CC BY
53
УДК 579.61: 616.34-002
ШВИДК1СТЬ ФОРМУВАННЯ РЕЗИСТЕНТНОСТ1 М1КРООРГАН1ЗМ1В ДО Х1ТОЗАНУ
Експериментально дослiджено швидюсть формування резистентностi грампозитивних, грамнегативних бактерш та грибiв роду Candida до х™зашв з рiзною молекулярною масою. При тридцятикратному культивуваннi мiкроорганiзмiв на середовищах, що мiстили зростаючi концентрацп дослiджених речовин, було встановлено повшьне формування резистентностi до них. Отримаш результати свiдчать про можливiсть використання х^озашв у якостi протимжробно! складово! при створеннi нанокомпозитних матерiалiв бюмедичного призначення.
Ключовi слова: хiтозан, мжрооргашзми, резистентнiсть, нанокомпозитнi матерiали.
Рис.1. Структурна формула хгтозану.
Робота е фрагментом НДР АМН 97/2011 «Теоретичне та експериментальне обхрунтування розробки нанокомпозитних покриттiв на основi бiополiмерiв та протимтробних засобiв для медичних iмплантiв» № ДР 0111U004731.
Х1тозан е одним з перспективних бюпол1мер1в для ¡нженери тканин та застосування в якост складово! композитних матер1атв для ортопедп та стоматологи. Комбшащя бюсумюност1, протишкробно! активносп, здатшсть створювати структури з прогнозованим об'емом пор та контрольованою швидюстю деградацп роблять його перспективним матер1алом для юсткових 1мплантат1в. Х1тозан, як природний полшатюн, може зв'язувати таю анюнш молекули, як глшозамшоглшани, ДНК, що робить його потенцшним субстратом для генно-активованих матриць для використання в якосп генно! терапн в ортопедп [10]. Хггозан - нетоксичний, бюсумюний полюахарид, здатний до бюрезорбцп, волод1е широким спектром бюлопчно! активносп [8, 9, 12]. Структурна формула хишану приведена на рис. 1.
Х1тозан важко розчиняеться у вод1 в результат! ефекту пдрофобно! взаемодп, коли енерпя водневих зв'язюв м1ж молекулами води переважае енерпю !х взаемодп з молекулами х1тозану. В той же час воднев1 зв'язки визначають здатшсть х1тозану розчинятися в оргашчних кислотах - оцтовш, лимоннш, щавлевш, янтарнш [3].
Тому в ход1 експерименпв нами були використаш розчини х1тозану в оцтовш кислота Одними з перших властивостей, пом1чених у х1тозану, були його протибактер1альна та протигрибкова актившсть. Було вщм1чено, що х1тозан е шпбггором росту бактерш, що обумовлено зв'язуванням молекул полшатюна з кл1тинною стшкою м1крооргашзм1в, а також впливом х1тозану на мехашзм репродукцп мшробних тш [2, 14]. Також доведено, що антибактер1альний ефект х1тозашв в бшьшш м1р1 пов'язаний з1 ступенем зарядженост первинних амшогруп, шж 1з загальним !х вмютом в пол1мер1. Введення до амшогруп замюниюв 1з анюнними групами приводить практично до повно! втрати антимшробно! активносп, що шдтверджуе виршальну роль позитивного заряду в пригшченш росту м1крооргашзм1в [1, 7]. Бюциднш активност х1тозану присвячена велика кшьюсть експериментальних робгг [13]. Допускають, що протибактер1альш властивосп х1тозану пов'язаш, в першу чергу, з впливом на кттинну стшку мшрооргашзму. Так, у випадку грамнегативних бактерш, першою мшенню дп х1тозанового полшатюну е лшополюахарид (ЛПС), що входить до складу зовшшньо! мембрани та заряджений негативно. У той же час, мутантний штам Salmonella typhimurium, у зовшшнш мембраш якого присутнш позитивний заряд, проявляе шдвищену стшюсть до дп х1тозану, що шдтверджуе роль заряду ЛПС в протибактер1альнш активносп пол1мера [11].
