2020 г. зарегистрировано более 90 БАД к пище, в составе которых фигурирует синефрин. В большинство БАД к пище синефрин включен в виде экстракта плодов, кожуры плодов или семян горького апельсина. В отдельных случаях в состав БАД к пище входит синтетический синефрин в виде гидрохлорида. Количество синефрина в БАД к пище варьирует от следовых концентраций до 30 мг, иногда с примечанием «не более», поскольку согласно Приложению 5 Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) верхний допустимый уровень суточного потребления синефрина установлен на уровне 30 мг.
Механизм действия синефрина
Сходство синефрина с эндогенными агонистами адренорецепторов: адреналином и норадреналином -заключается в общем основном структурном элементе - фенэтиламине. Фенольные гидроксилы в ми п-положениях затрудняют прохождение через гемато-энцефалический барьер, поэтому влияние на центральную нервную систему (ЦНС) отсутствует. Синефрин, а также октопамин, горденин и фенилэфрин относятся к адреномиметикам прямого действия, поскольку на периферии напрямую связываются с адренорецеп-торами и активируют их. Адреналин и норадреналин также имеют фенольный гидроксил в м-положении, который, по данным исследований, способствует связыванию адренергических рецепторов, ответственных за сердечно-сосудистые эффекты, в то время как фенольный гидроксил в п-положении снижает связывание адренергических рецепторов [1]. Поэтому п-синефрин и п-октопамин являются более слабыми адренергическими агонистами, чем их м-изомеры: м-синефрин (фенилэфрин) и м-октопамин (норфен-эфрин). При этом и м- и п-изомеры синефрина и октопамина на несколько порядков менее активны, чем норадреналин [6, 7, 11, 12]. Адренергическая активность Я-(-)-энантиомеров в 1-3 раза выше, чем у соответствующих в-(+)-энантиомеров [6, 12].
Биологическая активность Я-(-)-синефрина в 2 раза выше, чем у рацемата [13, 14]. Показана примерно на 1-2 порядка более высокая активность синефрина и октопамина в отношении а-адренорецепторов, чем в отношении р-адренорецепторов [6, 15]. Предполагается, что синефрин действует преимущественно через р3-адренорецепторы, стимулируя липолиз, в то время как м-синефрин действует через а-, р1- и р2-адренорецепторы, повышая артериальное давление и частоту сердечных сокращений (ЧСС) [15, 16].
Сочетание синефрина с кофеином усиливает эффект снижения массы тела [1-3, 11, 15, 16]. В жировой ткани находятся аденозиновые рецепторы А1, активация которых приводит к подавлению липолиза, повышению захвата глюкозы адипоцитами, снижению выброса ней-ротрансмиттеров. Кофеин является стимулятором ЦНС и сердечно-сосудистой системы, прежде всего за счет антагонистического действия на аденозиновые рецепторы. Кофеин способен также блокировать аденози-новые рецепторы А1 в жировой ткани и дополнительно активировать липолиз.
Фармакокинетика синефрина
После перорального приема человеком синефрин быстро и полностью абсорбируется. Максимальная концентрация в плазме крови достигается через 1-2 ч с периодом полужизни 2-3 ч [7, 16]. Приблизительно 80% синефрина экскретируется с мочой в течение суток. Всего 2,5% синефрина выводится в неизменном виде. Биотрансформация синефрина и октопамина происходит с участием моноаминооксидазы (МАО). Основным метаболитом синефрина в моче является п-гидроксиминдальная кислота (~53%), которая затем превращается в п-гидроксифенилгликоль в свободном виде или в виде конъюгатов с глюкуроновой или серной кислотами [7, 16]. Биодоступность синефрина при пер-оральном введении была более низкой, чем при внутривенном введении.
Горький апельсин ингибирует изофермент цитохрома Р450 CYP3A4 [1, 7, 16], участвующий в метаболизме целого ряда лекарственных средств (ЛС), среди которых блокаторы кальциевых каналов, антиаритмические средства, статины, ингибиторы ангиотензин-превра-щающего фермента, силденафил. В результате потребления БАД к пище и СПП с экстрактом горького апельсина могут повыситься концентрации вышеперечисленных ЛС в крови, следовательно, возникает риск передозировки и токсического действия.
Одновременное потребление БАД к пище и СПП с экстрактом горького апельсина с ингибиторами МАО может привести к увеличению концентрации синефрина, а также других аминов в крови с соответствующими побочными эффектами.
Безопасность, побочные эффекты и токсичность
Прием БАД к пище и потребление СПП, содержащих экстракт горького апельсина, вызывает опасения в основном из-за возможных сердечно-сосудистых по-
бочных эффектов, обусловленных более высоким содержанием синефрина по сравнению с пищевыми продуктами и традиционными отварами из плодов или кожуры горького апельсина [5-7, 11, 15].
В исследовании острой токсичности при пероральном приеме экстракта горького апельсина и синефрина наблюдались такие побочные эффекты, как снижение двигательной активности, затрудненное дыхание, слюноотделение, пилоэрекция и экзофтальм [13]. Все эффекты были обратимыми, возникали через 15 мин после приема и длились в течение 2-4 ч.
