CC BY
397
УДК 579.25 579.262
СИМБИОТИЧЕСКИЕ ГЕНЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИИ И ВЛИЯНИЕ ИХ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА НА ВИДОВОЙ СОСТАВ МИКРОСИМБИОНТОВ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ
© Е. С. Иванова1, Ан. Х. Баймиев1, Р. И. Ибрагимов2*, Ал. Х. Баймиев1
1 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 60 88.
E-mail: [email protected] 2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 229 96 71.
E-mail: [email protected]
Наличие у клубеньковых бактерий симбиотических генов определяет их возможность образовывать с бобовыми растениями азотфиксирующий симбиоз. В статье описана структурно-функциональная организация основных симбиотических генов и влияние их горизонтального переноса на видовое разнообразие микросимбионтов у бобовых растений.
Ключевые слова: ризобии, клубеньковые бактерии, бобовые растения, симбиоз, симбиотические гены, горизонтальный перенос генов.
Изучение взаимодействий между растениями и микроорганизмами - одно из увлекательных и бурно развивающихся направлений современной биологии. Эти взаимодействия играют исключительно важную роль в жизни растений, обеспечивая их минеральное питание, защиту от патогенов и вредителей, а также адаптацию к стрессам и регуляцию развития [1].
Исследование микробно-растительных взаимодействий восходит к трудам Антона де Барии, сформулировавшего в 1879 году концепцию симбиоза [1]. Согласно данной концепции, симбиоз - длительное сосуществование неродственных организмов, в ходе которого осуществляется широкий спектр взаимовыгодных (мутуалистических) и паразитарных (антагонистических) взаимодействий [2].
Обладая способностью полностью обеспечивать себя углеродом и энергией, получаемыми в процессе фотосинтеза, большинство растений испытывает недостаток во многих других элементах минерального питания, в первую очередь - в азоте и фосфоре [3]. Дело в том, что растения «купаются» в азоте, имеющимся в окружающей их среде: атмосфера состоит на 78% из азота, а органические вещества почвы (гумус, лигнин, хитин) содержат много связанного азота. Однако этот элемент недоступен для растений, так как у них нет ферментных систем для его фиксации, как и для деструкции почвенной органики. А недостаточная обеспеченность азотом - один из основных факторов, лимитирующих развитие растений [1]. Поэтому симбиозы с микроорганизмами, фиксирующими азот (ри-зобии, актиномицеты, цианобактерии, эндофитные и ризосферные бактерии) или оптимизирующими получение питательных веществ из почвы (микоризные грибы), характерны для подавляющего большинства растений [3].
Огромное практическое и экологическое значение представляет симбиоз бобовых растений с клубеньковыми бактериями (ризобиями), который
является одной из наиболее эффективных систем биологической фиксации атмосферного азота. В данном взаимодействии достигается сопряжение двух глобальных биохимических процессов - азот-фиксации и фотосинтеза, благодаря чему нормализуется азотно-углеродный баланс растительного организма. При симбиозе микробы экспортируют продукты азотфиксации в клетки хозяина, которые предоставляет партнерам весь комплекс элементов питания, в первую очередь соединения углерода [1]. Благодаря деятельности клубеньковых бактерий часть азотистых соединений из корней бобовых растений диффундирует в почву, обогащая ее азотом. Посев бобовых растений ведет к повышению почвенного плодородия. Гектар бобовых растений в симбиозе с бактериями может перевести в связанное состояние от 100 до 400 кг азота за год. Значение этого трудно переоценить, если учесть, что азотные удобрения наиболее дорогостоящи, а в почве соединения азота содержатся в небольших количествах.
Становление эффективного азотфиксирующе-го симбиоза между бобовыми растениями и ризо-биями требует наличия у микросимбионтов симбиотических генов (sym генов), включающих в себя ответственные за фиксацию азота nif гены, которые кодируют синтез и регуляцию фермента нитрогена-зы; nod гены, кодирующие синтез Nod-факторов, отвечающих за инициацию и специфичность образуемого симбиоза; а также fix-гены, которые также необходимы для азотфиксации, часто сцепленные с nif генами, но не гомологичные с ними.
