CC BY
75
УДК 579.61; 571.27; 57.083
Каримов И.Ф.1, Манухов И.В.2, Иванов Ю.Б.3, Дерябин Д.Г.1
1Оренбургский государственный университет 2ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»
3Областная общественная организация «Ассоциация молодых ученых и специалистов»
Е-mail: [email protected]
ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ВКПМ B-10548 И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ
Сконструирован рекомбинантный штамм Bacillus subtilis, несущий плазмиду с /uxAS-генами грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi, перед каждым из которых интродуцирован рибосом-связывающий сайт, характерный для грамположительных бактерий. Полученный штамм, характеризующийся высоким уровнем трансляции генов бактериальной люциферазы, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № B-10548. При оценке реакции B.subtilis ВКПМ B-10548 на воздействие сывороток крови различного компонентного состава показано соответствие подавления биолюминесценции уровню бактерицидного эффекта, преимущественно определяемому активностью бета-лизина.
Ключевые слова: биолюминесценция, lux-гены, Bacillus subtilis, бактерицидный эффект, бета-
лизин.
Бактерицидные начала сыворотки крови являются одним из важных компонентов системы естественного врожденного иммунитета [1]. При этом уже на ранних этапах своего изучения они были принципиально разделены на два основных фактора: термолабильный «альфа-лизин» и термостабильный «бета-лизин». Позднее первый из них был идентифицирован как система комплемента, каскадная активация которого ведет к эффективному лизису грамотрицательных микроорганизмов [2], а второй, проявляющий наибольшую активность в отношении аэробных грамположи-тельных спорообразующих микроорганизмов, стал все чаще ассоциироваться с катионными антимикробными пептидами тромбоцитарного происхождения [3].
Начиная с середины XX века, исследование активности бета-лизина в сыворотке крови и других биологических жидкостях человека и животных стало распространенным подходом при решении вопросов дифференциальной диагностики, прогнозирования и контроля различных патологических и физиологических состояний [4]. При этом лабораторные методы качественного выявления и количественной оценки присутствия бета-лизина традиционно основывались на исследовании его ингибирующего влияния на жизнеспособность тестерных штаммов вида Bacillus subtilis, проявляющих наибольшую чувствительность к данному бактерицидному фактору [4, 5]. Однако, к настоящему моменту в силу своей значительной продолжительности и трудоемкости данные методы перестали соответствовать требованиям к современным лабораторным технологиям, что начало существенно огра-
ничивать их востребованность в современной медицине и ветеринарии.
Одним из возможных решений данного вопроса может стать использование в качестве объекта воздействия специальных генномодифициро-ванных микроорганизмов с генами биолюминесценции - свечения, возникающего в ходе биохимических реакций, изменение интенсивности которого оказывается пропорциональным развивающемуся в подобных условиях бактерицидному эффекту [6]. Сказанное способно исключить необходимость дополнительного культивирования бактериальной биомассы после контакта с бактерицидными началами сыворотки крови, заменив его на количественную регистрацию интенсивности биолюминесценции тестерного штамма, что сообщает лабораторной технологии необходимую экспрессность, включая возможность оценки развития бактерицидного эффекта в режиме реального времени [7].
В этой связи целью настоящей работы явилось конструирование оригинального люминесци-рующего штамма Bacillus subtilis, эффективно экспрессирующего гены бактериальной биолюминесценции, а также оценка возможности его использования для исследования бактерицидной активности сыворотки крови в сравнении с традиционным методом оценки присутствия бета-лизина в данной биологической жидкости.
При проведении работ в обозначенном направлении в качестве матрицы для получения фрагментов ДНК с генами бактериальной биолюминесценции использована плазмида, содержащая полную кассету lux-генов природного морского люминесци-рующего микроорганизма Photobacterium leiognathi,
любезно предоставленная EЛ.Meighen (США) [8]. В свою очередь в качестве инструмента для клонирования данных генов использован Т-вектор на основе рлазмиды рТ757Я (Регшеп1а8, Литва), а также челночные плазмиды рЬП4 и рЬ¥22, способные реплицироваться в широком круге хозяев.