Подострая и субхроническая токсичность при перо-ральном приеме экстрактов горького апельсина (4-7,5% синефрина) и чистого синефрина (95-99%) изучались на мышах и крысах в течение 7-79 дней [5, 7, 13-16]. Си-нефрин в виде экстракта горького апельсина и чистого вещества в низких и средних дозах приводил к увеличению ЧСС, снижению гематокрита и общего белка в крови, в максимальных дозах (20-50 мг/кг в день) -к вентрикулярной аритмии, удлинению ОДб-комплекса, повышению систолического и диастолического давления [5, 7, 15, 16]. Показано, что одновременный прием кофеина и физическая активность усиливают эффекты синефрина.
Хроническая, гено-, иммуно-, репродуктивная и онтогенетическая токсичность, а также канцерогенность для синефрина на сегодняшний день недостаточно изучены.
Подтвержденных данных о побочных эффектах экстракта горького апельсина и его компонентов немного. В 2003-2014 гг. в США, Канаде и Европе были опубликованы отчеты о побочных эффектах и случаях смерти при потреблении продуктов с экстрактом горького апельсина [7, 11, 12, 15-17]. Интерпретация результатов большинства отчетов затрудняется тем, что использованные многокомпонентные продукты содержали, кроме экстракта горького апельсина, эфедру, кофеин, их комбинацию, а также приемом других БАД к пище, ЛС и наркотиков, недостатком информации о состоянии здоровья и вредных привычках [7, 12, 15-17]. Только в единичных случаях причинно-следственная связь между приемом БАД к пище с экстрактом горького апельсина и возникновением побочных эффектов была оценена как «вероятная» или «весьма вероятная» [7, 17].
Количество клинических исследований влияния экстракта горького апельсина и синефрина на сердечнососудистую систему ограничено, а полученные данные неоднозначны. В нескольких работах сообщалось о повышении систолического и диастолического давления, а также ЧСС у здоровых нормотензивных людей при потреблении синефрина в составе экстракта горького апельсина, особенно в сочетании с кофеином [5, 7, 11, 12, 15-17]. Подавляющее большинство клинических исследований было проведено на здоровых людях с нормальным давлением, в то время как основными потребителями БАД к пище и СПП с экстрактом горького апельсина являются лица с избыточной массой тела, у которых артериальная гипертензия встречается чаще, чем среди лиц с нормальной массой тела.
Гигиеническое регулирование потребления синефрина
В связи с недостаточными данными о безопасности синефрин является объектом гигиенического регулирования во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации.
Всемирное антидопинговое агентство (ВАДА) включило синефрин в программу мониторинга на 2021 г. с целью выявления способов злоупотребления им в спорте [18]. Октопамин входит в запрещенный список ВАДА [18]. В то же время некоторые национальные спортивные ассоциации запрещают использование как синефрина, так и октопамина [19].
Данные по существующему законодательству, регулирующему применение синефрина в различных странах, приведены в табл. 2.
Анализ рисков фальсификации биологически активных добавок к пище и специализированной пищевой продукции
К возможным проблемам применения экстракта горького апельсина в БАД к пище и СПП относятся неправильная идентификация и фальсификация. В плане ботанической идентификации необходимо отличать экстракты горького апельсина Citrus aurantium L. ssp. aurantium L. от экстрактов бергамота Citrus aurantium L. spp. bergamia (Risso&Poit.) Engl., поскольку в плодах этих подвидов содержатся различные количества биологически активных веществ, в том числе п-синефрина и фуранокумаринов. БАД к пище для снижения массы тела являются одной из самых распространенных групп БАД к пище, используемых потребителями. В этой связи FDA оценивает риск фальсификации БАД к пище для снижения массы тела и спортсменов, содержащих синефрин, как высокий. В отношении синефрина существует несколько типов фальсификации: недеклари-рованное добавление синефрина и других протоалка-лоидов в составе экстракта горького апельсина в БАД к пище, добавление синтетического синефрина, его изомеров (например, м-синефрина) или аналогов.
По данным Европейской системы быстрого оповещения, для пищевых продуктов и кормов (RASFF) с 1998 по 2018 г. синефрин был вторым по распространенности недекларированным фармакологически активным веществом в БАД к пище после силденафила [22]. В БАД к пище, экспортируемых в ЕС из США, содержание синефрина составило 15-21 мг/г. Кроме синефрина были также найдены другие недекларированные биогенные амины: октопамин на уровне 107,5 мг/г и метилсинефрин на уровне 30,0-45,7 мг/г [23]. За 2019-2021 гг. на портале RASFF регулярно появляются сообщения о недеклари-рованном добавлении синефрина в БАД к пище, о сочетании синефрина и кофеина в БАД к пище в странах, где их совместное присутствие в БАД или запрещено, или ограничено.
