CC BY
13
сч сч О сч
DOI: 10.17650/2313-805X-2022-9-4-112-116
(«D]
Сигнальный путь микроРНК-484/А№ в регуляции § чувствительности клеток рака молочной железы к противоопухолевым препаратам
>-
о
и
о
ОС <
о ж.
ю
< >
о
О.Е. Андреева, Д.В. Сорокин, А.М. Щербаков, Ю.Ю. Щеголев, М.В. Гудкова, М.А. Красильников
Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115522 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Михаил Александрович Красильников [email protected]
Развитие приобретенной резистентности злокачественных опухолей к препаратам направленного действия, таким как таргетные и гормональные препараты, сопряжено с перестройкой внутриклеточной сигнальной сети и актива-< цией незаблокированных путей передачи ростового сигнала. Непосредственное участие в развитии и поддержании
подобных изменений принимают эпигенетические регуляторы, в частности некодирующие микроРНК, контролиру-s ющие уровень экспрессии конкретных сигнальных белков. Ранее мы показали, что развитие резистентности клеток
s рака молочной железы к ингибиторам mTOR (mammalian target of rapamycin) и блокаторам эстрогенового сигналин-
О га сопровождается конститутивной активацией протеинкиназы Akt - основного антиапоптотического белка клеток.
^ Цель настоящей работы - исследование роли отдельных микроРНК в регуляции экспрессии Akt и формировании
ьй резистентного фенотипа клеток рака молочной железы.
^ Мы показали, что повышение активности протеинкиназы Akt в сублиниях MCF-7, резистентных к тамоксифену
или рапамицину, ассоциировано со снижением уровня микроРНК-484 - одного из супрессоров Akt. Трансфекция О в клетки MCF-7 микроРНК-484 не влияет на активность эстрогенового сигналинга, но приводит к выраженному
^ снижению экспрессии Akt и сопровождается повышением чувствительноси клеток к тамоксифену и рапамицину.
ос Полученные данные свидетельствуют об участии сигнального пути микроРНК-484/Akt в сенсибилизации клеток
рака молочной железы к действию таргетных и гормональных препаратов, что позволяет рассматривать микроРНК-484 2 в качестве перспективного кандидата для разработки на его основе новых противоопухолевых соединений.
О Ключевые слова: рак молочной железы, микроРНК, протеинкиназа Akt, тамоксифен, рапамицин, резистентность S
s Для цитирования: Андреева O.E., Сорокин Д.В., Щербаков А.М. и др. Сигнальный путь микроРНК-484/Akt в регу-
X ляции чувствительности клеток рака молочной железы к противоопухолевым препаратам. Успехи молекулярной онкологии 2022;9(4):112-6. DOI: 10.17650/2313-805X-2022-9-4-112-116
о >
MicroRNA-484/Akt axis in the regulation of breast cancer cells sensitivity to antitumor drugs
O.E. Andreeva, D. V. Sorokin, A.M. Scherbakov, Y.Y. Shchegolev, M. V. Gudkova, M.A. Krasil'nikov
Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115522, Russia
Contacts: Mikhail Aleksandrovich Krasil'nikov [email protected]
The development of acquired resistance of malignant tumors to specific drugs, such as target and hormonal drugs, is usually associated with a rearrangement of the intracellular signaling network and activation of unblocked growth pathways. Epigenetic regulators, in particular, non-coding miRNAs that control the level of expression of specific signaling proteins, are directly involved in the development and maintenance of such changes. We have previously shown that the development of resistance of breast cancer cells to mTOR (mammalian target of rapamycin) inhibitors and hormonal drugs is accompanied by constitutive activation of protein kinase Akt, the key anti-apoptotic protein. Aim. To study the role of microRNAs in the regulation of Akt expression and the formation of a resistant phenotype of breast cancer cells.