Гены клубенькообразования (nod гены) кодируют синтез липо-хито-олигосахаридных Nod-факторов - сигналов, узнаваемых растениями и вызывающих развитие симбиотических тканей и субклеточных компартментов (инфекционные нити, симбиосомы), которые содержат бактериальные клетки [4-7]. Nod-факторы совместно с экзополисахаридами инициируют у бобового растения-
* автор, ответственный за переписку
хозяина многоступенчатый процесс формирования клубеньков.
Клубеньковые примордии, возникающие у бобовых под действием Коё-факторов, вырабатывают сигналы, поступающие в листья и приводящие к формированию авторегуляторного ответа. Он ограничивает число формируемых растением клубеньков, ограждая растение от перерасхода энергии и определяя формирование симбиоза только в условиях недостатка азота [2].
Некоторые гены (nodA, nodB, nodQ присутствуют у ризобий в одной копии, тогда как другие (nodM (gfmS)y nodP, nodQ, nodT) — в нескольких копиях. В ряде случае гены клубенькообразования формируют кластеры, состоящие из нескольких оперонов, многие из которых консервативны у разных ризобий [8].
Гены nif кодируют структуру белков нитроге-назы - фермента, восстанавливающего молекулярный азот до аммиака, ее кофакторов и транскрипционных регуляторов [9].
У всех известных азотфиксаторов нитрогеназа состоит из белков трех типов (а, р и у) и двух кофакторов: молибден-железосодержащего (МоБе-кофактора) и железосодержащего (Бе-кофактора). Эти компоненты организованны в две субъединицы: большую - динитрогеназу (а2, р2), в состав которой входит МоБе-кофактор, и малую - редук-тазу динитрогеназы (у2), содержащую Бе-кофактор. Восстановление молекул азота происходит при взаимодействии с динитрогеназой, которая получает необходимые для этого активированные электроны от редуктазы динитрогеназы [1].
У некоторых ризобий выявлены множественные копии гена пі/Н: К- еїіі имеет 3 идентичные копии, тогда как копии пі/Н1 и пі/Н2 у АіоткіїоЬіит caulтodans различаются по 6 нуклеотидам. Все эти копии кодируют функционально активные белки, участвующие в азотфиксации, а их высокое сходство или даже идентичность говорит о том, что мно-гокопийность гена пі/Н является результатом дупликаций, а не горизонтального переноса. Эта мно-го-копийность может играть роль в адаптации ри-зобий к фиксации азота в различных экологических условиях. Нельзя исключить и того, что некоторые из копий пі/Н могут выполнять редуктазные функции в биохимических процессах, не связанных с азотфиксацией [10].
У ризобий пі/ - гены разделены на несколько кластеров, что отражает сложную регуляцию симбиотической азотфиксации, осуществляемую не только внешними факторами, но и растением-хозяином. Большинство т/-генов организовано в опероны, состав которых варьирует у разных видов.
Процесс восстановления азота до аммиака требует затраты большого количества энергии. Это связано с чрезвычайной стабильностью тройной связи в молекуле азота - одной из самых прочных химических связей. Наиболее эффективными источниками энергии, способными обеспечить высо-
кую интенсивность биологической азотфиксации, являются окислительное фосфорилирование и фотосинтез. Эти процессы сопряжены с присутствием кислорода, который поглощается при дыхании или выделяется при фотолизе воды. Однако нитрогеназа очень чувствительна к кислороду: она необратимо инактивируется даже при небольших его концентрациях (около 100 нмоль/л) [1]. Поэтому в клубеньках присутствует особый железосодержащий белок - леггемоглобин, который аналогичен гемоглобину крови человека и животных по строению и функции. Леггемоглобин связывает кисло -род и, тем самым создает условия для работы нит-рогеназы [11].