ш
о
"О
о о
О"
Таблица 2. Гигиеническое регулирование потребления синефрина в различных странах Table 2. Hygienic regulation of synephrine consumption in different countries
CO О
Ю О Ю
О
■vi
Страна Country Статус Legislative status Максимальный уровень потребления Maximum allowable daily consumption Требования к маркировке: особые указания, меры предосторожности, противопоказания Labeling regulrements, warnings, precautions, contraindications Примечания Comments Ссылки References
Нидерланды Запрещен в БАД к пище - - Продукты, содержащие синефрин, следует считать продуктами массового потребления, а не лекарственными средствами или медицинскими товарами. 0- и м-изомеры синефрина, а также их производные в растительных препаратах запрещены [16, 20]
Разрешен в растительных препаратах 27 мг -
Разрешен в пищевых продуктах He установлен -
Дания Запрещен в БАД к пище - - Экстракты с большими концентрациями синефрина недопустимы (без уточнения конкретных значений). Листья горького апельсина включены в Drogelisten -Датский список оценки растений, грибов и их частей, используемых в БАД к пище и травяных чаях (ориентировочное количество 200 мг/сут) [5, 16]
Швеция Запрещен в пищевых продуктах - - Горький апельсин входит в список растений и растительных компонентов, которые нельзя использовать в пищевых целях (V0LM). Продукты, содержащие 160 мг синефрина и более в суточной дозе, считаются лекарственными средствами [5, 16]
Запрещен в БАД к пище - -
Финляндия Запрещен в БАД к пище в сочетании с кофеином - - Сочетание синефрина и кофеина в БАД к пище может представлять риск для здоровья потребителей [16]
Франция Разрешен в БАД к пище 20 мг На этикетки БАД к пище необходимо выносить предупреждения о недопустимости применения детьми, беременными и кормящими, лицами, принимающими гипотензивные препараты Источником синефрина должен быть горький апельсин. Запрещено добавлять кофеин и содержащие кофеин экстракты в БАД к пище с экстрактом горького апельсина [7, 20]
Бельгия Разрешен в БАД к пище 20 мг На этикетку должны быть вынесены предупреждения: - не использовать во время беременности и кормления грудью; - не использовать лицами, которые лечатся от гипертонии; - не использовать детям до 12 лет; - при появлении признаков беспокойства и нервозности прекратить прием БАД к пище Перед выпуском на рынок БАД к пище, содержащих синефрин, необходимо уведомить регулирующие органы. В БАД к пище должно отсутствовать определяемое количество м-синефрина. Продукты с содержанием синефрина более 20 мг считаются медицинскими [16, 20]
Германия Разрешен в БАД к пище 6,7 мг (в составе БАД к пище), 25,7 мг (суммарно из рациона питания и БАД к пище) Федеральным институтом оценки рисков (BfR) предложены следующие требования к маркировке БАД к пище и СПП, содержащих синефрин и кофеин: - может привести к повышению артериального давления и ЧСС, не подходит для людей с гипертонией, ожирением и другими сердечно-сосуди-стыми заболеваниями; - [11]
о со ш
рп
о ь ь
CD
■а
ш
—I
о
со >
о
00
Окончание табл. 2
Страна Country Статус Legislative status Максимальный уровень потребления Maximum allowable daily consumption Требования к маркировке: особые указания, меры предосторожности, противопоказания Labeling requirements, warnings, precautions, contraindications Примечания Comments Ссылки References
- проконсультируйтесь с врачом при применении в сочетании с лекарственными препаратами; - соблюдайте осторожность при потреблении в сочетании с интенсивными физическими нагрузками; - не предназначен для беременных и кормящих и детей
Италия Разрешен в БАД к пище 30 мг - В составе БАД к пище должен быть натуральный синефрин из экстракта горького апельсина [20]
Канада Разрешен в БАД к пище 50 мг Установлены следующие требования к маркировке: - противопоказано детям, беременным и кормящим; - не использовать в сочетании с лекарствами, которые могут влиять на артериальное давление (гипотензивные средства), тиреоидными препаратами, симпатомиметиками или ингибиторами МАО Продукты с более высоким содержанием синефрина или без соответствующих противопоказаний на этикетке относят к типу II риска для здоровья. Считается, что применение таких продуктов может вызвать временные неблагоприятные последствия или существует возможность отдаленных серьезных неблагоприятных последствий [15, 16]
40 мг в сочетании с кофеином
США Разрешен в БАД к пище Не установлен Национальный центр дополнительной и альтернативной медицины (NCCAM) Национального института здоровья (NIH) США рекомендует людям с заболеваниями сердца или артериальной гипертонией, а также людям, потребляющим вещества, способные увеличивать ЧСС (кофеин, ЯП), избегать приема БАД к пище, содержащих горький апельсин FDA отправляло предупредительные письма компаниям, выпускающим БАД к пище, содержащие стандартизованные экстракты горького апельсина (4-60%). Согласно законодательству США, такие экстракты считаются новыми пищевыми ингредиентами и производитель до выпуска БАД к пище на рынок должен предоставить информацию о способе применения продукта, традиции пищевого применения ингредиента, ссылки на литературу и другие доказательства безопасности [7.21]
