CC BY
102
Штамм Streptomyces sp. 17 — продуцент олигомицина SC-II (характеристика продуцента, биологические свойства антибиотика)
М. В. БИБИКОВА', Н. Э. ГРАММАТИКОВА2, И. А. СПИРИДОНОВА', А. Н. ДАНИЛЕНКО3, А. В. КАТЛИНСКИЙ4
' ООО «Виорин», Москва
2 ООО «Олфарм», Москва
3 Институт биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН, Москва
4 НПО «Микроген» МЗ РФ
Streptomyces sp. 17, an Organism Producing Oligomycin SC-II (Culture Characteristics and Antibiotic Biological Properties)
М. V. В1В1КОУА, N. Е. GRAMMATIKOVA, I. А. SPIRIDONOVA, А. N. А. V. КАТ^БКУ
Viorin, Moscow Olfarm, Moscow
N. М. Emmanuel Research Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Science, Моscow Microgen, Moscow
При скрининга продуцентов антибиотиков с гиполипвдемической и антигрибной активностями был отобран штамм Streptomyces sp. 17. Исследованы таксономически значимые характеристики штамма. Наработан комплексный препарат, из которого методами колоночной хроматографии и ВЭЖХ выделены активные соединения — олигомицин А и олигоми-цин SC-II. Установлено, что олигомицин А проявляет более высокую антигрибную активность, а олигомицин SC-II проявляет также умеренную антибактериальную активность.
Ключевые слова: скрининг, актиномицет, таксономия, антибиотическая активность, гиполипидемическая активность.
Under the screening programme for organisms producing substances with hypolipidemic and antifungal activity Streptomyces sp. 17 was isolated. The taxonomic properties of the strain were investigated. Active compounds, i.e. oligomycin A and oligomycin SC-II were isolated from a complex biosynthetic product. Oligomycin A showed high antifungal activity whereas oligomycin SC-II had also moderate antibacterial activity.
Key words: screening, actinomycete, taxonomy, antibiotic activity, hypolipidemic activity.
Комплекс макролидных антибиотиков олиго-мицинов А, В, С и отдельно его компоненты широко используются в исследовательских работах в качестве высокоспецифичных ингибиторов активности Р^-АТФазы [1, 2]. Установлена высокая противоопухолевая и антигрибная активность этих антибиотиков, однако высокая токсичность ограничивает их использование в клинике. Попытки найти менее токсичные новые аналоги этих антибиотиков продолжаются. Описаны близкие по структуре и механизму действия антибиотики апоптолидин, оссамицин, цитова-рицин, олигомицины Б-О , рутамицин В, которые широко исследуются на наборе из 40 клеточных опухолевых линий человека в Национальном
© Коллектив авторов, 2012
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. ООО «Виорин»
институте Здоровья США [3—6]. Проводятся исследования по получению химических модификаций олигомицин А в ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» РАМН [7].
В процессе поиска соединений, проявляющих гиполипидемическую и иммуносупрессив-ную активность, нами был выделен новый продуцент комплекса олигомицинов, одним из компонентов которого является олигомицин 8С-П, описанный ранее в качестве соединения, продуцируемого грамотрицательной бактерией РаШога а^1отггат 8СЯСТ-8А 120 [8].
В статье приводится таксономическая характеристика продуцента Б^грЬту^ угг&таг 17, условия ферментации и выделения олигомицина 8С-П.
Материал и методы
Штамм 31гер1отусв8 Бр. 17 был выделен из почвенного образца Тувы. При изучении систематического положения продуцента использовали определители [9, 10].