We have shown that Akt activation in the tamoxifen- or rapamycin-resistant MCF-7 sublines is associated with a decrease in the level of miRNA-484, one of the Akt suppressors. Transfection of microRNA-484 into MCF-7 cells does not affect the activity of estrogen signaling, but leads to a marked decrease in Akt expression and is accompanied by an increase in cell sensitivity to tamoxifen and rapamycin. The obtained data demonstrate the involvement of the miRNA-484/Akt axis
in the breast cancer cells' sensitization to target and hormonal drugs, which allows us to consider miRNA-484 as a potential candidate for drug development to cure resistant cancers.
Keywords: breast cancer, microRNA, protein kinase Akt, tamoxifen, rapamycin, resistance
For citation: Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2022;9(4):112-6. (In Russ.). DOI: 10.17650/ 2313-805X-2022-9-4-112-116
ВВЕДЕНИЕ
Как известно, развитие резистентности опухолевых клеток к препаратам направленного действия, таким как таргетные соединения или гормональные препараты, сопряжено с перестройкой сигнальной сети и активацией параллельных, незаблокированных, сигнальных путей. Ранее в эспериментах на культивируемых in vitro клетках рака молочной железы (РМЖ) MCF-7 мы показали, что развитие резистентности к ингибиторам mTOR (mammalian target of rapamycin) (рапамицину, метформину) и блокаторам эстрогено-вого сигналинга (антиэстрогену тамоксифену) в обоих случаях сопровождается конститутивной активацией протеинкиназы Akt — основного антиапоптотическо-го белка [1—3].
Одними из ключевых эпигенетических регуляторов в клетках являются некодирующие микроРНК, изменение содержания которых может во многом определять уровень экспрессии конкретных сигнальных белков. Идентифицированы микроРНК, ответственные за регуляцию экспрессии/активности проте-инкиназы Akt, среди которых центральное место занимает микроРНК-484, активно экспрессируемая в клетках РМЖ [4-7]. МикроРНК-484 длиной 22 нук-леотида локализована в промоторной области гена MARF1 (meiosis regulator and MRNA stability factor 1) на хромосоме 16p13.11 в человеческом геноме. Физиологические функции miR-484 у млекопитающих многогранны и включают влияние на стресс эндоплазмати-ческого ретикулума, окислительный стресс, воспаление, пролиферацию клеток и апоптоз [8].
Целью настоящей работы явилось дальнейшее изучение роли протеинкиназы Akt в формировании и поддержании резистентного фенотипа клеток и исследование влияния микроРНК-484 на экспрессию протеинкиназы Akt и чувствительность клеток РМЖ к противоопухолевым препаратам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводились на культивируемых in vitro клетках РМЖ MCF-7 (ATCC HTB-22™). В работе использовались методы, представленные ниже.
Культивирование клеток. Клетки РМЖ человека линии MCF-7 культивировали в стандартной среде DMEM (ООО «ПанЭко», Россия), содержавшей 4,5 г/л глюкозы, 10 % эмбриональной сыворотки телят (FBS HyClone, США) и гентамицин (50 ед./мл) (ООО «ПанЭко», Россия) при 37 °С и 5 % СО2. Культивирование клеток выполняли в инкубаторе NU-5840E (NuAir,
США). Тамоксифен-резистентная сублиния MCF-7 была получена при длительном культивировании родительских клеток с тамоксифеном, как описано ранее [9]. При анализе скорости роста количество клеток определяли с использованием МТТ-теста, основанного на восстановлении живыми клетками реагента МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2) — 2,5-дифенилтетразол бромида) в кристаллы формазана (нерастворимые в куль-туральных средах).
Анализ микроРНК. Подготовка библиотек и сик-венс проводились ЗАО «Геноаналитика» (Россия). Экстракция микроРНК выполнялась с помощью наборов PureLink RNA Micro Kit (#12183-016, Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Подготовка библиотек проводилась с помощью наборов NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7330S).
