CC BY
76
Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Москва
Апробировали биологическую модель, в качестве которой использовали крыс линии Вистар, для изучения микрофлоры ЖКТ. Оказалось, что предложенная модель позволяет эффективно оценивать пристеночный биотоп. Определяли антибиотиковары эшерихий и энтерококков, выделенных из пристеночного муцина и из просвета ЖКТ крыс. Выделенные штаммы отличаются между собой по чувствительности к антибиотикам. Скорее всего, микрофлора пристеночного муцина несёт ответственность за поддержание динамического равновесия в кишечнике, а её видовой и количественный состав может быть более объективным показателем состояния аутофлоры кишечника.
Ключевые слова: пристеночная микрофлора, пристеночный муцин, биологическая модель, антибиотики, изоляты эшерихий, энтерококков.
STRAIN IDENTITY OF THE PARIETAL MUCIN OF THE GASTROINTESTINAL TRACT
BIOLOGICAL MODEL
Экспериментальная биология и медицина УДК 615.33.616.348-008.87].015.8
ШТАММОВАЯ ОБЩНОСТЬ ПРИСТЕНОЧНОГО МУЦИНА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ
© Корнеев М.Л., Воробьев А.А., Миронов А.Ю., Лыкина Е.В.
Korneev M.L., \Vorobjev A.A., Mironov A. Yu., Lykina E. V.
Microbiology, Virusology, Immunology Department of the I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow
We approved new biological model (in Wistar rats) for studying the parietal mucin micro flora of gastrointestinal tract (GIT). Micro florae of the parietal mucin are of quantitative and qualitative differences, and vary in antibiotic sensitivity. The condition of mucous micro flora may give objective evaluation of GIT condition in general.
Key words: parietal micro flora, parietal mucin, biological model, antibiotics, isolates of escherichia and en-terococci.
С современных позиций микрофлору рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых всех открытых внешней среде полостей организма. Особое внимание микробиологов и практических врачей уделяется микробиоценозу кишечника. Эта экологическая ниша в настоящее время интенсивно изучается [4, 6, 8]. Известно, что при развитии патологических состояний и воспалительных процессов инфекционной и неинфекционной этиологии как в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), так и в других органах и системах организма, в пищеварительном тракте происходят видовые и количественные изменения микрофлоры, которые называют дисбактериозом [6].
Одной из актуальных проблем клинической медицины остается лечение дисбакте-риозов кишечника. Дисбактериозы ЖКТ человека являются одним из распространенных среди населения РФ патологических состоя-
ний и сопровождаются снижением качества жизни. Несмотря на достаточно большое количество способов и методов диагностики и коррекции дисбактериоза ЖКТ, вопросы патогенеза данной нозологии остаются открытыми. В частности, не до конца изучен вопрос о характере изменения пристеночной микрофлоры ЖКТ человека и её роли в развитии дисбактериоза [6, 8].
Проведенные ранее исследования показали, что микрофлору пристеночного муцина ЖКТ человека отличает выраженная изменчивость [1, 2, 3].
Продолжение работ в данном направлении ограничено вопросами как технического, так и этического порядка. Обозначенный вопрос может быть решен в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных, например, крысах. Однако, организм крысы не может считаться до конца адекватной моделью человеческого организма в связи с отличиями в строении ЖКТ и особенностями
физиологии (крыса является копрофагом), тем не менее эксперименты, проводимые на этой биологической модели, могут восполнить определенные пробелы в знаниях. При этом известно, что различные бактериальные штаммы внутри одного биологического вида могут различаться по своей чувствительности к антибиотикам.
