CC BY
14
УДК 664.951.7:639.4
Сезонные изменения
протеолитической активности и реологических характеристик тканей дальневосточного трепанга
А. Д. Перцева, Ю. М. Позднякова, канд. техн. наук, Н. Н. Ковалев, д-р биол. наук, Р. В. Есипенко, М. Е. Гаркавец
Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет
Дальневосточный трепанг (ДроБИсИориБ ]аротсиБ) является эпибентосным видом с продолжительностью жизни около четырех лет. За этот период трепанг испытывает широкий диапазон изменения температурного воздействия и пищевых ресурсов [1]. Сезонные изменения температуры воды и структуры пищи являются основным фактором, влияющим на биохимический состав морских организмов. [2]. В свою очередь, химический и ферментный состав тканей гидробионтов оказывают влияние на товарный вид и качество продуктов, получаемых из них.
Известно, что техно-химические характеристики голотурий зависят от сезона вылова объекта [3,4]. Так, подвержены сезонным изменениям такие показатели как содержание воды, липидов, белка, минеральных веществ, гексозаминов [4].
Важными в производстве пищевой продукции из трепанга являются структурные показатели его мышечной ткани, которые зависят, в первую очередь от содержания воды. Основная проблема использования голотурий для пищевой продукции заключается в том, что после вылова мышечная ткань вследствие
посмертных изменений очень быстро теряет свои упруго-эластичные свойства и переходит в стадию автолиза, при которой происходит разжижение и размягчение мышечной оболочки и теряется товарный вид продукта [3]. Биохимической причиной данного процесса является активность про-теаз в тканях.
Так, было установлено, что оптимальными условиями протеолиза не-коллагеновых белков голотурий являются температура 46,3 °С и рН 6.1. Процесс ингибировался йодуксусной кислотой и антипаином, что позволяет предположить участие цистеи-новых протеаз в протеолизе неколла-геновых белков мускульного мешка трепанга [5].
Целью настоящей работы являлось определение активности протеолити-ческих ферментов в мышечной ткани и внутренностях дальневосточного трепанга, а также реологических показателей мышечной ткани трепанга сырца в разные сезоны вылова.
Материалы и методы
Объектом исследования служил дальневосточный трепанг, выловленный в бухте Северная (залив Славянский) Японского моря с апреля
апрель май июнь июль август сентябрь
Рис. 1. Сезонные изменения протеолитической активности внутренностей трепанга
по сентябрь 2015 г. Протеолитическую активность ферментных препаратов определяли по методу Каверзневой [6]. Реологические исследования проводили на свежевыловленном трепанге весенне-осеннего периода 2015 г. Предельное напряжение сдвига определяли после помещения трепанга в льдо-солевую смесь на 15 мин. Исследования проводились на коническом пластометре КП-3.
Предельное напряжение сдвига (ПНС, Па) определяли по зависимости П. А. Ребиндера:
ПНС = Km/h2,
где К - константа используемого индентора (2,13 Н/кг); m - рабочая масса подвижной части прибора (0,1 кг); h - максимальная глубина погружения индентора в продукт при заданной массе (m), когда наступает равновесие сил тяжести и сопротивления измеряемого объекта.
Соматический индекс (СИ) рассчитывали как соотношение массы тела к его длине.
Результаты и обсуждение.
У пойкилотермных животных с чередованием покоя и активности интенсивность биохимических процессов имеет выраженный сезонный характер. С целью выявления данной закономерности для трепанга проведено определение протеолитиче-ской активности внутренностей (пищеварительного тракта) в весенне-осенний период. Полученные данные (рис. 1) свидетельствуют, что активность протеаз во внутренностях трепанга значительно варьирует в течение весенне-осеннего сезона. Так, ранней весной (апрель) наибольшая активность отмечена для щелочных протеаз (0,43 ПЕ/г ткани). В остальные сезоны вылова наибольшую активность проявляют кислые протеазы (от 0,075 до 0,352 ПЕ/г). Значимая активность нейтральных протеаз отмечается только в мае и сентябре месяце (0,104 и 0,099 ПЕ/г).
Динамика изменений показателей активности ферментов показывает, что активность щелочных протеаз к середине лета (июль) практически отсутствует и проявляет тенденцию к восстановлению в августе. Аналогичная закономерность отмечается и для кислых протеаз.
