CC BY
55
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616.995.122
СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ МЕТАЦЕРКАРИЙ Microphallus piriformis (Odhner, 1905): Trematoda,
Microphallidae
Н.Б. ТЕРЕНИНА доктор биологических наук О.О. ТОЛСТЕНКОВ кандидат биологических наук
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. СеверцоваРАН, Москва, e-mail: terenina [email protected] М. ГУСТАФССОН доцент
Отдел биологии Университета г. Турку, Финляндия С.О. МОВСЕСЯН доктор биологических наук
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Москва
С помощью иммуноцитохимического метода и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии исследовано наличие и локализация нейромедиатора се-ротонина в нервной системе метацеркарий трематоды Microphallus piriformis (Microphallidae). TRITC меченный фаллоидин использован для окрашивания мышечных волокон. Исследованный нейромедиатор выявлен в клетках и волокнах головных ганглиев мета-церкарий, в продольных нервных стволах, а также вблизи ротовой и брюшной присосок, репродуктивного отверстия. Полученные данные дают основание предполагать, что у трематод, имеющих тенденцию к прогенетическому развитию, иннервация репродуктивной системы существует уже на стадии метацерка-рии.
Ключевые слова: трематоды, метацеркарии, нервная система, нейромедиаторы, серотонин.
Как показывают литературные данные и результаты наших исследований, деятельность нервной системы паразитических плоских червей осуществляется с участием ряда нейромедиаторных веществ, включая серотонин, катехолами-ны, нейропептиды, ацетилхолин и др. Наиболее изученными в этом отношении являются взрослые формы паразитов, тогда как нервная система и нейрональ-ные сигнальные вещества на различных стадиях их жизненного цикла, в частности трематод, остаются менее исследованными.
Метацеркарии трематод, будучи более патогенными паразитами, чем взрослые формы (мариты), не только играют существенную роль в регуляции популяционных процессов у всех групп своих хозяев, но зачастую являются возбудителями острых эпизоотических и эпидемиологических заболеваний [6]. В литературе имеются некоторые сведения о нейромедиаторных веществах в нервной системе метацеркарий трематод. Так, в нервной системе метацеркарий представителей сем. Microphallidae и Gymnophallidae обнаружены катехо-
ламины и холинэстеразная активность [5]. Серотонинергические и пептидерги-ческие элементы выявлены у инцистированных метацеркарий Apatemon cobiti-dis proterorhini (Strigeidae), паразитирующих в полости тела бычка [11]. В нервной системе инцистированных метацеркарий Echinostoma caproni (Echinostoma-tidae) из брюхоногих моллюсков Biomphalaria glabrata обнаружены серотонин и нейропептид РМИБамид [10]. Холинергические, серотонинергические и пеп-тидергические элементы выявлены в центральных и периферическимх отделах нервной системы неинцистированных метацеркарий Diplostomum sp. (Diplostomidae) из глаз радужной форели и инцистированных метацеркарий Cotylurus erraticus (Strigeidae) из вентрикулярного перикардия радужной форели [8], метацеркарий Opisthorchis felineus (Opisthorchidae) из язя Leuciscus idus (L.) [7], а также у инцистированных метацеркарий Bucephaloides graci-lescens (Bucephalidae) из носовой и краниальной полостей мерланга, имеющих признаки прогенеза и обладающих дифференцированными половыми органами; от взрослых форм их отличает только отсутствие яиц [12]. Данные о наличии холинергических нервных элементов имеются в отношении метацерка-рии Podocotyle atomon (Opecoelidae) (из ракообразных - литоральных амфипод), Rhipidocotyle illens (Bucephalidae) (из карповых рыб) и Microphallus pygmaeus (Microphallidae) из печени брюхоногого моллюска Littorina saxatilis [4].