Разрешен в пищевых продуктах Не установлен -
Австралия Разрешен в БАД к пище, но запрещен в БАД к пище для спортсменов 30 мг Синефрин внесен в список S4 (лекарства, отпускаемые только по рецепту), за исключением продуктов, содержащих 30 мг синефрина или менее в суточной дозе, поскольку такая доза обеспечивает приемлемый 10-кратный коэффициент безопасности. Синефрин относится к ингредиентам БАД к пище для спортсменов, вызывающим опасение. В 2020 г. предложено государственное регулирование некоторых БАД к пище для спортсменов как лекарственных препаратов [12]
> .с
00 >
оп m
СО
> О
00 О"
£э <
ш
о
"О
о о
CD О
ю о ю
Таблица 3. Содержание натуральных и синтетических аминов в биологически активных добавках к пище (БАД), распространяемых в торговой сети США [по данным 24]
Table 3. Content of natural and synthetic amines in dietary supplements from USA market [according to 24]
Тип БАД к пище Dietary supplement type n Суточная доза индивидуальных аминов согласно этикетке БАД к пище, мг Dally Intake for Individual amines according to the label Information for its suggested consumption, mg
октопа- мин octopa-mine синефрин syneph-rine тира-мин tyra-mine N-метил-синефрин N-methyl-synephrine N-метил-тирамин N-methyl-tyramine изопропилоктопамин isopropyl-octopamine горде- нин horde-nine
С порошком плодов горького апельсина Containing bitter orange fruit powder 6 Н/о 0,25-7,1 Следы Н/о 0-0,84 Н/о -
С экстрактом плодов горького апельсина Containing bitter orange fruit extract 11 0-0,14 0,023-35 0-0,20 Н/о 0,20-13 Н/о 0-0,20
Со стандартизованным экстрактом плодов горького апельсина Containing standardized bitter orange fruit extract 22 0-0,83 0,080-160 0-1,1 Н/о 0,001-26 Н/о 0-0,91
Со стандартизованным экстрактом плодов горького апельсина и субстанциями аминов Containing standardized bitter orange fruit extract + pure amines 5 0-0,028 0,39-93 0-0,36 0-110 0,02-6,2 Н/о 0,03817
С субстанциями аминов Containing pure amines 15 0-130 0,049-53 0-0,10 0-240 0-10 0-76 0-60
П р и м е ч а н и е. Н/о - не обнаружено. Note: Н/о - not found.
В 2020 г. опубликованы результаты исследования, проведенного в лаборатории Центра по безопасности пищи и прикладного питания (CFSAN, Center Food Safety and Applied Nutrition) [24]. Был проведен анализ 5 натуральных и 4 синтетических фенэтиламинов в 59 БАД к пище, содержащих сырье, экстракты и стандартизованные экстракты горького апельсина, а также чистые фенэти-ламины из горького апельсина и/или их синтетические производные. Синефрин был найден во всех образцах (табл. 3). В ряде БАД к пище обнаружено высокое содержание аминов - до 160 мг синефрина, 130 мг октопа-мина, 60 мг горденина и 26 мг N-метилтирамина в суточной дозе, что существенно превышает установленные в Российской Федерации и ЕС безопасные уровни поступления этих веществ. В состав некоторых БАД к пище были включены даже ЛП метилсинефрин (оксилофрин) и изопропилоктопамин (БетафринТМ) в количестве соответственно до 240 и 76 мг/сут. Оксилофрин не встречается в природе и представляет собой синтетическое производное синефрина. Он зарегистрирован в некоторых странах, например в Великобритании, как рецептурный ЛП для стимуляции работы сердца и лечения гипотонии. Обычно терапевтическая суточная доза оксилофрина для взрослых составляет 16-40 мг, для детей и подростков 8-24 мг.
Оксилофрин и другие синтетические амины запрещены для использования в БАД к пище в Российской Федерации, США, странах Европы, Австралии и Новой Зеландии. Оксилофрин также входит в запрещенный список ВАДА [18]. В составе БАД к пище он может обозначаться как «метилсинефрин», «синефрин» или маскироваться под растительный компонент - экстракт черно-кистной акации Vachellia rigidula (Benth.) Seigler&Ebinger.
Согласно опубликованным в Нидерландах результатам исследований, прием БАД к пище, содержащих оксилофрин, привел к возникновению 26 побочных эффектов, среди которых тошнота, рвота, тахикардия, аритмия и гипертония [24, 25].
На этикетках БАД к пище с экстрактом горького апельсина, произведенных в США и Европе, часто не декларируется наличие синефрина.
Потенциальную опасность для потребителей представляют незарегистированные в Российской Федерации БАД к пище и СПП, которые реализуются через интернет-магазины и торговые онлайн-площадки. В состав таких продуктов входят экстракты горького апельсина с содержанием синефрина 50% и более, синтетический синефрин, горденин, метилсинефрин под видом экстракта чернокустарниковой акации и другие запрещенные амины, а суточные дозы синефрина превышают 30 мг. В этой связи необходимо при проведении экспертизы разрабатывать и внедрять в практику работы контролирующих лабораторий методики анализа БАД к пище и СПП на содержание синефрина и родственных аминов.