Выявленные закономерности изменения активности протеолитических ферментов совпадает с репродуктивным циклом трепанга. В период нереста (июнь-июль) активность метаболизма трепанга снижается, о чем свидетельствует снижение активности пищеварительных ферментов.
Известно, что внутренности голотурий - это кишечник с содержимым (пищевыми остатками, илом). Основу выстилки кишечника составляют везикулярные энтероциты, функцией которых является продуцирование пищеварительных ферментов [7]. Кроме этого, исследования качественного и количественного состава, а также биохимических свойств бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга [8] показали, что среди представителей микрофлоры трепангов, обитающих в различных районах Японского моря, наличие протеолитической активности от 0,106 до 0,237 ПЕ/г было выявлено у нескольких штаммов бактерий.
Кроме того, в пищеварительном тракте трепанга обнаружены кислые протеиназы с оптимумом рН 2,0 и 5,0, и щелочной протеиназы - при рН 8,0 и 13,5. Результаты денатурирующего электрофореза при наличии или без ингибиторов протеазы подтвердили существование по крайней мере трех протеаз с молекулярной массой от 20,6, 39,1 и 114,1 кДа [9].
Таким образом, протеолитическая активность внутренностей дальневосточного трепанга может обеспечиваться как эндогенными ферментами, вырабатываемыми везикулярными энтероцитами, так и деятельностью микроорганизмов, обитающих в микрофлоре кишечника.
Сезонная динамика изменения протеолитической активности в мышечной ткани трепанга представлена на рис. 2.
Общая тенденция изменения активности ферментов мышечной ткани описывает ее увеличение к середине лета (июль) с последующим снижением к сентябрю и, очевидно, на протяжении всего зимнего перода. Отмечено, что в весенние месяцы в мускульной ткани трепанга превалирует активность нейтральных про-теаз, в то время как в летне-осенний период наиболее высока активность кислых протеаз. Показатель активности в летне-осенний период для кислых протеаз снижается в 3,5 раза, для нейтральных - в 1,5 раза.
Таким образом, для протеолитиче-ских ферментов мускульного мешка выявлен пик максимальной их активности в июле. Полученные данные согласуются с данными, приведенными китайскими авторами, которые выделили и очистили катепсин^ из мускульного мешка трепанга БИсИориБ ]аротсиБ. Свойства фермента оказались во многом схожи с катепсинами карпа и камбалы [10].
Катепсин L является представителем эндогенных термостойких
ENGINEERING AND TECHNOLOGY
апрель май июнь июль август сентябрь
Рис. 2. Сезонные изменения протеолитической активности в мышечной ткани трепанга
400
ПНС, Па СИ
-Линия тренда ПНС,Па
----Линия тренда СИ
'//......
24.06. 15.07. 08.0В. 18.09.
Рис. 3. Зависимость предельного напряжения сдвига (ПНС) мышечной ткани трепанга от соматического индекса (СИ) особей
протеаз, которые могут играть важную роль в процессах автолиза. рН-оптимум этого фермента равняется 5. Обнаруженная нами активность протеолитических ферментов в кислой и нейтральной области рН, по-видимому, обеспечивается присутствием катепсинов.
Проведенное исследование показывает, что динамика сезонных изменений активности ферментов во внутренностях и мускульном мешке трепанга происходит разнонаправленно. Очевидно, уровень активности фермента является отражением процессов катаболизма и анаболизма трепанга в указанный период.
Активность протеолитических ферментов можно сопоставить с соматическим индексом ( (СИ) - соотношение массы и длины, а также с реологическими характеристиками (предельное напряжение сдвига -ПНС) тела свежевыловленных особей трепанга.
Известно, что нормальная вязкость стенки тела БИсИориБ ]аротсиБ
Бе1епка варьирует от 80 до 350 Па^с. Среднее значение составляет 110 Па^с. Значение величины вязкости зависит от района вылова трепанга и состава среды. Так, искусственная морская вода с повышенным уровнем концентрации калия обратимо увеличивает вязкость в 3 раза [11].
Анализ экспериментальных данные свидетельствуют о наличии двух пиков СИ трепанга: во второй декаде июня и середине июля (рис. 3). Следует отметить, что наибольшим значениям СИ соответствуют минимальные значения ПНС. Поскольку ПНС как комплексный показатель зависит от химического состава и структурных характеристик объекта, можно предположить, что его изменения связаны с периодом вымета гамет трепангом, что сопровождается изменением биохимического состава его тканей.