В соответствии со сказанным целью данной работы явилось сопоставление антибио-тиковаров в просвете и пристеночной области ЖКТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте были использованы самки крыс линии Вистар в возрасте от 8 до 12 месяцев массой 250-290 граммов. Все крысы содержались на стандартном пищевом рационе. Перед исследованием для очищения кишечника от фекальных масс крысы в течение 24 часов содержались на голодном рационе с обеспечением потребности в питьевой воде. При заборе биоматериала крыс умерщвляли с предварительной премедика-цией эфиром согласно правилам гуманного обращения с животными. Для исследования брали участки (массой - 125 + 0,5 мг) слизистой оболочки из различных участков тонкой (нижней трети) и толстой (слепой и толстый участки) кишки, полностью свободных от химуса. От одной крысы использовали 3-4 биоптата. Всего было исследовано 84 биопта-та.
После взятия материал помещали в стерильный изотонический раствор хлорида на-
трия в соотношении 1 мг ткани к 100 мкл раствора и выдерживали в нем в течение двух часов до разжижения муцина. Перед забором алкивот пробирку встряхивали на приборе МюгоБЬакег МЬ-1 (Ргешеё, Чехия) в течение 30 секунд до получения однородной микробной взвеси. Из последней готовили мазки с последующей окраской по Граму и десятикратные разведения до конечной концентра-
7 3
ции 10 для толстой кишки и 10 для тонкой. Из полученных разведений производился высев материала на питательные среды (табл. 1). Параллельно с этим осуществлялся посев просветной микрофлоры. Для исследования брали фекалии от крыс, которые помещали в стерильные пробирки с плотно притертыми крышками. Для этого навеску фекалий массой 1 г переносили в стерильную пробирку, заливали изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:10, тщательно растирали стеклянной палочкой до получения однородной взвеси и оставляли на 10 мин для осаждения на дно крупных частиц. Готовили десятикратные разведения до 10-9, добавляя последовательно по 1 мл исследуемого материала к 9 мл изотонического раствора хлорида натрия. Из полученных разведений производился высев материала на питательные среды (табл. 1).
Количество выделенных микроорганизмов определяли согласно формуле
КОЕ/г = па/Ь, где а - разведение,
Ь - объём посевного материала, п - количество колоний, и выражали в 1§ КОЕ/г фекалий.
Таблица 1
Питательные среды Микроорганизмы Пристеночный муцин Фекалии
Тонкая кишка Толстая кишка
Эндо Энтеробактерии 10-2; 10-3 10-2; 10-4 10-2; 10-4
Энтерококковый агар Энтерококки 10-2; 10-3 10-2; 10-4 10-2; 10-4
Питательные среды и разведения материала для исследования микрофлоры пристеночного муцина
и фекалий крыс
Родовую и видовую идентификацию осуществляли по морфологическим, тинктори-альным, культуральным и биохимическим свойствам [5]. Для биохимической идентификации использовали диагностические наборы "Энтеротест 24" (Lachema, Чехия).
Антибиотикочувствительность выделенных штаммов Escherichia coli и Enterococcus faecalis определяли диско-диффузионным методом по стандартной методике. Использовали бумажные диски с антибиотиками ("HiMe-dia", Индия).
Изучали чувствительность к 25 антибиотикам различных групп. Полученные данные подвергли статистической обработке [7] с использованием вариационного сравнительного анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Эшерихии, выделенные из изучаемых биотопов ЖКТ крыс, различались между собой по чувствительности к антибиотикам как среди групп по механизму действия, так и к отдельным химиопрепаратам. Так, наибольшая чувствительность E. coli определялась в 40,0-86,0% случаев к стрептомицину, нали-диксовой кислоте, амикацину, цефамандолу, канамицину, ломефлоксацину, ципрофлокса-цину. У эшерихий, выделенных из тонкой кишки, она составила 83,3% случаев к стрептомицину, в 71,42% случаев к налидиксовой кислоте, амикацину, цефамандолу, канами-цину, ципрофлоксацину, а к ломефлоксацину - в 85,71% случаев. У изолятов из толстой кишки чувствительность определялась в 68,42% случаев к стрептомицину, амикацину, канамицину. При определении чувствительности к антибиотикам у эшерихий, высеянных из фекалий, оказалось, что на них в 60,0% случаев влияет стрептомицин, нали-диксовая кислота, амикацин, цефамандол, ломефлоксацин, ципрофлоксацин (табл. 2).