Методы анализа синефрина в сырье, биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции
Для определения синефрина и других адренергических аминов в сырье, экстрактах, БАД к пище и СПП используют обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ ВЭЖХ) с диодно-матричным (ДМД) спектрофотометрическим [9, 10, 13, 26-35], флуо-
риметрическим [27, 28, 31, 36, 37], электрохимическим [38] или масс-спектрометрическим (МС) детектированием [24, 31, 39-42], высокоэффективную тонкослойную хроматографию с денситометрией [43] и капиллярный электрофорез (КЭФ) со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием [44].
Наиболее распространенным методом количественного анализа синефрина и других биогенных аминов горького апельсина является ОФ ВЭЖХ. Разделение биогенных аминов проводится на колонках С18, С8 или колонках с сильным катионообменным сорбентом [13, 26, 45-47] в изократическом или градиентном режиме. Водный компонент подвижной фазы имеет сильнокислую (рН 2-3), нейтральную или слабощелочную реакцию среды (рН 7-8). Органические компоненты подвижной фазы включают ацетонитрил, метанол или их смеси. Проблемы, возникающие при анализе биогенных аминов, связаны с их относительно низким содержанием в сырье, выраженными основными свойствами, высокой полярностью и низким коэффициентом удерживания на колонках С18, малой интенсивностью и неселективностью поглощения в области ультрафиолетового (УФ)-спектра, характерной для многих ароматических соединений (220-230 и 270-280 нм). С целью оптимизации времени удерживания и улучшения формы пиков для анализа биогенных аминов часто применяется ион-парная ВЭЖХ. В качестве ион-парных реагентов используют додецилсульфат натрия [27-30, 32, 33], лау-рилсульфат натрия [34] и гексансульфоновую кислоту [26, 35]. Проблемы недостаточного удерживания и слабого сигнала синефрина в УФ-спектре, связанные с недостатком хромофорных групп, иногда решали с помощью пред- и постколоночной дериватизации [39, 40, 48]. В качестве дериватизующих агентов для синефрина и других аминов используют дансил хлорид, 9-флуо-ренилметилхлорформиат и о-фталевый альдегид. Описано также использование флуориметрического
детектора, поскольку синефрин и другие биогенные амины цитрусовых обладают естественной флуоресценцией в УФ-области спектра с длинами волн возбуждения 270-280 нм и длинами волн эмиссии 300-320 нм [27, 28, 31, 36, 37].
В последнее десятилетие для анализа биогенных аминов цитрусовых широкое применение получила ВЭЖХ-МС с ионизацией электрораспылением и различными типами масс-анализаторов, среди которых времяпролетный, квадрупольный, тройной квадруполь-ный, квадрупольно-времяпролетный, ионная ловушка [24, 39-42]. Такой подход позволяет с высокой селективностью и чувствительностью идентифицировать и определять следовые количества биогенных аминов в сложных матриксах БАД к пище и СПП. Молекулярная масса синефрина составляет 167,21 г/моль. Детектирование синефрина в режиме полного сканирования положительных ионов проводится по протонированному псевдомолекулярному иону [M + H]+ с m/z 168 Да и дегидратированному протонированному псевдомолекулярному иону [M - H2O + H]+ с m/z 150 Да.
Определение энантиомеров синефрина проводят с помощью хиральных ВЭЖХ и КЭФ [40, 44, 48]. В первом случае разделение проводится с использованием хиральных колонок, во втором - циклодекстринов в буферном растворе.
Результаты определения синефрина в растительном сырье, экстрактах, биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции
В научных целях, а также для проведения исследования содержания синефрина в БАД к пище и СПП в рамках санитарно-эпидемиологической экспертизы была разработана оригинальная ион-парная ОФ ВЭЖХ-ДМД-методика. Извлечение синефрина из матриксов
Таблица 4. Условия определения синефрина и октопамина методом ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием (ДМД)
Table 4. Conditions for the determination of synephrine and octopamine by ion-pair reversed-phase HPLC (high-performance liquid chromatography) with diode-array detection
Показатель / Parameter Значение / Value
Насос:
- состав подвижной фазы А - водный раствор формиата аммония с концентрацией 20 ммоль и гексансуль-фоновой кислоты с концентрацией 5 ммоль; В - ацетонитрил
- режим элюирования Градиентное элюирование: 0-20 мин 0-30% В, 20-21 мин 30-0% В, 21-30 мин 0% В
- скорость потока, см3/мин 1,0
Инжектор:
- объем ввода, см3 0,010
Термостат колонок:
- температура, °C 40
Детектирование ДМД при Я=224 нм и Я=272 нм
Хроматографические характеристики методики:
- примерное время удерживания октопамина, мин (?я) - примерное время удерживания синефрина, мин (?я) 12,5 (±0,2) 13,4 (±0,2)
А/А
mAU 500-1
400 300 200 100 0
СП LO ^
53 51
1
CD CD
in in
mi
а
а.
n
О Ш
V | ,
0
10
12
14
16
18 min
Б/B
mAU
1200 1000 800 600 400 200 0
0
jj^.