Протягом останшх роюв у всьому свт в умовах зростаючого селекцшного тиску спостерпаеться прогресуючий розвиток резистентност збудниюв позаткарняних та нозоком1альних шфекцш до антибактер1альних та х1мютерапевтичних препарат1в. Формування та штенсивне розповсюдження в умовах лшувально-профшактичних заклад1в антибютикостшких м1крооргашзм1в пов'язано з шдвищенням !х адаптацшних можливостей, змшою етюлопчно!
структури збудниюв гншно-запальних захворювань, зниженням частини облпатних патогешв, розширенням спектру i тдвищенням питомо! ваги умовно-патогенних MiKpo6iB.
Зважаючи на вищезазначене, представляе iнтерес визначення можливостi формування стiйкостi деяких штамiв мiкроорганiзмiв щодо хiтозану. Завдяки широкому спектру бюлопчно! активностi, бiосумiсностi, протимшробно! дп обраний об'ект може бути придатний для розробки нанокомпозитних покритпв для медичних iмплантiв та застосування в ортопедп та стоматологи.
Метою роботи було вивчення формування стшкост грампозитивних, грамнегативних мiкроорганiзмiв та грибiв роду Candida до хiтозанiв з рiзною молекулярною масою.
Матерiал та методи дослщження. Предметом дослiдження стали зразки х^озану з молекулярною масою 39 кДа, 500 кДа та ступенем деацетилювання 87% (виробництво "Бюпрогрес", Москва). Як препарати порiвняння використаш протимiкробнi засоби : ампiцилiн, гентамщин (виробництва ПАТ «Кшвмедпрепарат», Укра!на) та флуконазол (виробництва ТОВ «Фармацевтична компашя «Здоров'я», Харкiв, Укра!на). Експерименти проведет на музейних штамах мiкроорганiзмiв S. aureus АТСС 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC 885-653, рекомендованих для вивчення антибактерiальних властивостей дослщжуваних препарата [6].
Вивчення швидкост формування стшкосп мiкроорганiзмiв до експериментальних зразюв хiтозану з молекулярною масою 39 кДа та 500 кДа проводили in vitro шляхом багаторазових пасажв [4, 5]. У якост контролю застосовували кислоту оцтову з об'емною часткою 0,5 %, у якш були розчиненi зразки х^озашв. Дослiдження зразкiв здiйснювали стандартним методом двократних серiйних розведень в бульйош впродовж тридцяти тижнiв, що вiдповiдало термiну 30 пасажiв. Густина мшробно! суспензп при вiзуальному контролi вiдповiдала стандарту мутностi 0,5 за Мак-Фарландом. Для кожного наступного пасажу застосовували культури мiкроорганiзмiв попереднього дослщного та контрольного ряду з виявленою мiнiмальною iнгiбуючою концентрацiею (М1К). Критерiем оцiнки дослiдження вважали кратнiсть збшьшення М1К у кожному п'ятому послщовному пасажi.
Результати дослiдження та Тх обговорення. Розвиток резистентностi тест-штаму S.aureus ATCC 25923 до експериментальних зразюв х1тозану та амшцилшу представлено на рис. 2.
Результати експерименту показали, що формування резистентносп S. aureus щодо зразюв х^озану вiдбувалося повшьно. Для хiтозану з М. м. 39 кДа, порiвняно з його вихщною М1К, зростання М1К починалося шсля п'ятнадцятого пасажу. Схожа тенденщя збiльшення М1К спостерiгалась i для х1тозану з М. м. 500 кДа. Збшьшення М1К у 4 рази дослщних зразкiв вiдзначали тшьки пiсля двадцяти п'яти пасажв. У той же час, збшьшення М1К ампiцилiну було виявлено пiсля п'яти пасажв.
Формування стiйкостi до оцтово! кислоти з об'емною часткою 0,5 % спостерпалось пiсля проведення двадцяти пасажв, але слiд вiдзначити значно вищий початковий рiвень М1К, який становив 625,0 мкг/мл. Кратшсть збшьшення у 2 рази з'явилась лише шсля проведення двадцяти п'яти пасажв i залишалась на такому рiвнi по завершенню експерименту.