Таким образом, выявленный пик активности в летние месяцы нейтральных и кислых протеаз мышечной ткани дальневосточного трепанга
(который, скорее всего, обеспечивается действием катепсинов, играющих немаловажную роль в процессах автолиза ткани) объясняет снижение реологических характеристик (предельное напряжение сдвига) в данный период года. Полученные данные необходимо учитывать при вовлечении трепанга-сырца в промпереработку.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gao, F. Seasonal biochemical changes in composition of body wall tissues of sea cucumber Apostichopus japonicas/F. Gao, Q. Xu, H. Yang // Chines Journal of Oceanology and Limnology. - 2011. -V. 29. - № 2. - P. 252-260.
2. Dunstan, G. A. Major environmental and biological factor influencing the fatty acid composition of seafood from Indo-Pasific to Antarctic waters/G. A. Dunstan, J. Olley, D. A. Ratkowsky // Lipids. -1999. - V. 3. - P. 63-86.
3. Слуцкая, Т. Н. Исследования по химии и технологии трепанга и кукумарии:
дис____ канд. техн. наук Т. Н. Слуцкая. -
Владивосток, 1974.
4. Тимчишина, Г. Н. Обоснование технологий пищевых добавок из кукумарии (Cucumaria japonica) на основе комплексного использования сырья: автореф. дис. ... канд. техн. наук. -Владивосток, 1999. - 24 с.
5. Hai-Tao Wua, b, Dong-Mei Lia, b, Bei-Wei Zhua, b,,, Jin-Jian Suna, Jie Zhengc, Feng-Lin Wanga, Kunihiko Konnod, Xi Jiangai Proteolysis of noncollagenous proteins in sea cucumber, Stichopus japonicus, body wall: Characterisation and the effects of cysteine protease inhibitors // Food Chemistry Volume 141, Issue 2, 15 November 2013, Pages 1287-1294.
6. Каверзнева, Е. Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз/Е. Д. Каверзнева // Прикладная биохимия и микробиология. - 1971. -Т. 7. - № 2. - С. 225-228.
7. Каменев, Я. О. Ультраструктура внутренних органов, бесполое размножение и регенерация у голотурии Cladolabes schmeltzii: дисс____канд. биол. наук/Я. О. Каменев. - Владивосток, 2013. - 121 с.
8. Богатыренко, Е. А. Характеристика культивируемых гетеротрофов микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга Apostichopus Japonicus: дисс. ... канд. техн. наук. -Владивосток, 2013. - 128 с.
9. Xue Y.F., Chang H.X., Ben C.M., Zhao J.L., Wen G.Y., Dong F.W. Study of a highly alkaline protease extracted from digestive tract of sea cucumber (Stichopus japonicus) // Food Research International Volume 38, Issue 3, April 2005, Pages 323-329..
10. Zhou D.Y., Chang X.N., Bao S.S., Song L., Zhu B.W., Dong X.P., Zong Y., Li D.M., Zhang M.M., Liu Y.X., Murata Y. Purification and partial characterisation of a cathepsin L-like proteinase from sea cucumber (Stichopus japonicus) and its tissue distribution in body wall // Food Chemistry. 2014. Vol. 158. P. 192-199.
11. Motokawa Tatsuo. The viscosity change of the body-wall dermis of the sea cucumber Stichopus japonicus caused by mechanical and chemical stimulation // Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. - Volume 77, Issue 3. -1984. - Pages 419-423.