Объектом нашего исследования были неинцистированные метацеркарии трематоды Microphallus piriformis, имеющих тенденцию к прогенетическому развитию, т. е. обладающие полностью сформированным половым аппаратом. При использовании иммуноцитохимического метода и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии нами были исследованы серотонинерги-ческие компоненты в нервной системе метацеркарии M. piriformis с целью дальнейшего расширения представлений о нервной системе этой личиночной стадии в жизненном цикле трематод.
Материалы и методы
В работе использовали метацеркарий трематод M. piriformis, извлеченных из моллюска L. saxatis. Цикл развития M. piriformis происходит с участием одного промежуточного хозяина - моллюска, в печени которого происходит развитие спороцист. В последних формируются церкарии, лишенные стилета и хвоста. Церкарии теряют способность инцистироваться и свободно лежат в тонкостенной спороцисте. Не покидая спороцисту, они развиваются в ней до стадии метацеркарии, имеющей сформированный половой аппарат. Заражение дефинитивного хозяина происходит при поедании им зараженного моллюска, который одновременно выполняет роль и первого, и второго промежуточного хозяина.
Метацеркарий фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4) при 4 оС и затем сохраняли в 10%-ной сахарозе, приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере.
Локализацию серотонинергических нервных структур определяли имму-ноцитохимически [9]. Образцы инкубировали в первичной антисыворотке (Incstar, USA, в разведении 1 : 500), затем во вторичной антисыворотке (FITC, DAKO, в разведении 1 : 50) при температуре 4 °C.
Для исследования взаимоотношения выявляемых нейромедиаторов с мышечными элементами паразита одновременно проводили также окраску мышечных волокон, используя связанный с флуорофором фаллоидин. Для окраски мышц использовали TRITC (тетраметилродамин изотиоцианат), меченый фаллоидин (в разведении 1 : 200), во влажной камере в течение одного часа в темноте при температуре 4 °C в соответствии с методикой [13].
Препараты исследовали с помощью Leica TCS 4D конфокального сканирующего лазерного микроскопа, соединенного с Leitz Aristoplan флуоресцентным микроскопом.
Результаты и обсуждение Длина тела метацеркарии M. piriformis составляет 322 мкм, ширина -200, диаметр ротовой присоски - 24, брюшной - 28 мкм.
Стенка тела метацеркарии состоит из кольцевых, продольных и диагональных мышечных волокон (рис.1 А-Г). Кольцевые мышцы очень тонкие, их ширина менее 1 мкм (5 кольцевых волокон занимают примерно 8 мкм). Ширина продольных мышц около 1 мкм (5 волокон на 13 мкм), расстояние между продольными мышцами составляет до 2 мкм. Диагональные мышечные волокна обнаруживают на протяжении всего тела метацеркарии, ширина их около 1 мкм, а расстояние между ними - 3-8 мкм. Внутри тела просматриваются кольцевые мышечные волокна кишечника. Хорошо выражены радиальные мышечные волокна ротовой и брюшной присосок, а также довольно мощные мышцы конечного отдела половой системы и мышечный сфинктер экскреторного отверстия.
Рис. 1. Мышечные элементы метацеркарии M. piriformis'. БП - брюшная присоска; РП - ротовая присоска; ПО - половое отверстие; К - кишечник (масштаб: А, Г - 50 мкм; Б, В -10 мкм)
Положительную окраску на серотонин выявляли в церебральных ганглиях (рис.2, А-Г). От головных ганглиев, в области которых просматриваются по две с каждой стороны серотонинергические клетки, отходят три пары продольных нервных стволов, один из которых, главный, является наиболее мощным. Им-мунореактивные к серотонину волокна идут к ротовой присоске, у основания которой можно видеть две мелкие положительно окрашенные клетки (рис. 2А). Продольные стволы связываются комиссурами. Диаметр серотонинергических клеток около 5 мкм.