Результати дослщження швидкост розвитку стiйкостi тест-штаму E.coli АТСС 25922 продемонстровано на рис. 3. Доведено, що шсля десяти пасажв значення М1К для обох зразюв х^озашв лишилось на рiвнi вихщно! чутливостi. Для хiтозану з М. м. 500 кДа означена концентращя спостерпалась i пiсля 15 пасажв. Подальшим дослiдженням виявлено, що шсля двадцяти пасажв рiвень М1К збiльшився у 2 рази, що свщчить про повiльний розвиток резистентносп тест-штаму кишково! палички до хггозашв. Зростання стiйкостi до кислоти оцтово! з об'емною часткою 0,5 % спостерпалось лише шсля проведення двадцяти пасажв, але початковий рiвень М1К також був досить високим (625,0 мкг/мл). Збшьшення М1К у 2 рази з'явилось шсля проведення двадцяти п'яти пасажв i залишалось на такому рiвнi до кiнця
Амгпцилш
К1
Ch 500 k Da Ch 39 kDa
30
Кшьюсть пасаж1в Рис. 2. Динамша розвитку резистентнскш штаму S.aureus АТСС 25923 до зразмв хiтозану (Ch 39 kDa, Ch 500 kDa), розчину 0,5 мас.% оцтово! кислоти (К1) та амшцилшу.
експерименту. Прояв резистентност тест-штаму E.coli до гентамщину з'явився тсля п'яти пасажiв, а до завершения дослщження М1К зросла у 32 рази. Експериментально визначено, що поява стшкост тест-штаму P. aeruginosa АТСС 27853 щодо дослщних зразкiв хiтозанiв формувалась повiльно протягом 30 пасажв (рис. 4). У той же час до гентамщину рiвень М1К збiльшився у 2 рази вже тсля п'яти пасажiв. По завершент пасажування вихiдна М1К збiльшилась у 32 рази. Швидюсть формування резистентностi тест-штаму до кислоти оцтово! з об'емною часткою 0,5 % була аналопчною як по вщношенню до хiтозанiв.
У результат проведених дослiджень виявлено повiльне формування резистентносп C. albicans ATCC 885-653 до обраних зразкiв хiтозанiв, що вщображено на рис. 5. Пюля двадцятого пасажу спостерiгалось збiльшення М1К у порiвняннi з вихiдною концентращею у 2 рази. У контролi - кислотi оцтовiй з об'емною часткою 0,5 % така ж краттсть збшьшення М1К виявилась також тсля двадцяти пасажiв. Подальше пасажування C. albicans показало, що тсля двадцять п'ятого пасажу значення М1К становило 250,0 мкг/мл. В присутносп флуконазолу розвиток резистентностi вiдбувався швидше.
35 | 30 | 25 ' 20 ■ 15 | 10 | 5 0
л
ь
15 20
Гентамщин K1 500 kDa Ch 39 kDa
500 kDa Ch 39 kDa
25 30 К^льюсть nacaxiB
Рис. 3. Динамка розвитку резистеитиостi штаму E.coli ATCC 25922 до експериментальних зразгав хiтозаиу (Ch 39 kDa, Ch 500 kDa), розчину 0,5 мас.% оцтово! кислоти (К1) та гентамщину
J 51015 2^730
н
го
Э" К|ЛЬК1СГЬ ПЭСЭЖ1В
Рис.4. Дииамiка розвитку резистеитиостi штаму P .aeruginosa АТСС 27853 до експериментальних зразгав хггозану (Ch 39 kDa, Ch 500 kDa), розчину 0,5 мас.% оцтово! кислоти (К1) та гентамщину.
16 14 12 10 8 6 4 2
5 10 15 20
нт 20 25 30
та
^ Юльюсть nacaxiB
Рис. 5. Динамка розвитку резистентной штаму C. albicans ATCC 885-653 до експериментальних зразгав х^озану (Ch 39 kDa, Ch 500 kDa), розчину 0,5 мас.% оцтово! кислоти (К1) та флуконазолу.