Сезонные изменения протеолитической активности и реологических характеристик тканей дальневосточного трепанга
Ключевые слова
голотурии; мышечная ткань; реологические свойства; протеазы; трепанг
Реферат
Исследована активность протеолитических ферментов внутренностей трепанга в весенне-осенний период. Выявлено, что наибольшая активность характерна для щелочных протеаз ранней весной. В остальные сезоны вылова высокий уровень активности наблюдается для кислых протеолитических ферментов. Значимая активность нейтральных протеаз отмечается только в мае и сентябре. Показано, что активность щелочных протеаз к середине лета (июль) практически нулевая и, проявляет тенденцию к восстановлению только в августе. Аналогичная закономерность отмечена для кислых протеаз. Обнаружено, что изменения активности протеолитических ферментов совпадают с репродуктивным циклом трепанга. В период нереста (июнь-июль) активность метаболизма трепанга снижается, о чем свидетельствует снижение активности пищеварительных ферментов. На основании анализа литературы и собственных данных выдвинуто предположение, что протеолитическая активность внутренностей дальневосточного трепанга может обеспечиваться как эндогенными ферментами, вырабатываемыми везикулярными энтероцитами, так и деятельностью микроорганизмов, обитающих в микрофлоре кишечника. Исследована активность протеаз мышечной ткани трепанга, выловленного с апреля по сентябрь. Наблюдается общая тенденция увеличения активности ферментов мышечной ткани к середине лета (июль) с последующим снижением к сентябрю. Отмечено, что в весенние месяцы в мускульной ткани трепанга преобладает активность нейтральных протеаз, в то время как в летне-осенний период наиболее высока активность кислых протеаз. Полученные данные согласуются с данными, проведенными китайскими авторами, которые выделили и очистили катепсин^ из мускульного мешка трепанга Б^сИориБ ]аротсиБ. Выдвинуто предположение, что обнаруженная активность протеолитических ферментов в кислой и нейтральной области рН обеспечивается присутствием катепсинов. Активность протеолитических ферментов сопоставлена с соматическим индексом и реологическими характеристиками (предельное напряжение сдвига) тела свежевыловленных особей трепанга. Полученные данные свидетельствуют о наличии двух пиков показателей соматического индекса во второй декаде июня и середине июля. Наибольшим значениям соматического индекса соответствуют минимальные значения предельного напряжения сдвига. Сделано заключение, что изменения реологических характеристик связаны с периодом вымета гамет трепангом, что сопровождается изменением биохимического состава его тканей.
Seasonal Changes in Proteolytic Activity and Rheological Characteristics of the Tissues of the Far Eastern Trepang
Key words
sea cucumbers; the muscle tissue; rheological properties; protease; trepang Abstracts
Activity of proteolytic enzymes was studied in entrails of sea cucumber in the spring and autumn period. It was found that the greatest activity has been characterized by alkaline proteases in the early spring. The high level of activity observed for acidic proteolytic enzymes remaining in catch seasons. Significant activity of neutral protease has been observed only in May and September. It has been shown that the activity of alkaline proteases by midsummer (July) is almost zero, and has a tendency to recovery in August. A similar pattern observed for acid proteases. It was found that changes in the activity of proteolytic enzymes was coincided with the reproductive cycle of sea cucumber. The activity of sea cucumbers metabolism was decreases during the spawning period (June-July), as evidenced by the decrease in the activity of digestive enzymes. Based on the analysis of literature sources was suggested that the proteolytic activity of the viscera of the Far Eastern sea cucumber can be provided as an endogenous enzyme produced vesicular enterocytes, and micro-organisms that live in the intestinal microflora. The activity of proteases in muscle tissues of sea cucumber, fish caught from April to September was investigated. The general trend of increasing the activity of enzymes in muscle tissue by mid-summer (July), followed by a decrease in September was observed. It is noted that during the spring months in the muscle tissue of sea cucumber predominant activity of neutral proteases, while in the summer-autumn period, the highest activity of acidic proteases. These findings are consistent with the data, carried out by Chinese authors that isolated and purified cathepsin-L bag of muscular sea cucumber Stichopus japonicus. It is suggested that the observed activity of proteolytic enzymes in the acidic and neutral pH ranges, by the presence of cathepsins. Activity of proteolytic enzymes compared with somatic index and rheological properties (shear stress limit) of the body freshly caught sea cucumber species. The findings suggest that there are two peaks of physical indicators index in mid-June and mid-July. The greatest value of somatic index values correspond to the minimum limit of shear stress. It was concluded that changes in the rheological properties associated with the period of gamete balayage sea cucumber, which is accompanied by changes in the biochemical composition of its tissues.
Авторы
Перцева Анна Дмитриевна, Позднякова Юлия Михайловна, канд. техн. наук, Ковалев Николай Николаевич, д-р биол. наук, Есипенко Роман Владимирович, Гаркавец Маргарита Евгеньевна, Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет, 690087, г. Владивосток, ул. Луговая, д. 52Б, [email protected]
Authors
Pertseva Anna Dmitrievna, Posdnyakova Yuliya Mikhaylovna, Candidate of Technical Science, Kovalyov Nikolay Nikolaevich, Doctor of Biological Science, Esipenko Roman Vladimirovich, Garkavets Margarita Evgenyevna, Far Eastern State Technical Fisheries University, 25B, Lugovaya St., Vladivostok, 690087, [email protected]