fix гены ответственны за специфичную для симбиоза регуляцию ^-фиксации. Гены fixL, fixJ, fixK имеют гомологов у свободноживущих бактерий, однако эти гомологи не связаны с контролем азотфиксации. Гены, гомологичные fixLJ, кодируют двухкомпонентные регуляторные системы (FixL -мембранный белок, обладающий киназной и фос-фатазной активностями; FixJ - цитоплазматический фосфорилируемый регулятор транскрипции). Активация этой системы происходит лишь в макроаэ-рофильных условиях, поскольку FixL является гемм содержащим сенсором кислорода. Гомологи FixK - это транскрипционные регуляторы, относящиеся к семейству Crp - Fnr. У ризобий система регуляции азотфиксации помимо структурных генов нитрогеназы включает гены dctABD (кодируют транспорт в бактериоиды дикарбоновых кислот, являющихся основным источником энергии для азотфиксации), fixNOPQ fixGHIS (кодируют синтез бактериоидной цитохромоксидазы cbb3, обеспечивающей транспорт электронов в дыхательных цепях бактериоидов) и гены биосинтеза гема [12].
Геном ризобий обычно содержит кольцевую хромосому и один или несколько крупных плазмид размерами от 100 тпн до более 2Мпн. Sym гены локализованы либо в специфических симбиотических геномных компартментах в составе крупных плазмид, обозначаемых pSym (симбиотические плазмиды), либо в пределах хромосомных островков, также называемых островками симбиоза. У быстрорастущих клубеньковых бактерий рода Rhizobium и Ensifer (Sinorhizobium) Sym-гены находятся на pSym-плазмидах, тогда как у медленнорастущих бактерий родов Azorhizobium, Bradyrhizobium и Mesorhizobium эти гены расположены на хромосомах. За счет плаз-мидной локализации или же за счет ограничения симбиотического островка IS-подобными элементами, симбиотические гены клубеньковых бактерий часто бывают вовлечены в процессы горизонтального переноса генов (ГПГ) как между штаммами внутри одного вида, так и между штаммами разных видов, родов, семейств и и даже еще более высших таксонов. Данный процесс может привести к появлению штаммов клубеньковых бактерий, различающихся по азотфиксирующей эффективности и по хозяйской специфичности.
Интересно, что при переносе Sym генов между близкородственными штаммами специфичность к хозяину проявляется наиболее четко: реципиент может приобретать способность формировать полностью развитые, азотфиксирующие клубеньки с растениями - хозяевами донора. При этом исходная специфичность реципиента либо утрачивается, либо сохраняется. В то время как при переносе Sym генов между неродственными видами ризобий специфичность проявляется лишь частично (на уровне образования неактивных клубеньков, часто имеющих аномальную структуру) либо вовсе не проявляется. При этом исходная специфичность часто сохраняется [1].
Возможность ГПГ показана в работах многих авторов. Одним из первых в этом плане была работа Саливана с соавторами, в которой они показали, что в Новой Зеландии аборигенные штаммы Mezorhizobium loti, не способные нодулировать растения Lotus corniculatus L. после 7 лет выращивания данной культуры с исскуственной инокуляцией специфичным штаммом M.loti (ICMP 3153) также стали способны инокулировать данное растение. Было обнаружено, что все выделенное из клубеньков штаммы как аборигенные, так и штамм ICMP 3153 имеют идентичные симбиотические гены. На основании этого, авторы делают вывод, что аборигенные штаммы получили симбиотические гены посредством ГПГ от штамма ICMP 3153, что изменило их специфичность [13-17].
Сходный процесс образования новых симбионтов путем ГПГ выявлен при интродукции Biserrula pelecinus L. (Fabaceae) из Европы в Австралию, где в течение шести лет сформировалась местная популяция новых симбионтов, содержащих хромосомные маркеры авирулентных местных мезоризобий в сочетании с sym-генами («симбиотическими» островками) интродуцированного мезоризобиального штамма WSM 1271 [18]. При интродукции сои из США в Южную Америку (Парагвай), сопровождавшуюся внесением производственных штаммов Bradyrhizobium japonicum, происходил перенос их sym-генов в разнообразные местные ризобии, как быстро- так и медленнорастущие, с широким спектром хозяев, а также в агробактерии [19].