Початкова М1К флуконазолу складала 31,2 мкг/мл, але вже тсля проведення п'яти пасажв рiвень М1К становив 62,5 мкг/мл. В цшому, протигрибкова активнiсть флуконазолу по завершеннi дослщження зменшилась у 16 разiв. Результати даного дослщження представленi на рис. 5.
Результати вивчення формування стшкосп грампозитивних - S. aureus АТСС 25923, грамнегативних тест-штамiв - E. coli АТСС 25922, P. aeruginosa АТСС 27853 та грибiв роду C. albicans ATCC 885-653 до х^озатв з рiзною молекулярною масою показали повiльне формування резистентностi дослщжуваних мiкроорганiзмiв у порiвняннi з чутливютю до антибiотикiв.
Перспективи подальших розробок у даному напрямку. Ознйчене cBiöuumb про можливкть BUKopucmaHня хтозйшв у якocmi протимтробног склйдово! при створенш нйнокомпозитних Ma.mepian.iB бюмедичного признйчення.
1. Бузинова А. Сорбционные и бактерицидне свойства плёнок хитозана / А. Бузинова, А. Б. Шиповская // Известия Саратовского университета. - 2008. - Т. 8. Сер. Химия. Биология. Экология. - Вып. 2.
2. Гамзазаде А.И. Антибактериальная активность хитозанов /А.И. Гамзазаде, С.М. Насибов, О.В. Лукин // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Мат-лы 8-й Международной конф. - М.: ВНИРО, - 2006. - С.183-186.
3. Евдокимов И. А. Физико-химические характеристики растворов хитозана / И. А. Евдокимов, С. В. Василисин, Л. Р. Алиева [и др.] // Вестник СевГТУ, серия «Продовольствие». - 2003. - №1 (6).
4. Лабинская А. С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинской, Л. П. Бленковой, А. С. Ещиной // - М. : Медицина, - 2004. - С. 216-219.
5. Полщук Н. М. Дослщження чутливост та швидкост формування резистентносп штамiв Yersinia enterocolitika до похщних 4Я-тридо[4',3':5,6]трано[2,3-а]тримщишв / Н. М. Полщук, I. Ю. Кучма, В. В. Казмiрчук [и др.] // Вюник проблем бюлогй i медицини. - 2010. - № 3. - С. 227-230.
6. Про затвердження методичних вказiвок «Визначення чутливост мiкроорганiзмiв до антибактерiальних препара™» : наказ МОЗ Укра'ши вщ 05. 04. 2007 № 167 // Новости медицины и фармации. - 2007. - №18. - С. 1-7.
7. Скрябин К. Г. Хитин и хитозан : Получение, свойства и применение / К. Г. Скрябин, Г. А Вихорева, В. П. Варламов // - М.: Наука, - 2002. - 368 с.
8. Суходуб Л. Б. Бюсумюш кальцш фосфатш покриття для металевих iмплантатiв / Л. Б. Суходуб, А. Ю. Волянський, Л. Ф. Суходуб [та ш.] // Анали Мечшковського шституту. - 2011. - №4. - С. 252-258.
9. Суходуб Л.Б. Вплив протимкробних компонента бюкомпозитних матерiалiв на основi пдроксиапатиту на адгезш мщо-органiзмiв / Л.Б. Суходуб, Т.П. Осолодченко, Г.£. Христян [та ш.] // Запорiзький медичний журнал.- 2014. - № 2. - С. 112-114.
10. Di Martino Chitosan : A versatile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering / A. Di Martino // Biomaterials. - 2005. -Vol. 26. - P. 5983-5990.
11. Helander I. M. Chitosan disruhts the barrier properties of the outer membrane of gramm-negative bacteria / I. M. Helander, E. L. Nurmiaho-Lassila, R. Ahvenainen [et al.] // Int. J. Food Microbiol. - 2001. -Vol. 71. - P. 235-244.
12. Ming Kong Antimicrobial properties of chitosan and mode of action : A state of the art review / Ming Kong, Xi Guang Chen, Ke Xing [et al.] // International Journal of Food Microbiology. - 2010. - Vol. 144. - P. 51-63.
13. Rabea E. I. Chitosan as antimicrobial agent : application and mode of action /E. I. Rabea, M. E. Badawy, C. V Stevens [et al.] // Biomacromol. - 2003. - Vol. 4. № 6. - P.1457-1465.