Таблица 1. Макроморфологические характеристики культуры Streptomyces sp. 17 при росте на агаризован-ных средах
Среда Диаметр и форма колоний Воздушный Субстратный Растворимый
мицелий мицелий пигмент, цвет
Минеральный агар Гаузе №1 (1 колонии 3—5 мм, круглые Сиренево-серый, Тёмный Отсутствует
выпуклые, слегка складчаше (+) скудный Н7А5 почерневший А2 Д1
Органический Гаузе №2 1 колонии 1—2 мм (+) Отсутствует Жёлто-коричневый П2 Отсутствует
Глицерин-нитратная 1 колонии 3—5 мм, плоские центр приподнят (++) Бело-серый А4-Д3 Тёмно-каштановый О7 Отсутствует
Крахмально-аммиачная 1 колонии 5—6 мм, край в виде валика с плоскими кольцами (+) Пепельный К2 Тёмно-серый до черного А2-А1 Отсутствует
Среда Красильникова (Ср1) 1 колонии 1 мм, неправильной формы с плотным центром (+) Пепельный К2 Пепельный К-2 Отсутствует
Среда Чапека 1 колонии 5—6 мм, плоские с центрическим кольцами (+) Отсутствует Дымчатый Л1 Отсутствует
Мясо-пептонный агар 1 колонии 2—2,5 мм, круглые, плоские (+) Отсутствует Желтоватый П3 Бежевато-розовый О5
Солодовый агар 1 колонии 4—6 мм, сильно приподнятые, аспорогенные, Отсутствует Тёмно-каштановый О7 Отсутствует
складчатые, край фестончатый (++)
Овсяный агар (ISP 3) 1 колонии 5—7 мм, выпуклые Серо-сиреневый Серо-белый Отсутствует
с экссудатом (++) Н7 А5 А6-Д3
Глицерин-аспарагиновый 1 колонии 2—4 мм, выпуклые, Отсутствует Красно-коричневый Красно-
агар (ISP 5) складчатые, центр провален, край фестончатый (+) Л5 коричневый Л5
Примечание. «+» — рост удовлетворительный; «++» — рост хороший; «+++» — рост очень хороший.
Для оценки культурально-морфологических признаков
культуру выращивали при 28°С на агаризованных средах: минеральный агар Гаузе 1, среда Гаузе 2, глицерин-нитратная среда, крахмально-аммиачная среда (ISP 4), среда Чапека с глюкозой, мясо-пептонная среда, солодовый агар, овсяной агар (ISP 3), глицерин-аспарагиновая среда (ISP 5), ISP 2 Учитывали диаметр (d) колонии, цвет и форму воздушного мицелия (ВМ), цвет субстратного мицелия (СМ), наличие растворимого пигмента (РП) на 7-е и 14-е сутки роста.
Определение диаминопимелиновой кислоты в гидролиза-тах целых клеток изучаемого штамма определяли методом восходящей тонкослойной хроматографии в целлюлозном геле [11].
Физиолого-биохимическая характеристику штамма оценивали по: использованию источников углерода, добавленных в среду Предгейма и Готлиба (ISP 9). Образование меланоид-ных пигментов определяли при росте на пептонно-дрожже-вом агаре с железом (ISP 6) и тирозиновом агаре (ISP 7). Оценивали способность к коагуляции и пептонизации молока, способность разжижать желатину.
Микроморфологические исследования штамма осуществляли микроскопированием окрашенных метиленовой синью мазков при увеличении в 40—900 раз с использованием микроскопа МБИ-15У4.2. Споры и вид спороносцев исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (микроскоп AMRAY (США)) при увеличении до 30000 раз (совместно с проф. О.В. Комзолкиной).
Биосинтез антибиотического комплекса. Штамм-продуцент выращивали на агаризованной среде Гаузе 1 в течение 10—14 сут при 28°С. Хранили при +4°С не более 2 месяцев. Биосинтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, заполненных 100 мл питательной среды М-1 [12] в течение 6 сут. при 28°С на качалках с режимом перемешивания 4 с-1.
Образование антибиотического комплекса оценивали по активности ацетоновых экстрактов из мицелия продуцента в отношении Aspergillus niger 137a и по интенсивности пятен, полученных методом ТСХ на пластинках Silufol (Чехия) в системах бензол—ацетон (2:1); этилацетат; этилацетат—изопро-панол (95:5). Пластинки проявляли в парах иода и биопроявлением, с использованием в качестве тест-организма
Aspergillus niger 137a. Активности фракций на пластинке оценивали по диаметрам зон подавления роста тест-организма.