со
СП
2
4
6
8
10
12
14
16
18
min
Рис. 3. Хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина (А) и метанольного экстракта биологически активной добавки к пище с экстрактом горького апельсина (Б) при Х=224 нм
Fig. 3. Chromatogram of a mixture of standards of synephrine and octopamine (A) and methanol extract of dietary supplement containing bitter orange extract (B) at X=224 nm
2
6
8
4
растительных экстрактов, БАД к пище и СПП проводили 50% водным метанолом на ультразвуковой бане при комнатной температуре. Субстанции синефрина и октопамина гидрохлорида растворяли в метаноле. В качестве неподвижной фазы использовали колонку Phenomenex Luna C18(2) 250x4,6 мм с размером частиц 5 мкм. Экспериментально подобранные условия оптимального хроматографического разделения синефрина и октопамина приведены в табл. 4.
Хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина изображена на рис. 3А, извлечения из БАД к пище с экстрактом горького апельсина - на рис. 3Б.
Разработанная методика прошла метрологическую аттестацию, получила статус методики измерений МИ (регистрационный № 21-12ФЦ/89-м от 07.09.2021) и была включена в соответствующий проект методических ука-
заний МУК «Методика определения синефрина и ок-топамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции».
Для подтверждения присутствия синефрина в ряде образцов дополнительно проводили ВЭЖХ-МС. Исследовано более 80 образцов, среди которых субстанции синефрина и октопамина гидрохлорида, экстракты горького апельсина, БАД к пище и СПП. Стандартизованные по содержанию синефрина экстракты горького апельсина соответствовали спецификации производителя (6, 8 или 10%, а в 4 образцах - 30%). Количество синефрина в БАД к пище и СПП варьировало от следовых количеств до 32 мг/капс, что превышает верхний допустимый уровень потребления 30 мг. В большинстве исследованных БАД к пище и СПП количество синефрина составляло 5-6 мг в 1 капсуле или таблетке и соответствовало адекватному
суточному потреблению синефрина (5 мг). В 9 образцах БАД к пище и СПП синефрин не был обнаружен.
В одном образце экстракта горького апельсина были обнаружены октопамин и синефрин (6 и 10% соответственно). Другие минорные протоалкалоиды (тирамин, Ы-метилтирамин и горденин) присутствовали в ряде образцов в количествах на порядок и более меньших, чем синефрин.
Заключение
Приведенные данные подтверждают целесообразность разработки официальной методики анализа прото-алкалоидов и проведения на ее основе мониторинга БАД к пище и СПП, предназначенных для контроля массы тела и спортивного питания, на содержание си-нефрина и других цитрусовых протоалкалоидов.
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация):
Перова Ирина Борисовна (Irina B. Perova) - кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа E-mail: Erin.Feather@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-5975-1376
Эллер Константин Исаакович (Konstantin I. Eller) - доктор химических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа E-mail: ellki42@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-1046-4442
Мусатов Андрей Викторович (Andrey V. Musatov) - кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории мета-боломного и протеомного анализа E-mail: andrey.musatov2012@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-5351-385X
Тумольская Елена Викторовна (Elena V. Tumolskaya) - младший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа E-mail: tum.elena@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3913-0799
Литература/References
1. Stohs S.J. Safety, efficacy, and mechanistic studies regarding Citrus 8. aurantium (bitter orange) extract and p-synephrine. Phytother Res. 2017; 31 (10): 1463-74. DOI: https://doi.org/10.1002/ptr.5879
2. Ruiz-Moreno C., Del Coso J., Giraldez-Costas V., Gonzalez-Garcia J., Gutierrez-Hellin J. Effects of p-synephrine during exercise: 9. a brief narrative review. Nutrients. 2021; 13 (1): 233. DOI: https:// doi.org/10.3390/nu13010233
3. Kaats G.R., Leckie R.B., Mrvichin N., Stohs S.J. Increased eating control and energy levels associated with consumption 10. of bitter orange (p-synephrine) extract: a randomized placebo-controlled study. Nutr Diet Suppl. 2017; 9: 29-35. DOI: https://doi. org/10.2147/NDS.S136756
4. Di Lorenzo C., Ceschi A., Kupferschmidt H., Lüde S., De Souza 11. Nascimento E., Dos Santos A., et al. Adverse effects of plant food supplements and botanical preparations: a systematic review with 12. critical evaluation of causality. Br J Clin Pharmacol. 2015; 79( 4): 578-92. DOI: https://doi.org/10.1111/bcp.12519 13.
5. EFSA Scientific Cooperation (ESCO) Working Group on Botanicals and Botanical Preparations. Advice on the EFSA guidance document for the safety assessment of botanicals and botanical preparations intended for use as food supplements, based
on real case studies. EFSA J. 2009; 7 (9): 280. DOI: https://doi. 14. org/10.2903/j.efsa.2009.280
6. EFSA SC (EFSA Scientific Committee), 2014. Scientific Opinion on a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for the safety assessment of botanicals and botanical preparations. EFSA J. 2014; 15. 12 (3): 3593. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2014.3593
7. Maisons-Alfort ANSES Opinion, Request No. 2012-SA-0200. 16. OPINION of the French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safetyon the risks associated with the presence in food supplements of p-synephrine or ingredients obtained 17. from Citrus spp. fruits containing this substance. 2014: 46 p. URL: https://www.anses.fr/en/system/files/NUT2012sa0200EN.pdf
Stewart I., Newhall W.F., Edwads G.L. The isolation and identification of l-synephrine in leaves and fruit of Citrus. J Biol Chem. 1964; 239 (3): 930-2. DOI: https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51679-3
Pellati F., Cannazza G., Benvenuti S. Study on the racemization of synephrine by off-column chiral high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 2010; 1217 (21): 3503-10. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.chroma.2010.03.026.