Конструкции микроРНК. В работе использовались следующие конструкции микроРНК (ООО «Синтол», Россия): 1) для проведения контрольной трансфек-ции — микроРНК scrambled (случайная последовательность): scr. miR forward 5'-P-UUCUCCGAACGUGU-CACGU-OH-3', scr. miR reverse 5'-P-ACGUGACACGU UCGGAGAA-OH-3'; 2) микроРНК-484: hsa-miR-484 forward 5'-P-UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU-OH-3', hsa-miR-484 reverse 5'-P-CCCGGGGGGUGACCCUG GCU-OH-3. РНК растворяли в буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA) в концентрации 100 мкМ и проводили отжиг по стандартной методике. Трансфек-цию РНК в конечной концентрации 50 нМ выполняли с использованием реагента Lipofectamine 2000 PRO (Thermo Fisher Scientific) по методике производителя.
Репортерный анализ. Для определения транскрипционной активности рецептора эстрогенов проводили трансфекцию клеток плазмидой, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем промотора с эстроген-респонсивным элементом, любезно предоставленной Dr. George Reid [10]. Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применяли котрансфекцию клеток плазмидой, содержавшей ген ß-галактозидазы. Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу (Promega, США) на люминометре Tecan Infinite М200 Pro (США). Расчет активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах).
Иммуноблоттинг. Клетки на стадии формирования 80 % монослоя дважды промывали на чашках (60 мм;
сч сч о сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж.
ю
< >
а
<
о m
а.
в;
£ m
о ж.
U >
сч сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж.
ю
< >
а
<
о m
а. те
m
о ж.
и >
Corning, США) 2 мл фосфатного буфера. Для получения тотального клеточного экстракта к образцам добавляли по 130 мкл буфера следующего состава: 50 мМ Трис-HCl pH 7,4, 1 % Igepal CA-630, 150 мМ NaCl, 1 мМ тетраацетата этилендиамина, 1 мМ дитиотреитола, 1 мкг/мл апротинина, лейпептина и пепстатина, 1 мМ фторида натрия и ортованадата натрия (Мегск, США). Образцы клеточных экстрактов центрифугировали (10 000 g, 10 мин, 4 °C, центрифуга Eppendorf 5417R) и проводили стандартный электрофорез и иммуно-блоттинг, как описано ранее [1]. В цитозольных экстрактах исследовали содержание рецептора эстрогена a (ERa), Akt, phospho-Akt (Cell Signaling Technology, США). Для контроля эффективности иммуноблоттин-га использовали антитела к a-тубулину (Cell Signaling Technology, США).
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Microsoft Excel. Во всех случаях статистические критерии считали достоверными приp <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ микроРНК в родительких и резистентных клетках MCF-7. При изучении внутриклеточного пула микроРНК было выявлено более 600 вариантов микроРНК, активно экспрессируемых в клетках МСТ-7. Сравнительный анализ профиля микроРНК в клетках МСТ-7 и тамоксифен-резистентных клетках МСТ-7/Т позволил идентифицировать свыше 60 микроРНК, экспрессия которых не менее чем на 50 % снижена в резистентных клетках. Последующий анализ in silico биологической активности идентифицированных ми-кроРНК показал присутствие среди микроРНК, экспрессия которых снижена в резистентных клетках MCF-7/T, микроРНК-484, являющейся супрессором Akt и активно синтезируемой клетками РМЖ. В дальнейших экспериментах по трансфекции в клетки МСТ-7 микроРНК-484 мы продемонстрировали выраженное подавление экспрессии и активности Akt при накоплении в клетках микроРНК-484 (рис. 1).
МикроРНК-484 и эстрогеновый сигналинг. Для исследования возможного влияния микроРНК-484 на гормональный аппарат клеток был проведен анализ экспрессии и активности рецептора эстрогенов в клетках МСТ-7 после трансфекции микроРНК. Как видно из представленных данных, ни экспрессия, ни транскрипционная активность эстрогенового рецептора не снижались в присутствии микроРНК-484, что позволяет исключить непосредственное влияние последней на эстрогеновый сигналинг (рис. 2).