Выделение антибиотиков. По окончании биосинтеза биомассу отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. Нативный раствор отбрасывали. Антибиотический комплекс извлекали из мицелия ацетоном — 3 объёма растворителя на 1 объём биомассы. Экстракт концентрировали на ваку-умно-роторном испарителе (ИР-1) до остатка в виде масла. К масляному концентрату прибавляли избыток петролейного эфира и выдерживали в холодильнике до осаждения препарата. Выпавший аморфный осадок отфильтровывали на стеклянном фильтре и высушивали в вакуум-сушильном шкафу. Полученный антибиотический комплекс был разделен с помощью препаративной ВЭЖХ. Хроматографическая колонка — Zorbax C18 (4,6x250,5 мкм), элюент: метанол — вода (85:15), скорость элю-ции — 0,7 мл/мин, детектирование — УФ-детектор при длине волны 225 нм, объём вводимой пробы 20 мкл при концентрации вещества 300 мкг/мл. В качестве стандарта использовали комплекс олигомицинов фирмы SIGMA, содержащий 60% олиго-мицина А, 30% олигомицина В и 10% олигомицина С.
Определение антибиотической активности. Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар в отношении тест-микроорганизмов: Bacillus subtilis ATCC 6633, Micrococcus luteus 24, Escherichia coli 25922, Staphylococcus aureus 209P, Candida albicans АТСС 885-653, Aspergillus niger 137, Tolypocladium inflatum ВКМ 2223, Fusarium ocsisporum, Curvularia lunata 645, Trichoderma alba F-32.
Результаты и обсуждение
Таксономическая характеристика штамма. На
твёрдых питательных средах культура образует плотные колонии с диаметром от 1 до 7 мм, на большинстве исследованных сред со скудным воздушным мицелием. Форма колоний и вид воздушного мицелия зависели от среды культивирования (табл. 1).
Рис. 1. Электронная микроскопия воздушного мицелия штамма 17.
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия спор культуры 17.
Таблица 2. Физико-химические свойства олигомицинов А и SC-II , продуцируемые штаммом Stгeptomyces sp. 17
Показатель Олигомицин А Олигомицин 8С-П
Внешний вид Порошок белого цвета Порошок белого цвета
УФ-спектр в метаноле, нм 218, 225, 232, 242 218, 225, 232, 242
Молекулярная масса 791 (МН+) 778 (МН+)
ТСХ на пластинках 8Ии!:Ы в системах:
бензол—ацетон (5:1) Я=0,45 Я=0,50
гексан—ацетон (2:1) Я=0,34 Я=0,36
Микроморфологические свойства штамма. При
исследовании световой микроскопией наблюдали разветвлённый субстратный мицелий и воздушный мицелий, на котором формируются спо-роносцы в виде крючков (ЯА, ЯБ) (рис. 1). Спорангии, склероции, подвижные споры отсутствуют. Гидролизат целых клеток штамма содержал только ЬЬ-диаминопимелиновую кислоту.
Сканирующая электронная микроскопия выявила гладкие, овальные споры размером 1,10—1,25 микрон (рис. 2)
Основываясь на полученных результатах штамм 17 был отнесен к роду Strгptomycгs.
Физиологические свойства культуры. Рассматриваемый штамм является аэробом, оптимальная температура для роста 26—28°С. Молоко пепто-низирует, желатину слабо разжижает, крахмал ги-дролизует крайне слабо, меланоидные пигменты образует на тирозиновом агаре ( 18Р7), пептони-зирует и коагулирует молоко.
На среде Предгейма и Готлиба штамм Strгpto-mycгs Бр. 17 умеренно растет только в присутствии Б-мальтозы и Ь-арабинозы, остальные углеводы практически не гидролизуются культурой.
Исходя из полученных данных штамм Strгptomycгs Бр. 17 наиболее близок к S.lavгndulaг и S.virginiaг. Уточнение видовой принадлежности было проведено анализом 168 рибосомальной РНК. Данные будут представлены в отдельном сообщении.
Биосинтез и выделение антибиотического комплекса. Суммарный комплекс олигомицинов нарабатывали в колбах на качалках. Комплекс олигомицинов извлекали из мицелия. Оценку компонентного состава полученного комплекса олигомицинов проводили на пластинках Кизель-гель. . Очистку отдельных компонентов комплекса проводили колоночной хроматографией с последующей очисткой методом ВЭЖХ. Было установлено, что комплекс олигомицинов состоит из компонентов А, 8С-11 в соотношении 90:10. С помощью полупрепаративного ВЭЖХ были получены и охарактеризованы чистые компоненты. В табл. 2 представлены физико-химические свойства компонентов антибиотического комплекса олигомицинов А и 8С-11.