Умеренная чувствительность у эшерихий определялась в 10,52-57,14% случаев к не-омицину, карбенициллину, кларитромицину. У изолятов из тонкой кишки она составила 14,28% случаев к кларитромицину, к неоми-цину - 57,14% случаев, к карбенициллину -20,0%. У изолятов эшерихий из толстой кишки умеренная чувствительность составила
47,3% случаев к карбенициллину, в 63,15% случаев - к неомицину, в 10,52% - к кларитромицину. При определении чувствительности к антибиотикам у изолятов из фекалий оказалось, что на них в 50,0%, 40,0%, 20,0% случаев влияют неомицин, карбенициллин, кларитромицин соответственно.
Не оказывают влияние на эшерихий, выделенных из пристеночного биотопа кишки и фекалий экспериментальных животных, клиндамицин, эритромицин, оксациллин, це-фепим, пенициллин G, рифампицин, ванко-мицин, полимиксин B.
Сравнительный анализ чувствительности изученных бактериальных штаммов к группам антибиотиков, объединенных по химической структуре, установил, что эшерихии чувствительны к аминогликозидам, фторхи-нолонам, цефалоспоринам. Причём у изоля-тов из тонкой кишки, определялась наибольшая чувствительность к фторхинолонам. В то время как к аминогликозидам наиболее чувствительны E. coli, высеянные из толстого отдела кишки и фекалий крыс. Линкозамиды, макролиды, гликопептиды, рифампицины, полимиксины не оказывали влияния на изучаемые бактериальные штаммы эшерихий.
При анализе механизма действия антибиотиков установлено, что изоляты эшерихии из пристеночного муцина являлись более чувствительными к препаратам, нарушающим синтез белка на уровне рибосом, чем фекальные изоляты (рис. 1).
Как следует из полученных данных, штаммы эшерихий в пристеночном муцине и фекалиях сходны по спектру антибиотико-чувствительности, что скорее всего может являться следствием интенсивного обмена штаммами эшерихий между пристеночным и просветным биотопами.
Энтерококки, высеянные из изучаемых этажей ЖКТ крыс, различались между собой по чувствительности к антибиотикам как среди групп по механизму действия, так и к отдельным химиопрепаратам. Так, наибольшая чувствительность данных микроорганизмов определялась в 69,7-100,0% случаев к хло-рамфениколу (69,7%), рифампицину (77,5%), к клиндамицину, имипенему, ампициллину (100,0%). У изолятов энтерококков из толстой кишки чувствительность определялась в
Таблица 2
Антибиотикочувствительность эшерихий, выделенных из пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта и фекалий крыс
Этаж тонкая слепая толстая фекалии
Антибиотик^^^-^^ n % n % n % n %
Streptomycin 6 80,0 9 77,77 10 40,0 10 60,0
Clindamycin 7 0,00 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Cephotaxime 7 28,57 9 44,44 10 40,0 10 40,0
Erythromycin 6 0,00 10 0,00 10 0,00 10 0,00
Oxacillin 7 0,00 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Nalidixis acid 7 71,42 9 66,66 10 60,0 10 60,0
Cefepime 7 0,00 9 0,0 10 0,0 10 0,0
Neomycin 7 57,41 9 66,66 10 60,0 10 50,0
Amikacin 7 71,42 9 66,66 10 70,0 10 70,0
Imipenam 7 28,57 9 33,33 10 40,0 10 40,0
Cefamandol 7 71,42 9 55,55 10 70,0 10 60,0
Kanamycin 7 71,42 9 77,77 10 60,0 10 70,0
Doxycydine HCl 7 0,00 9 44,44 10 30,0 10 50,0
Lomefloxacin 7 85,71 9 66,66 10 60,0 10 60,0
Carbenicillin 5 20,0 9 44,44 10 40,0 10 40,0
Chloramphenicol 7 14,28 7 42,83 10 10,0 10 20,0
Ampicillin 7 28,57 9 55,55 10 20,0 10 30,0
Cephalexin 7 42,85 9 33,33 10 50,0 10 40,0
Penicillin-G 7 0,00 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Clarithromycin 7 14,28 9 11,11 10 10,0 10 20,0
Ciprofloxacin 7 71,42 9 55,55 10 40,0 10 60,0
Rifampicin 7 0,00 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Vankomycin 7 0,00 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Polymixin-B 7 0,00 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Azithromycin 7 28,5 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Рис. 1. Сравнительная чувствительность к антибиотикам изолятов эшерихий из пристеночного муцина и фекалий ЖКТ крыс.