Влияние микроРНК-484 на чувствительность клеток к тамоксифену и рапамицину. Представленные выше данные, а именно: 1) способность микроРНК-484 подавлять экспрессию и активность протеинкиназы Akt и 2) сниженное содержание микроРНК-484, наряду с высокой активностью Akt, в резистентных клетках позволили предположить, что направленное снижение
а-тубулин / a-tubulin
phospho-Akt
Akt
MCF-7/scr MCF-7/mir-484
Рис. 1. Иммуноблоттинг образцов клеток MCF-7после трансфекции микроРНК/scrambled и микроРНК-484. Гибридизация проводилась с антителами к phospho-Akt и Akt, нанесение белков контролировалось по гибридизации с антителами к а-тубулину. Представлены результаты одного из 3 независимых экспериментов
Fig. 1. Immunoblotting of the protein samples from MCF-7 cells transfected with mir/scrambled and mir-484. The hybridization was performed with the antibodies against phospho-Akt and Akt, protein loading was controlled by membrane hybridization with а-tubulin antibodies. The blot represents the results of one of the three similar experiments
активности последней, в том числе через сигнальныи путь микроРНК-484/Akt, может приводить к повышению чувствительности клеток РМЖ к противоопухолевым агентам. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по оценке чувствительности клеток MCF-7 к тамоксифену и рапамицину после трансфекции микроРНК-484. Мы обнаружили, что трансфекция последней в клетки приводит к заметному повышению чувствительности клеток к цитостатическому действию обоих препаратов (рис. 3). Это свидетельствует о непосредственном участии микроРНК-484 в регуляции ответа опухолевых клеток на цитостатические агенты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Развитие приобретенной лекарственной устойчивости опухолевых клеток является одним из основных факторов, ограничивающих эффективность применения химиотерапии для лечения злокачественных новообразований. В связи с этим особое внимание в современных онкологических исследованиях уделяется поискам экспериментальных подходов, направленных на повышение чувствительности и преодоление резистентности опухолей к химиопрепаратам [11—13]. В настоящей работе мы показали, что описанное нами ранее повышение активности протеинкиназы Akt в сублиниях MCF-7, резистентных к тамоксифену или рапамицину, ассоциировано со снижением уровня микроРНК-484 — одного из супрессоров Akt. Было продемонстрировано, что трансфекция в клетки MCF-7 микроРНК-484 не влияет на активность эстрогеново-го сигналинга, но приводит к выраженному снижению экспрессии Akt и сопровождается повышением чувствительности клеток к тамоксифену и рапамицину.
В целом полученные данные свидетельствуют об участии сигнального пути микроРНК-484/ Akt в сенсибилизации клеток РМЖ к действию таргетных и гормональных препаратов, что позволяет рассматривать микроРНК-484 в качестве возможного перспективного кандидата для разработки на его основе новых противоопухолевых соединений.