Исследования, проведенные в Китае на астрагале, показали, что способность формировать клубеньки в ответ на заражение большого спектра ри-зобий, относящихся к родам Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium и Bradyrhizobium обеспечивается горизонтальным переносом симбиотических генов, благодаря чему появляются новые виды ризобий, которые адаптированы к различным условиям окружающей среды, а также способные заражать виды Астрагала [16].
При исследовании клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых, произрастающих на территории Республики Башкортостан нами также были выявлены штаммы, которые, вероятно, также получили симбиотические гены за счет ГПГ. Так, например, у чины весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh. в
клубеньках некоторых растений, произрастающих на кислых почвах, были обнаружены несвойственные для них клубеньковые бактерии Rhizobium tropici. Однако при анализе последовательностей симбиотических генов данных микроорганизмов было выявлено, что они имеют большую гомологию с аналогичными генами R. leguminosarum bv. viceae, обычных симбионтов данного вида растения, нежели R. tropici. Исходя из этого, был сделан вывод, что R. tropici приобрел способность вступать в симбиоз с чиной весенней за счет ГПГ симбиотических генов [20]. Подобное явление также было обнаружено и у некоторых симбионтов чины болотной Lathyrus palustris L. у которой в клубеньках были обнаружены Agrobacterium sp., содержащие симбиотические гены R. leguminosarum bv. viceae привнесенные в геном Agrobacterium sp. посредством ГПГ.
В этом плане интересны также клубеньковые бактерии рода Phyllobacterium. Данные микроорганизмы впервые были описаны Кнозелем как бактерии, образующие клубенек подобные структуры на листьях некоторых тропических растений [21]. В настоящее время данные бактерии обнаружены в клубеньках у многих бобовых, таких как Trifolium pratense, Argyrolobium uniflorum, Astragalus algerianus, Lathyrus numidicus, Oxytropis sp., Genista saharae и др. [22-25]. Нами Phyllobacterium были обнаружены в клубеньках эспарцета песчаного Onobrychis arenaria [26], караганы древовидной Caragana arborescens [27], чины Гмелина Lathyrus gmelinii [20], а также в клубеньках кустарниковых видов бобовых: ракитника русского Chamaecytisus ruthenicus, караганы кустарниковой Caragana frutex и дрока красильного Genista tinctoria. Но, тем не менее, симбиотические гены были обнаружены только у штаммов из клубеньков ракитника русского, по нуклеотидной последовательности сходные с аналогичными последовательностям Bradyrhizobium, и у штаммов из клубеньков чины Гмелина, содержащие симбиотические гены R. leguminosarum bv. viceae. У остальных штаммов обнаружить sym гены не удалось. Видимо данные клубеньковые бактерии способны вступать в симбиоз с различными видами бобовых растений в зависимости от того, какие симбиотические гены они содержат, а также, по мнению некоторых исследователей, попадать в клубеньки с другими ризобиями, и по сути представляют из себя оппортунистические микроорганизмы.