100,0% случаев к клиндамицину, эритромицину, амикацину, ампициллину. При определении чувствительности к антибиотикам изо-лятов из фекалий оказалось, что на них в 40,0-100,0% случаев влияет клиндамицин (100%), цефотаксим (60,0%), эритромицин (80,0%), неомицин (60,0%), амикацин (80,0%), цефамандол (100,0%), ампициллин (100,0%), ципрофлоксацин (40,0%), азитро-мицин (40,0%) (табл. 3). Изоляты энтерококков оказались устойчивы к цефепиму, кана-мицину, ломефлоксацину, оксациллину, стрептомицину, налидиксовой кислоте.
Умеренная чувствительность у энтерококков определялась в 20,0-40,0% случаев к
цефалексину (20,0%), ванкомицину (20,0%), азитромицину (40,0%). У изолятов из толстой кишки умеренная чувствительность составила 20,0% случаев к цефалексину, 63,15% случаев - к азитромицину. У фекальных изоля-тов оказалось, что на них в 20,0%, 40,0% случаев влияют цефалексин и ципрофлоксацин соответственно.
Не оказывают влияние на штаммы энтерококков, выделенных из пристеночного биотопа кишки и фекалий экспериментальных животных, доксициклин, карбенициллин, по-лимиксин В.
Таблица 3
Антибиотикочувствительность энтерококков, выделенных из пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта и фекалий крыс
——Этаж Антибиотик ——— слепая толстая фекалии
n % n % n %
Streptomycin 9 0 10 0 10 10,0
Clindamycin 9 100,0 10 100,0 10 100,0
Cephotaxime 9 60,0 10 60,0 10 60,0
Erythromycin 10 80,0 10 100,0 10 80,0
Oxacillin 9 0 10 0 10 10,0
Nalidixis acid 9 0 10 0 10 10,0
Cefepime 9 0 10 0 10 10,0
Neomycin 9 40,0 10 40,0 10 60,0
Amikacin 9 100,0 10 100,0 10 80,0
Imipenam 9 80,0 10 79,34 10 97,4
Cefamandol 9 100,0 10 100,0 10 100,0
Kanamycin 9 0 10 0 10 10,0
Doxycydine HCl 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Lomefloxacin 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Carbenicillin 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Chloramphenicol 7 98,40 10 70,0 10 100,0
Ampicillin 9 100,0 10 100,0 10 100,0
Cephalexin 9 20,0 10 20,0 10 20,0
Penicillin-G 9 60,0 10 40,0 10 60,0
Clarithromycin 9 20,0 10 40,0 10 60,0
Ciprofloxacin 9 40,0 10 40,0 10 40,0
Rifampicin 9 78,6 10 100,0 10 58,9
Vankomycin 9 20,0 10 0,00 10 20,0
Polymixin-B 9 0,00 10 0,00 10 0,00
Azithromycin 9 40,0 10 40,0 10 40,0
% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
О о
a >4
CO s
^ о.