Фрагменты ДНК, содержащие гены /ихА и 1ихВ, кодирующие альфа- и бета-субъединицы бактериальной люциферазы - ключевого фермента бактериальной биолюминесценции, были амп-лифицированы с использованием праймеров:
1ихА
LuxADir 5 ’ - GCGTCTCAGЛГCGGAAGGTGGAAGAAATAATGAAAATTAGTAATATC - 3’ LuxARev 5’ - GCGTCTCGЛCGTCATAGTTTAAAAAGAACAGCTTACTGAGG - 3’
1ихВ
LuxBDir 5’ - GCGTCTCGACGTCGAAGGTGGAATAAAATATGAATTTCGGGTTATTTTTC - 3’ LuxBRev 5’ - GCGTCTCCAATTGCCGTAATTAAATTATTTAATAAGGTTATC - 3’
важной особенностью которых являлось присутствие рибосом-связывающего сайта грамположи-тельных бактерий (подчеркнут), последовательность которого взята из работы [9]. Кроме того, к 5' концам всех праймеров была добавлена последовательность сайта эндонуклеазы рестрикции БзтЫ (помечена жирным шрифтом), обеспечивающая возможность последующего лигирования продуктов амплификации.
Очищенные при помощи элюции из геля фрагменты ДНК были рестрицированы и лигированы, после чего из полученной лигазной смеси ампли-фицированы фрагменты ДНК, содержащие искомые гены в последовательности 1ихЛБ. В свою очередь клонирование полученных ПЦР-продуктов в Т-векторе привело к созданию первичной плазмиды рТ1/ихЛБ, трансформация которой штамма Е. ооН МС1061 сообщала последнему способность к выраженной биолюминесценции при добавлении субстрата данной реакции - длинноцепочечного альдегида п-деканаля.
С целью интеграции /ихЛБ-генов в клетки Б. зиЫйк они по сайтам Р&1 и ЕооШ были переклони-рованы из рТИихЛБ в челночные вектора рЬП4 и рЬ¥22. При этом, несмотря на исходную предпочтительность использования последнего (меньший размер - 2,7 кЬ против 3,5 кЬ урЬП4, а также возможность транскрипции клонированных генов с более сильного промотора РгерЛ), созданная на его основе плазмида рЬЕ22/ихЛБ характеризовалась сниженной копийностью и стабильностью, что могло объясняться проявлением т.н. «полярного» эффекта при клонировании значительного (более 2000 п.н.) фрагмента ДНК с генами /ихЛБ между герЛ и герБ генами репликона. В свою очередь перенос сформированной гибридной плазмиды рЬП4/ихЛБ в клетки Б. ий/ж 168 с последующим высевом бактериальной биомассы на ЬБ-агар с 25 мкг/мл канамицина позволил получить рекомбинантный штамм Б. мЪИ/к 168 рЬП4/ихЛБ с высоким уровнем трансляции кон-
ститутивно транскрибируемых luxAB-генов, интенсивность свечения которого при добавлении n-де-каналя в концентрации 7х10-6 М. не менее чем в 10 раз превышала таковую у сконструированного ранее B.subtilis В-10191 с немодифицированными lmAB-генами V. fischeri [10].
Таким образом, первым результатом проведения настоящей работы стало создание рекомбинантного люминесцирующего штамма B. subtilis, несущего luxAB-гены морского микроорганизма P. leiognathi, перед каждым из которых интродуци-рован рибосом-связываяющий сайт, характерный для грамположительных бактерий, что обеспечивает достаточно высокий уровень трансляции конститутивно транскрибируемых генов бактериальной лю-циферазы. Данный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика, Москва) под № B-10548.
Последующее исследование данного штамма включало оценку его реакции на воздействие 43 индивидуальных образцов сыворотки крови человека различного компонентного состава. При этом B. subtilis ВКПМ B-10548 выращивали в течение 48 часов на LB-агаре при 30 °С в присутствии селективного фактора (40 мкг/мл канамицина), смывали стерильным LB-бульоном и стандартизировали до оптической плотности 1,2 ед. при 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Полученную биомассу в соотношении 1:1 смешивали с исследуемыми образцами сыворотки крови или 0,85% раствора NaCl (контроль), после чего на 0 и 30 минутах инкубации при 37оС из полученных смесей отбирали аликвоты по 250 мкл, в которые вносили по 2 мкл деканаля. Регистрацию интенсивности свечения осуществляли на люминометре «Биотокс-7» (ООО «Нера», Россия). Параллельную оценку развития бактерицидного эффекта и количественного присутствия в исследуемых сыворотках крови бета-лизина проводили по методам [4, 7].