а-тубулин / a-tubulin
ERa
MCF-7/scr MCF-7/mir-484
300000
S 250000 -û -3
^ -g 200 000
s tj n" a
§ Й 150000
и
3 N 100000
Контроль / Control ^-эстрадиол / 17ß-estradiol
си —I
50 000
MCF-7/scr
MCF-7/mir-484
Рис. 2. Экспрессия и транскрипционная активность рецептора эстрогенов a (ERa) в клетках MCF-7 после трансфекции микроРНК/scrambled и микроРНК-484: а — иммуноблоттинг образцов клеток с антителами к ERa, нанесение белков контролировалось по гибридизации с антителами к a-тубулину. Представлены результаты одного из 3 независимых экспериментов; б — репортерный анализ транскрипционной активности ERa. Клетки MCF-7 после трансфекции микроРНК трансфецировали плазмидой, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем промотора с эстроген-респонсивным элементом, и плазмидой, содержавшей ген р-галактозидазы. Расчет активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности р-галактозидазы в исследованных образцах). Представлены средние значения ± SD 3 независимых экспериментов
Fig. 2. Expression level and transcriptional activity of estrogen receptor (ERa) in the MCF-7 cells transfected with mir/scrambled and mir-484: а — immuno-blotting of the protein samples with antibodies to ERa, protein loading was controlled by membrane hybridization with a-tubulin antibodies. The blot represents the results of one of the three similar experiments; б — reporter analysis of the transcriptional activity of ERa. Mir/scrambled and mir-484-transfected MCF-7 cells were transfected with the plasmid containing the luciferase reporter gene under the estrogen-responsive elements, and p-galactosidase plasmid. The relative luciferase activity was calculated in arbitrary units as the ratio of the luciferase to the galactosidase activity. Data represent mean value ± SD of three independent experiments
<u 04 § £
£ 3
У -S
S iE
ш ^
S ^
и
s
.a
m
120 100 80 60 40 20 0
Контроль / Control Тамоксифен / Tamoxifen
б
120
Контроль / Control Рапамицин / Rapamycin
100
80
60
40
20
MCF-7/scr
MCF-7/mir-484
MCF-7/scr
MCF-7/mir-484
Рис. 3. Чувствительность клеток MCF-7 после трансфекции микроРНК/scrambled и микроРНК-484 к тамоксифену (а) и рапамицину (б). Клетки культивировали в течение 3 сут в присутствии 5^Мтамоксифена или 1 ^М рапамицина, количество выживших клеток определяли с помощью МТТ-теста. Представлены средние значения ± SD 3 независимых экспериментов
Fig. 3. The sensitivity of the mir/scrambled and mir-484-transfected MCF-7 cells to tamoxifen (а) and rapamycin (б). The cells were treated with 5 ^M tamoxifen or 1 ^M rapamycin for three days and the cell viability was assessed by the MTT-test. Data represent mean value ± SD of three independent experiments
СЧ СЧ
о
СЧ
>-
(J
о
—I
о и z о
ОС <
I_ l_>
о ж
to
< >
a
<
о m
a.
в;
£ m
о ж.
и >
б
а
0
а
0
сч сч о сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Shchegolev Y., Sorokin D., Scherbakov A. et al. Upregulation of Akt/Raptor signaling is associated with rapamycin resistance of breast cancer cells. Chem Biol Interact 2020;330:109243. DOI: 10.1016/j.cbi.2020.109243
2. Semina S.E., Scherbakov A.M., Vnukova A.A. et al. Exosome-mediated transfer of cancer cell resistance to antiestrogen drugs. Molecules 2018;23(4):829. DOI: 10.3390/molecules23040829
3. Scherbakov A.M., Sorokin D.V., Tatarskiy V.V. Jr. et al. The phenomenon of acquired resistance to metformin in breast cancer cells: the interaction of growth pathways and estrogen receptor signaling. IUBMB Life 2016;68(4):281-92. DOI: 10.1002/iub.1481
4. Liu J., Li S.M. MiR-484 suppressed proliferation, migration, invasion and induced apoptosis of gastric cancer via targeting CCL-18. Int J Exp Pathol 2020;101(6):203-14. DOI: 10.1111/iep.12366
5. Holubekova V., Kolkova Z., Grendar M. et al. Pathway analysis