1о
% % О
о. 3
5 <s
□ пристен. муцин ■ фекалии
Рис. 2. Сравнительная чувствительность к антибиотикам изолятов энтерококков из пристеночного муцина и фекалий ЖКТ крыс.
0
Сравнительный анализ чувствительности изученных бактериальных штаммов к группам антибиотиков, объединенных по химической структуре, установил, что энтерококки, чувствительны к аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколам, рифампицинам, це-фалоспоринам. Причём к аминогликозидам наиболее чувствительны энтерококки, высеянные из толстого отдела кишки и фекалий крыс. Линкозамиды, гликопептиды, поли-миксины не оказывали влияния на изучаемые штаммы энтерококков.
Сравнительный анализ чувствительности изученных бактериальных штаммов к группам антибиотиков, объединенных по химической структуре, установил, что энтерококки, выделенные из фекалий, более устойчивы к тетрациклинам (р < 0,05), макролидам (р < 0,05), чем соответствующие изоляты из пристеночного муцина.
При анализе механизма действия антибиотиков установлено, что энтерококки так же, как и эшерихии, изолированные из пристеночного муцина, являлись более чувствительными к препаратам, нарушающим синтез белка на уровне рибосом, чем фекальные изоляты (рис. 2).
Анализ экспериментальных данных показывает, что, возможно, в результате длительной взаимной адаптации бактерий данных видов, путём выработки собственных продуктов метаболизма, а также переработки находящихся в ЖКТ субстратов создаются более благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов других видов. В отношении тех видов, которые не прошли длительный эволюционный путь и которые можно отнести к аллохтонной микрофлоре, те же изменения угнетают их жизнедеятельность.
Кроме того, просветную микрофлору трудно определить как постоянную и объективно отражающую состояние и изменения микробиоценоза ЖКТ. Возможно, что именно пристеночная часть микрофлоры кишечника, в которой сформировались устойчивые биотопы, связанные между собой многочисленными и межвидовыми связями, несёт ответственность за поддержание эубиоза кишечника, влияние на микроорганизмы других экологических ниш организма, а его видовой
и количественный состав может являться более объективной оценкой состояния аутофло-ры кишечника.
Таким образом, применение единого методического подхода при изучении микробиологических характеристик микробиоценоза пристеночного муцина ЖКТ позволило получить сопоставимые результаты.
На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:
1. Предложенная биологическая модель (крысы) пригодна для изучения пристеночного биотопа ЖКТ.
2. Для адекватной оценки микроэкологии ЖКТ необходимо наряду с просветной микрофлорой оценивать микрофлору пристеночного биотопа.
3. Микроорганизмы, выделенные из пристеночного муцина, обладают высокой вариабельностью и значительно отличаются по своим биологическим свойствам от штаммов фекального биотопа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Буданова Е.В, Иноземцова Л. О. Популяционно-генетические аспекты микробиологического фенотипа кишечника здорового человека // Журнал микробиологии. - 1995. - № 4. -С. 30-35.
2. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липниц-кий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры кишки человека // Журнал микробиологии. - 2003. - № 1. - С. 60-63.
3. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липниц-кий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта у человека в норме и при патологии // Вестник РАМН. - 2004. - № 2. - С. 43-47.
4. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липниц-кий Е.М. и др. Микробное сообщество пристеночного муцина различных отделов желудочно-кишечного тракта человека // Вестник РАМН. - 2004. - № 4. - С. 23-28.
5. Микрофлора пищеварительного тракта / Под ред. А.И. Хавкина. - М.: "Фонд социальной педиатрии", 2006. - 416 с.
6. Митрохин С.Д., Ардатская Е.В., Никиш-кин Е.В. и др. Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза (дис-биоза) кишечника в клинике внутренних болезней // Методические рекомендации. - М., 1997. - 125 с.
7. Урбах В.Ю. Биометрические методы. - М., 1964. - 214 с.
Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. - М., "Грантъ", 1998. - 158 с.