Полученные результаты позволили констатировать, что контакт B. subtilis ВКПМ B-10548 с использованными образцами сыворотки крови во всех случаях вел к выраженному подавлению уровня свечения, к 30-й минуте контакта переводящему его в относительно узкий диапазон 64,52 -79,42 % от контрольных значений (рисунок 1А). В свою очередь параллельно оцененное бактериологическим методом количество клеток, сохранивших свою жизнеспособность при подобном воздействии, позволило зафиксировать сходное ассиметричное распределение результативного параметра, характеризующегося достоверным положительным коэффициентом корреляции (r=0,372; P<0,05) со значениями остаточной био-
Проблемы экологии Южного Урала
40 -
20 -
Уровень подавления биолюминесценции, %
Активность бета-лизина, отн. ед.
Рисунок
1. Частотное распределение величин подавления люминесценции Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 (А) и ее зависимость от активности бета-лизина в исследуемых образцах сыворотки крови (Б)
люминесценции. С другой стороны, интенсивность подавления свечения достоверно коррелировала (г=0,481; Р<0,01) с количественным присутствием в 43 исследуемых сыворотках бета-лизина (рисунок 1Б), тем самым хорошо соответствуя представлениям о биологической активности названного фактора [4, 5].
Описанные особенности реактивности B.subtilis ВКПМ В-10548 определяют перспективу его включения в состав панели бактериальных люминесцирующих биосенсоров, ориентированных на оценку входящих в систему естественного врожденного иммунитета бактери-
цидных начал сыворотки крови, в том числе с акцентом на выявление активности бета-лизина. При этом единым принципом функционирования подобной диагностической панели должна стать количественная оценка подавления свечения бактериальных клеток-мишеней в присутствии исследуемой сыворотки крови, а требования к ее составу определяться наличием рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов, особенности строения поверхностных структур каждого из которых позволят относительно специфично оценивать состоятельность определенной бактерицидной системы.
14.11.11
Список литературы:
1. Cooper, E. L. Comparative immunology [Текст] / E.L. Cooper // Curr. Pharm. Des. - 2003. - Vol. 9. - N 2. - P. 119-131.
2. Dunkelberger, J.R. Complement and its role in innate and adaptive immune responses [Текст] /J.R. Dunkelberger, W.-C. Song // Cell Research. - 2010. - Vol. 20. - N 1. - P. 34-50.
3. Бухарин, О.В. Свойства и функции тромбоцитарного катионного белка [Текст] / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Успехи современной биологии. - 1998. - N 2. - С.194-204.
4. Бухарин, О.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине [Текст] / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев // Томск, Изд-во ТГУ. - 1977. - 190 с.
5. Саруханов, В.Я. Метод определения бета-литической активности крови сельскохозяйственных животных [Текст] / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, П.Г. Царин // Сельскохозяйственная биология. - 2007. - № 4. - С. 123-125.
6. Дерябин, Д.Г. Причины, определяющие характер изменения бактериальной люминесценции при воздействии сыворотки крови [Текст] / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков // Микробиология. - 2005. - Т. 74. - № 2. - С. 191-197.
7. Дерябин, Д.Г. Определение бактерицидной активности сыворотки крови в режиме реального времени с использованием рекомбинантных люминесцирующих бактерий [Текст] / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков // Бюлл. экспериментальной биол. и мед. - 2006. - N 8. - С.200-204.
8. Lee, C.Y.
9. The lux genes of the luminous bacterial symbiont, Photobacterium leiognathi, of the ponyfish. Nucleotide sequence, difference in gene organization, and high expression in mutant Escherichia coli [Текст] / C.Y. Lee, R.B. Szittner, E.A. Meighen //
10. Eur. J. Biochem. - 1991. - Vol.201. - N 1. - P. 161-167.
9. Francis, K.P. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct [Текст] / K.P. Francis, D. Joh, C. Bellinger-Kawahara, M.J. Hawkinson, T.F. Purchio, P.R. Contag // Infect. Immun. - 2000. -Vol. 68. - N 6. - P. 3594-3600.