Avula B., Upparapalli S.K., Navarrete A., Khan I.A. Simultaneous quantification of adrenergic amines and flavonoids in C. aurantium, various Citrus species, and dietary supplements by liquid chroma-tography. J AOAC Int. 2005; 88 (6): 1593-606. BfR Opinion No. 004/2013. Health assessment of sports and weight loss products containing synephrine and caffeine. 2012: 29 p. Food Standards Australia New Zealand (FSANZ). Risk assessment of oxedrine in foods intended to promote weight loss. 2015: 18 p. Arbo M.D., Larentis E.R., Linck V.M., Aboy A.L., Pimentel A.L., Henriques A.T., et al. Concentrations of p-synephrine in fruits and leaves of Citrus species (Rutaceae) and the acute toxicity testing of Citrus aurantium extract and p-synephrine. Food Chem Toxicol. 2008; 46 (8): 2770-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2008.04.037 Stohs S.J., Preuss H.J. Stereochemical and pharmacological differences between naturally occuring p-synephrine and synthetic p-synephrine. J Funct Foods. 2012; 4 (1): 2-5. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jff.2011.09.004
Sawler S. Health Canada Synephrine, Octopamine Caffeine Health Risk Assessment (HRA) Report. 2013: 49 p. Tiesjema B., Jeurissen S.M.F., de Wit L., Mol H., Fragki S., Razen-berg L. Risk assessment of synephrine. RIVM Report 2017-0069. 2017: 54 p. DOI: https://doi.org/10.21945/RIVM-2017-0069 Blumenthal M. Bitter orange peel and synephrine: Part 1 & Part 2. 2005: 28 p. URL: http://abc.herbalgram.org/site/DocServer/Bit-ter_Orange_Peel_and_Synephrine.pdf?docID=221
18. URL: https://rusada.ru/substances/prohibited-list/
19. ESCO report: Advice on the EFSA guidance document for the safety assessment of botanicals and botanical preparations intended for use as food supplements, based on real case studies. EFSA J. 2009; 7 (9): 280. DOI: https://doi.org/10.2903/j. efsa.2009.280; URL: https://www.ncaa.org/sport-science-insti-tute/topics/2020-21-ncaa-banned-substances
20. URL: https://www.nutraingredients.com/Article/2018/03/22/ Dutch-authorities-call-for-legal-limits-on-synephrine-in-food-supplements
21. URL: https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/compliance-actions-and-activities/ warning-letters
22. Costa J.G., Vidovic B., Saraiva N., do Ceu Costa M., Del Favero G., Marko D., et al. Contaminants: a dark side of food supplements? Free Radic Res. 2019; 53 (Suppl 1): 1113-35. DOI: https://doi.org/ 10.1080/10715762.2019.1636045
23. EU-28: Exporting Food Supplements to the European Union. 2017. GAIN Report No. E17004.
24. Pawar R.S., Sagi S., Leontyev D. Analysis of bitter orange dietary supplements for natural or synthetic phenethylamines by LC-MS/MS. Drug Test Anal. 2020; 12: 1241-51. DOI: https://doi. org/10.1002/dta.2871
25. Cohen P.A., Avula B., Venhuis B., Travis J.C., Wang Y.H., Khan I.A. Pharmaceutical doses of the banned stimulant oxilofrine found in dietary supplements sold in the USA. Drug Test Anal. 2017; 9 (1): 135-42. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1976
26. Roman M.C., Betz J.M., Hildreth J. Determination of synephrine in bitter orange raw materials, extracts, and dietary supplements by liquid chromatography with ultraviolet detection: single-laboratory validation. J AOAC Int. 2007; 90 (1): 68-81.
27. Lorenzo C.D., Santos A.D., Colombo F., Moro E., Dell'Agli M., Restani P. Development and validation of HPLC method to measure active amines in plant food supplements containing Citrus aurantium L. Food Control. 2014; 46: 136-42. DOI: https://doi. org/10.1016/J.FOODCONT.2014.05.017
28. Putzbach K., Rimmer C.A., Sharpless K.E., Sander L.C. Determination of Bitter Orange alkaloids in dietary supplements standard reference materials by liquid chromatography with ultraviolet absorbance and fluorescence detection. J Chromatogr A. 2007; 1156 (1-2): 304-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.12.027.
29. Pharmacopoeia of the People's Republic of China 2010 (English edition). 2010.
30. Taiwan Herbal Pharmacopoeia. 2th edition (English version). 2016: 44-5.
31. Sander L.C., Putzbach K., Nelson B.C., Rimmer C.A., Bedner M., Thomas J.B., et al. Certification of standard reference materials containing bitter orange. Anal Bioanal Chem. 2008; 391 (6): 2023-34. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-008-2074-0
32. Schaneberg B.T., Khan I.A. Quantitative and qualitative HPLC analysis of thermogenic weight loss products. Pharmazie. 2004; 59 (11): 819-23.