Несомненно, именно наличие sym генов делает свободноживущие сапрофитные почвенные микроорганизмы симбиотическими партнерами бобовых растений. В основном это а-протеобактерии, относящиеся к семейству Rhizobiaceae. В некоторых исключительных случаях симбиотические гены, попадая в клетки других бактерий, не родственных Rhizobiaceae также наделяют их способностью образовывать клубеньки у бобовых растений. Примерами данного явления могут послужить обнаруженные в клубеньках некоторых тропических ви-
дов бобовых представители ß-группы протеобакте-рий [28, 29]. Но такие случаи не многочисленны, и в большинстве своем симбиозы с подобными микроорганизмами малоэффективны. В основном такие бактерии служат в качестве «депо» для sim генов, которые когда то перейдут в более подходящие бактериальные клетки, придав тем самым им способность образовать эффективный азотфикси-рующий симбиоз. Таким образом за счет ГПГ происходит постоянное изменение разнообразия способных к симбиозу с бобовыми микроорганизмов, что является одним из механизмов приспособления, когда нет необходимости поддерживать симбиотические гены всем ризобиям, что энергетически очень выгодно, но оставаясь, тем не менее, потенциальными донорами данных генов и соответственно потенциальными микросимбионтами бобовых растений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тихонович И. А., Проворов Н. А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та. 2009. 210с.
2. Тихонович И. А., Проворов Н. А. Принципы селекции растений на взаимодействие с симбиотическими микроорганизмами // Вестник ВОГиС. 2005. Том 9. №3. С. 295-305.
3. Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н.,Тихонович И. А., Ходжайова Л. Т., Шишкова С. О. Генетика развития растений. Под ред. С. Г. Инге-Вечтомова. СПб.: Наука. 2000. 539 с.
4. Овцына А. О., Тихонович И. А. Структура, функции и возможность практического применения сигнальных молекул, инициирующих развитие бобово-ризобиального симбиоза. // Экологич. Генетика. 2004. Т.2. №3. С. 14.
5. Brewin N.J. Plant cell wall remodeling in the Rhizobium-legume symbiosis. // Crit. Rev. Plant. Sci. 2004. V. 23. P. 1-24.
6. Hirsch A. M., LaRue T. A. Is the Legume Nodule a Modified Root or Stem or an Organ sui generis? // Crit. Rev. Plant Sci. 1997. V.16. P. 361-392.
7. Ovtsyna A. O., Staehelin C. Bacterial signals required for the Rhizobium-legume symbiosis // Recent Res. Develop. Microbiol. 2005. V.7. P. 631-648.
8. Жуков В. А., Штарк О. Ю., Борисов А. Ю., Тихонович И. А. Молекулярно-генетические механизмы контроля растением ранних стадий развития взаимовыгодных (мутуа-листических) симбиозов бобовых. // Генетика. 2009. Т.45. №11. С. 1449-1460.
9. Проворов Н. А., Воробьев Н. И. Роль горизонтального переноса генов в эволюции клубеньковых бактерий, направляемой растением-хозяином. // Успехи современной биологии. 2010. Т. 130. №4. С. 336-345.
10. Spaink H. P., Kondorosi A., Hooykaas P. J. J. The Rhizobiaceae. Kluwer Academic Publishers. Pordrecht. The Netherlands. 1998. 566 p.
11. Сидорова К. К., Шумный В. К., Власова Е. Ю., Гляненко М. Н., Мищенко Т. М., Майстренко Г. Г. Симбиогентика и селекция макросимбионта на повышение азотфиксации на примере гороха (Pisum Sativum L.) // Вестник ВОГиС. 2010. Т.14. №2. С. 357-374.
12. Проворов Н. А., Воробьев Н. И. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты. // Генетика. 2000. Т.36. №12. С. 1573-1587.
13. Andam C. P., Parker M. A. Novel Alphaproteobacterial Root Nodule Symbiont Associated with Lupinus texensi. // Appl Environ. Microbiol. 2007. V.73. №17. P. 5687-5691.
14. Andam C. P., Mondo S. J., Parker M. A. Monophyly of nodA and nifH genes across Texan and Costa Rican populations of Cupriavidus nodule symbionts. // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V.73. №14. P. 4684-4690.
15. Barcellos F. G., Menna P., da Silva Batista J. S., Hungria M. Evidence of Horizontal Transfer of Symbiotic Genes from a Bradyrhizobium japonicum Inoculant Strain to Indigenous Diazotrophs Sinorhizobium (Ensifer) fredii and Bradyrhizobium elkanii in a Brazilian Savannah Soil. // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V.73. №8. P. 2635-2643.