10. Каримов, И.Ф. Особенности люминесцентного отклика рекомбинантного штамма Bacillus subtilis с клонированными luxAB-генами Vibrio fisheri при воздействии термостабильных компонентов сыворотки крови [Текст] / И.Ф. Каримов, И.В. Манухов, В.Ю. Котова, Д.О. Омельченко, Д.Г. Дерябин // Биотехнология. - 2010. - №2 - С.25-30.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (контракт № П327) и гранта Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 11-04-97064-р_поволжье_а)
Сведения об авторе: Каримов Ильшат Файзелгаянович, доцент кафедры микробиологии химико-биологического факультета Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук, e-mail: [email protected] Оренбург, пр. Победы, д. 13, корп. 16, ауд. 306 Манухов Илья Владимирович, ведущий научный сотрудник ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», доктор биологических наук, e-mail: [email protected] Москва, 1-ый Дорожный пр-д., д. 1, ком. 3302 Иванов Юрий Борисович, председатель Областной общественной организации «Ассоциация молодых ученых и специалистов», кандидат медицинских наук, старший научный
сотрудник, e-mail: [email protected] Оренбург, ул. Пионерская, д. 11, ком. 305 Дерябин Дмитрий Геннадьевич, заведующий кафедрой микробиологии химико-биологического факультета Оренбургского государственного университета, доктор медицинских наук, профессор,
e-mail: [email protected] Оренбург, пр. Победы, д. 13, корп. 16, ауд. 209
UDC 579.61; 571.27; 57.083
Karimov I.F.1, Manukhov I.V.2, Ivanov Y.B., Deryabin D.G.1
1Orenburg State University; 2Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, e-mail: [email protected]
BACILLUS SUBTILIS VKPM V-10548 STRAIN AND IT APPLICATION FOR SERUM BLOOD BACTIRICIDAL ACTIVITY RESEARCH
The recombinant Bacillus subtilis strain carrying plasmid with gram-negative sea microorganism Photobacterium leiognathi luxAB genes, before each introduced gram-positive bacteria ribosome-binding site is designed. This strain characterized by high gene expression level of bacterial luciferase and was deposited in the Russian National Collection of Industrial Microorganisms under № V-10548. In researching of B.subtilis VKPM V-10548 reaction in contact with different component serum blood probes the correspondence between bioluminescence suppression and bactericidal effect level mainly determined by beta-lysine activity is shown.
Key words: bioluminescence, lux-genes, Bacillus subtilis, bactericidal effect, beta-lysine
References:
1. Cooper, E. L. Comparative immunology [Text] / E.L. Cooper // Curr. Pharm. Des. - 2003. - Vol. 9. - N 2. - P. 119-131.
2. Dunkelberger, J.R. Complement and its role in innate and adaptive immune responses [Text] / J.R. Dunkelberger, W.-C. Song // Cell Research. - 2010. - Vol. 20. - N 1. - P. 34-50.
3. Bukharin, O.V. Property and functions of plateletic cationic protein [Text] / O.V. Bukharin, K.G. Suleyimanov // Progress of modern biology. - 1998. - N 2. - P. 194-204.
4. Bukharin, O.V. System of beta-lysine and its role in clinical and experimental medicine [Text] / O.V. Bukharin, N.V. Vasilyev // Tomsk, Publisher TSU. - 1977. - 190 p.
5. Sarukhanov, V.Ya. Method of detection beta-lysin activity of agricultural animals blood [Text] / V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov. P.G. Carin // Agricultural biology. - 2007. - N4. - P. 123-125.
6. Deryabin, D.G. Causes determining character of bacterial luminescence changing on serum blood influence [Text] / D.G. Deryabin, E.G. Polyakov // Microbiology. - 2005. - Vol. 74. - N 2. - P. 191-197.
7. Deryabin, D.G. On-line determination of serum bactericidal activity using recombinant luminescent bacteria [Text] / D.G. Deryabin, E.G. Polyakov // Bulletin of experimental biology and medicine - 2006. - N 8. - P. 200-204.
8. Lee, C.Y
The lux genes of the luminous bacterial symbiont, Photobacterium leiognathi, of the ponyfish. Nucleotide sequence, difference in gene organization, and high expression in mutant Escherichia coli [Text] / C.Y Lee, R.B. Szittner, E.A. Meighen // Eur. J. Biochem. - 1991. - Vol.201. - N 1. - P. 161-167.
9. Francis, K.P. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct [Text] / K.P. Francis, D. Joh, C. Bellinger-Kawahara, M.J. Hawkinson, T.F. Purchio, PR. Contag // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68. - N 6. - P. 3594-3600.
10. Karimov, I.F. Peculiarities of luminescent response of Bacillus subtilis recombinant strain bearing cloned Vibro harveyi lux AB genes to the action of thermostable blood serum compounds [Text] / I.F. Karimov, I.V. Manukhov, V.Yu. Kotova, D.O. Omel’chenko, D.G. Deryabin // Biotechnology. - 2010. - N 2 - P. 25-30.