of selected circulating miRNAs in plasma of breast cancer patients: a preliminary study. Int J Mol Sci 2020;21(19):7288. DOI: 10.3390/ ijms21197288
6. Wie Y., Li H., Qu Q. MiR-484 suppresses endocrine therapy-resistant cells by inhibiting KLF4-induced cancer stem cells in estrogen receptor-positive cancers. Breast Cancer 2021;28(1): 175-86. DOI: 10.1007/s12282-020-01152-6
7. Shi W, Dong F., Jiang Y. et al. Construction of prognostic microRNA signature for human invasive breast cancer by integrated analysis. Onco Targets Ther 2019;12:1979-2010. DOI: 10.2147/OTT.S189265
8. Jia Y.Z., Liu J., Wang G.Q., Song Z.F. MiR-484: a potential biomarker in health and disease. Front Oncol 2022;12:830420. DOI: 10.3389/fonc.2022.830420
9. Semina S.E., Scherbakov A.M., Kovalev S.V. et al. Horizontal transfer of tamoxifen resistance in MCF-7 cell derivates: proteome study. Cancer Invest 2017;35(8):506-18. DOI: 10.1080/07357907.2017.1368081
10. Reid G., Hubner M.R., Metivier R. et al. Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded ERalpha
on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling. Mol Cell 2003;11:695-707. DOI: 10.1016/S1097-2765(03)00090-X
11. Xu W., Ye C., Qing X. et al. Multi-target tyrosine kinase inhibitor nanoparticle delivery systems for cancer therapy. Mater Today Bio 2022;16:100358. DOI: 10.1016/j.mtbio.2022.100358
12. El Sayed R., El Jamal L., El Iskandarani S. et al. Endocrine and targeted therapy for hormone-receptor-positive, HER2-negative advanced breast cancer: insights
to sequencing treatment and overcoming resistance based on clinical
trials. Front Oncol 2019;9:510. DOI: 10.3389/fonc.2019.
00510
13. Gámez-Chiachio M., Sarrió D., Moreno-Bueno G. Novel therapies and strategies to overcome resistance to anti-HER2-targeted drugs. Cancers (Basel) 2022;14(18):4543. DOI: 10.3390/ cancers14184543
О
a. те
£ m
О
ж.
и >
Вклад авторов
О.Е. Андреева: дизайн исследования, репортерный и МТТ-анализ;
Д.В. Сорокин: электрофорез и Вестерн-блоттинг образцов;
А.М. Щербаков: статистическая обработка данных, анализ полученных данных;
Ю.Ю. Щеголев: культуральная работа, МТТ-анализ;
М.В. Гудкова: культуральная работа, обзор публикаций;
М.А. Красильников: идея и организация исследования, написание текста статьи. Authors' contributions
O.E. Andreeva: research design, reporter and MTT analysis;
D.V. Sorokin: electrophoresis and Western blotting of the samples;
A.M. Scherbakov: statistical data analysis; analysis of the experimental data;
Y.Y. Shchegolev: culture work; MTT analysis;
M.V. Gudkova: culture work, review of the publications;
M.A. Krasil'nikov: idea and organization of the study, article writing.
ORCID авторов/ ORCID of authors
О.Е. Андреева / O.E. Andreeva: https://orcid.org/0000-0002-6015-6619
Д.В. Сорокин / D.V. Sorokin: https://orcid.org/0000-0002-1264-7405
А.М. Щербаков / A.M. Scherbakov: https://orcid.org/0000-0002-2974-9555
Ю.Ю. Щеголев /Y.Y. Shchegolev: https://orcid.org/0000-0002-1490-6781
М.В. Гудкова / M.V. Gudkova: https://orcid.org/0000-0003-2694-5232
М.А. Красильников / M.A. Krasil'nikov: https://orcid.org/0000-0002-5902-7633
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-15-00245) (https://rscf.ru/ project/22-15-35008/).
Funding. The work was carried out with the financial support of the Russian Scientific Foundation (grant No. 19-15-00245) (https://rscf.ru/ project/22-15-35008/).
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Работа не содержит описания исследований с участием людей или животных в качестве объектов.
Compliance with patients rights and principles of bioethics. This article does not describe any research involving humans or animals as subjects.
Статья поступила: 23.10.2022. Принята к публикации: 22.11.2022. Article submitted: 23.10.2022. Accepted for publication: 22.11.2022.