16. Zhao C. T., Wang E. T., Chen W. F., Chen W. X. Diverse genomic species and evidences of symbioticgene lateral transfer detectedamong the rhizobia associated with Astragalus species grown in the temperate regions of China // FEMS Microbial Lett. 2008. V.286. P. 263-273.
17. Sullivan J. T., Patrick H. N., Lowther W. L., Scott D. B., Ronson C. W. Nodulating strains of Rhizobium loti arise through chromosomal symbiotic gene transfer in the environment. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V.92. P. 8985-8989.
18. Nandasena K. G., O’Hara G. W., Tiwari R. P., Howieson J. G. Rapid In Situ Evolution of Nodulating Strains for Biserrula pelecinus L.through Lateral Transfer of a Symbiosis Island from the Original Mesorhizobial Inoculant. // Appl Environ Microbiol. 2006. V.72. №11. P. 7365-7367.
19. Chen L. A., Figueredo A., Pedrosa F. O., Hungria M. Genetic characterization of soybean rhizobia in Paraguay. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P. 5099-5103.
20. Баймиев Ан. Х., Птицын К. Г., Мулдашев А. А., Баймиев Ал. Х. // Экол. генет. 2011. №2. С. 3-8.
21. Knosel D. H. Prüfung von bakterien auf Fähigkeit zur Stembildung. // Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. 1962. V.116. P. 79-100 (in German).
22. Valverde A., Velazquez E., Fernandez-Santos F., Vizcaino N., Rivas R., Mateos P. F., Eustoquio Molina M., Igual J. M. and Willems A. Phyllobacterium trifolii sp. nov., nodulating Trifolium and Lupinus in Spanish soils. // Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2005. V.55. P. 1985-1989.
23. Mantelin S., Fischer-Le Saux M., Zakhia F., Bena G., Bonneau S., Jeder H., Philippe de Lajudie and Cleyet-Marel J. S. Emended description of the genus Phyllobacterium and description of four novel species associated with plant roots: Phyllobacterium bourgognense sp. nov., Phyllobacterium ifriqiyense sp. nov., Phyllobacterium leguminum sp. nov. and Phyllobacterium brassicacearum sp. nov. // Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2006. V.56. P. 827-839.
24. Kan F. L., Chen Z. Y., Wang E. T., Tian C. F., Sui X. H., Chen W. X. Characterization of symbiotic and endophytic bacteria isolated from root nodules of herbaceous legumes grown in Qinghai-Tibet plateau and in other zones of China. // Archives of Microbiology. 2007. V.188. P. 103-115
25. Mahdhi M., Nzoue A., Gueye F., Merabet C., P. de Lajudie and Mars M. Phenotypic and genotypic diversity of Genista saharae microsymbionts from the infra-arid region of Tunisia. // Letters in Applied Microbiology. 2007. V.45. P. 604-609
26. Баймиев Ал. Х., Баймиев Ан. Х., Губайдуллин И. И., и др. В клубеньках эспарцета песчаного обнаружены бактерии, близкие по гену 16S рРНК к Phyllobacterium trifolii // Генетика. 2007. Т. 43. №5. С. 716-719.
27. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Баймиев Ал.Х. Влияние интродукции караганы древовидной на состав ее клубеньковых бактерий // Микробиология. 2010. Т.79. №1. С.123-128.
28. Chen W. M., Moulin L., Bontemps C., Vandamme P., Bena G., Boivin-Masson C. Legume symbiotic nitrogen fixation by beta-proteobacteria is widespread in nature. // J. Bacteriol. 2003. V. 185 №24. P. 7266-7272.
29. Liu X. Y., Wu W., Wang E. T., Zhang B., Macdermott J., Chen W. X. Phylogenetic relationships and diversity of ß-rhizobia associated with Mimosa species grown in Sishuangbanna, China. // Int J Syst Evol Microbiol. 2011. V. 61. P. 334-342.
Поступила в редакцию 04.09.2011 г.