33. Ohta I., Mizunuma S., Yasuda T., Ohsawa K. Determination of synephrine in oriental pharmaceutical decoctions containing Evo-diae fructus by ion-pair high-performance liquid chromatography. Yakugaku Zasshi. 1994; 114 (1): 33-8 (in Japanese). DOI: https:// doi.org/10.1248/yakushi1947.114.1_33
34. Evans R.L., Siitonen P.H. Determination of caffeine and sym-phatomimetic alkaloids in weight loss supplements by high performance liquid chromatography. J Chromatogr Sci. 2008; 46 (1): 61-7. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/46.1.61
35. Wagner H., Puls S., Barghouti T., Staudinger A., Melchart D. Chromatographic fingerprint analysis of herbal medicines. Volume 5. Thin-Layer and High Performance Liquid Chromatog-raphy of Chinese Drugs. Springer, 2018: 43-4. DOI: https://doi. org/10.1007/978-3-319-67062-1
36. Kim J.H., Kwak B.M., Ahn J.H., Park J.-S. Simultaneous determination of synephrine and N-methyltyramine in orange fruit and juice from Korean market by UPLC-FLD. Korean J Food Sci Technol. 2014; 46 (3): 276-82. DOI: http://dx.doi.org/10.9721/ KJFST.2014.46.3.276
37. Pryce K., Samuel D., Lagares E., Myrthil M., Bess F., Harris A., et al. Presence of octopamine and an octopamine receptor in Crassostrea virginica. In vivo (Brooklyn). 2015; 37 (1): 16-24.
38. Li Q., Huang C., Huang Y. Sensitive determination of synephrine by flow-injection chemiluminescence. Luminescence. 2006; 21 (1): 43-8. DOI: https://doi.org/10.1002/bio.881
39. Liu Y., Xu F., Zhang Z., Yang C., Song R., Tian Y. Analysis of synephrin,e in da-cheng-qi decoction by HPLC employing precol-umn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chro-matogr Sci. 2009; 47 (10): 925-30. DOI: https://doi.org/10.1093/ chromsci/47.10.925
40. Kobayashi Y., Yato M., Ito R., Saito K. Enantioselective determination of synephrine in health food products by liquid chromatog-raphy/time-of-flight mass spectrometry. Chromatography. 2020; 41: 39-44. DOI: https://doi.org/10.15583/jpchrom.2019.024
41. Tang Q., Zhang R., Zhou J., Zhao K., Lu Y., Zheng Y., et al. The levels of bioactive ingredients in Citrus aurantium L. at different harvest periods and antioxidant effects on H2O2-induced RIN-m5F cells. J Sci Food Agric. 2021; 101 (4): 1479-90. DOI: https:// doi.org/10.1002/jsfa.10761
42. Bai Y., Zheng Y., Pang W., Peng W., Wu H., Yao H., et al. Identification and comparison of constituents of Aurantii fructus and Aurantii fructus immaturus by UFLC-DAD-triple TOF-MS/MS. Molecules. 2018; 23 (4): 803. DOI: https://doi.org/10.3390/mol-ecules23040803
43. Shawky E. Determination of synephrine and octopamine in bitter orange peel by HPTLC with densitometry. J Chromatogr Sci. 2014; 52 (8): 899-904. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/bmt113
44. Avula B., Upparapalli S.K., Khan I.A. Enantiomeric separation of adrenergic amines in Citrus species, related genera and dietary supplements by capillary electrophoresis. Chromatograph-ia. 2005; 62 (3): 151-7. DOI: https://doi.org/10.1365/s10337-005-0598-4
45. Yi Y.N., Cheng X.M., Liu L.A., Hu G.Y., Wang Z.T., Deng Y.D., et al. Simultaneous determination of synephrine, arecoline, and norisoboldine in Chinese patent medicine Si-Mo-Tang oral liquid preparation by strong cation exchange high performance liquid chromatography. Pharm Biol. 2012; 50 (7): 832-8 DOI: https://doi. org/10.3109/13880209.2011.637505
46. Zhang Y., Jiao B. Simultaneous determination of six protoalka-loids in Chinese local varieties of loose-skin mandarins and sweet oranges by strong cation exchange-high performance liquid chro-matography. Food Anal Methods. 2019; 12: 677-86. DOI: https:// doi.org/10.1007/s12161-018-1401-0
47. URL: https://www.sielc.com/Application-HPLC-Separation-of-Octopamine-and-Synephrine-on-Primesep-200-column.html
48. Tanaka S., Sekiguchi M., Yamamoto A., Aizawa S.I., Sato K., Taga A., et al. Separation of synephrine enantiomers in citrus fruits by a reversed phase HPLC after chiral precolumn derivatiza-tion. Anal Sci. 2019; 35 (4): 407-12. DOI: https://doi.org/10.2116/ analsci.18P441