14. Uchida Y. Antibacterial activity by chitin and chitosan /Y. Uchida // Food Chemical. - 1998. - Vol. 2. - P. 22-29.
СКОРОСТЬ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ХИТОЗАНУ Христян Г. Е., Суходуб Л. Б., Щербак О. Н., Шульга Н. Н., Казмирчук В. В.
Экспериментально изучено скорость формирования резистентности грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибов рода Candida к хитозанам с разной молекулярной массой. При тридцатикратном культивировании микроорганизмов на средах, содержащих возрастающие концентрации изучаемых веществ, было установлено медленное формирование резистентности к ним. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования хитозанов в качестве противомикробного компонента при создании нанокомпозитных материалов биомедицинского назначения.
Ключевые слова: хитозан, микроорганизмы, резистентность, нанокомпозитные материалы.
Стаття надшшла 15.10.2014 р.
VELOCITY OF THE MICROORGANISM RESISTANCE FORMATION AGAINST CHITOSAN Khcristyan G. E., Sukhodub L. B, Shcherbak О. N., Schulga N. M., Kazmirchuk V. V.
Experimentally studied the formation rate of resistance of Gram-positive, Gram-negative bacteria and fungi of the genus Candida to the chitosan with different molecular weights. When thirtyfold culturing microorganisms in media containing increasing concentrations of test substances was set slow development of resistance to them. The results suggest the possibility of using chitosan as an antimicrobial component for making nanocomposite materials for biomedical applications.
Key words: chitosan, microorganisms, resistance, nanocomposite materials.
Рецензент Кущ О.Г.
УДК 612.017.1:616-099-092.9:547.911-311-145.82
СОСТОЯНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОМ РЕАКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО СУБТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛАПРОКСИДОВ
Изучено влияние субтоксических доз лапроксидов Л-303 и Л-500 на аллергенные свойства и состояние клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных. Тестирование лапроксидом Л-303 выявило клинические и кожные проявления сенсибилизации животных, а также отсутствие таковых при тестировании Л-500. В дозах 1/100 и 1/1000 ЛД50 Л-303 ингибирует клеточный и гуморальный иммунитет, синтез ДНК, РНК и белка, стимулирует развитие провоспалительных реакций. Лапроксид Л-500 в дозе 1/100 ЛД50 ингибирует клеточный и гуморальный иммунитет, подавляет синтез ДНК, РНК и белка на фоне активации пробластомных цитокинов. Установлено, что Л-500 в 1/100 ЛД50, а Л-303 в 1/100 и 1/1000 ЛД50 формируют развитие иммунологической недостаточности и дисфункции иммунологической реактивности.
Ключевые слова: ксенобиотики, лапроксиды, сенсибилизация, иммунологическая недостаточность.
Работа является фрагментом НИР ,,Изучение механизмов биологического действия простых полиэфиров в связи с проблемой охраны окружающей среды " (№ государственной регистрации 0110и001812).
Стремительное развитие химической, нефтеперерабатывающей, фармацевтической, металлургической, машиностроительной промышленности, интенсивная химизация сельского хозяйства и использование большого ассортимента химических средств в быту, создают реальную угрозу глобального загрязнения окружающей среды ксенобиотиками. Среди ксенобиотиков встречаются соединения представляющие, как потенциальную, так и непосредственную опасность для здоровья населения. Многочисленные исследования свидетельствуют, что ведущая роль в его сохранении и укреплении принадлежит интегративным системам контроля гомеостатической функции организма: нервной, эндокринной и иммунной [1, 2, 5]. Большие объемы и широкое внедрение в производство и быт лапроксидов, ставят важную и актуальную задачу оперативной и своевременной оценки потенциальной опасности данных ксенобиотков для теплокровных животных и человека. Это в полной мере относится и к изучению влияния данной группы соединений на состояние иммунобиологической реактивности в условиях длительного субтоксического воздействия на организм [2]. При этом, весьма важным является оценка аллергенности и сенсибилизирующих свойств химических веществ, которые самым тесным