Биологическая активность олигомицинов А и 8С-П. В табл. 3 представлен спектр антибиотической активности исследуемых олигомицинов, свидетельствующий о высокой активности соединений в отношении мицелиальных грибов, при этом олигомицин А имеет более широкий спектр действия. Олигомицин 8С-11, в отличие от одигомицина А, проявляет умеренную активность в отношении бактериальных культур.
Нами было изучено влияние комплексного препарата, выделенного из мицелия штамма Strгptomycгs Бр. 17, на уровень общего холестерина и липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови кроликов с эксперименталь-
Таблица 3. Антибиотическая активность олигомицинов А и SC-II
Тест-микроорганизм
Олигомицин А
Олигомицин SC-II
Aspergillus niger13l a Aspergillus fumigatus 132a Tolypocladium inflatum Fusarium oxysporum Curvularia lunata 645 Trichoderma alba F-32 Penicillium brevicompactum 234 Candida albicans ATCC 885-653 Bacillus subtilis ATCC 663 Bacillus cereus var. micrococcus luteus 53l Bacillus cereus var. mycoides HB Bacillus pumilis NCTC 8241 Bacillus subtilis var .H2 Escherichia coli 25922 Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus 6538
0,5 1,5 1 1
0,5 0,5
10
0,5
x >100
>50 >50 >50 >50 >50
Таблица4. Влияние препарата № 17 и ловастатина на уровень ОХ и ЛПВП в сыворотке крови кроликов
Препарат Концентрация препарата, Максимальное снижение Максимальное увеличение
мг/кг уровня общего холестерина, % уровня ЛПВП, %
Ловастатин 4
Препарат № 17 0,04
ной гиперхолестеринемией [13]. Было установлено, что в концентрации в 100 раз более низкой, чем субстанция ловастатина, комплексный препарат 17 проявлял выраженный гиполипидемический эффект. Результаты представлены в табл. 4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Smith R. M. Oligomycin, a new antifungal antibiotic. Antibiot Chemother 1954; 4: 962.
2. Бибикова M. В., Грамматикова H. Э. и др. Механизм биологической активности макролидных антибиотиков — ингибиторов F0F1-ATFase. Антибиотики и химиотер 2003; 6: 25—32.
3. Nakakita Y, Nakagawa M, Sakai H.Isolation of oligomycin A as a result of screening for antagonists of lipids. J Antibiot 1980; 33: 514—516.
4. Yamazaki M, Yamashita T, Harada T. et al. 44-Homooligomycins A and B, new antitumor antibiotics from Streptomyces bottropensis. Producing organism, fermentation, isolation, structure elucidation and biological properties. J Antibit1992; 45: 171—179.
5. Дриняев В. А., Кругляк E. Б, Аппинянская Л. М. и др. Streptomyces avermytilis — продуцент олигомицина. Биотехнология 1994; 7: 30—35
6. Enomoto Y, Shiomi K, Matsumoto A. et al. Isolation of a new antibiotic oligomycin G produced by Streptomyces sp. WK-6150. J Antibit 2001; 54: 3: 308—313.
53,50 17,77
38,6 26,43
Заключение
В процессе поиска микроорганизмов — продуцентов антибиотиков с гиполипидемической и антигрибной активностью был выделен штамм Streptomyces sp. 17, продуцирующий комплекс ма-кролидных антибиотиков олигомицин А и олиго-мицин SC-II.
7. Тренин А. С. Поиск микробных метаболитов — ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков. Автореф. дис. д.б.н., 2012.
8. Реферат заявки Японии JP.09 208587 (опубл. 12.08.1997)
9. Гаузе Г. Ф, Преображенская Т. П., Свешникова М. А. и др. Определитель актиномицетов. М.: 1983.
10. Actinomycete taxonomy / ed. Dietz A, Thayer D.W. The Upjohn Company «All Rights Reserved». 1980.
11. Hasegawa T, Takisawa M, Tanida S. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes. J Gen. Appl. Microbiol 1983; 29: 1319—1322.
12. Бибикова M. В., Селехова Г. H, Востров С. Н, Фишман А. А. Оптимизация состава ферментационной среды для выделения продуцентов антибиотиков из микромоноспор. Антибиотики 1981; 12: 899—904
13. Чмелъ Я. В., Бибикова М. В. и др. Скрининг природных соединений с гиполипидемической активностью. Антибиотики и химио-тер 2004; 8—9: 8—12.