Рис. 2. Серотонинергические нервные клетки и волокна в теле метацеркарии
M. piriformis:
(масштаб: А, Б, Г, Е - 30 мкм; В - 10 мкм; В - 20 мкм) Вдоль главного нервного ствола до брюшной присоски располагаются 3 иммунореактивные к серотонину клетки, затем на переднем уровне брюшной присоски - еще 2 клетки и еще одна клетка - на заднем уровне брюшной присоски. Таким образом, по ходу главного нервного ствола обнаружено 8 серото-нинергических клеток (включая две клетки, расположенные на уровне мозгово-
го ганглия). К брюшной присоске и половому отверстию (расположенному сбоку от брюшной присоски) от нервных клеток идут тонкие нервные волокна.
В области, расположенной немного выше брюшной, имеется две мелкие (диаметром 3 мкм) клетки и сеть иммунореактивных к серотонину волокон, которые расположены недалеко от полового отверстия (Рис.2 Д-Е). Возможно, эти структуры осуществляют иннервацию конечных отделов половой системы ме-тацеркарии.
Таким образом, серотонинергические элементы выявлены в центральных и периферических отделах нервной системы неинцистированной метацеркарии M. piriformis. Полученные результаты дают основание говорить об иннервации мышц ротовой и брюшной присосок, конечного отдела половой системы серотонинергическими нервными компонентами. Эти данные согласуются со сведениями, имеющимися в литературе о наличии нейромедиатора серотони-на в центральных и периферических отделах нервной системы метацеркарий трематод различных семейств (Strigeidae, Echinostomatidae, Diplostomidae, Bu-cephalidae) [7, 10-12]. Среди исследованных метацеркарий имеются различные формы - как инцистированные (Strigeidae, Echinostomatidae, Buce-phalidae), так и неинцистированные (Diplostomidae), паразитирующие в различных хозяевах (рыбы, моллюски) и имеющие разную локализацию.
Как известно, некоторым трематодам, имеющим наиболее короткие сроки маритогонии, присуща отчетливо выраженная на фазе метацеркарии тенденция к прогенезу. Тенденция к прогенетическому развитию выражается в наличии у личинок частично или полностью сформированного, но еще не функционирующего полового аппарата. Это явление достигает своего крайнего выражения у метацеркарий сем. Microphallidae, половой аппарат которых полностью сформирован [2]. Весь морфогенез мариты сдвинут у этих видов на фазу метацерка-рии, и нередко стимулом к началу размножения может послужить просто повышение температуры [3]. Так, у вида M. pygmaeus метацеркарии имеют полностью сформированный половой аппарат и уже через 36 ч после заражения дефинитивного хозяина (птицы) в матке этих гельминтов появляются оплодотворенные яйца [1]. В спороцисте M. pygmaeus развиваются церкарии, которые затем превращаются в следующую фазу своего развития - метацеркарии [1]. При этом церкарии утрачивают способность инцистироваться. Не покидая спороци-сту, они развиваются в ней до стадии метацеркарии, имеющей сформированный половой аппарат. Заражение дефинитивного хозяина происходит при поедании им зараженного моллюска, который одновременно выполняет роль и первого, и второго промежуточного хозяина.
Метацеркариии M. piriformis, исследованные нами, имеют тенденцию к прогенетическому развитию, т. е. обладают полностью сформированным половым аппаратом. В этом отношении представляют интерес данные, полученные нами о том, что вблизи полового отверстия метацеркарии имеются серотонинергические нервные клетки и волокна, которые, вероятно, уже на этой стадии развития трематоды могут осуществлять регуляцию деятельности репродуктивного аппарата паразита. Наличие иннервации половой системы (оотипа) было отмечено также у метацеркарии Bucephaloides graciles-cens [12]. Таким образом, можно говорить о том, что иннервация репродуктивной системы тех трематод, которые имеют тенденцию к прогенетическо-му развитию, имеет место уже на стадии метацеркарии.
Работа выполнена по плану Совместного Российско-армянского научно-экспериментального центра зоологии и паразитологии ИПЭЭ им. А.Н. Северцова РАН и Института зоологии НЦ зоологии и гидроэкологии НАН Армении и поддержана грантами РФФИ 09-04-00243а, Президента РФ МК-1093.2011.4.
Литература
1. Белопольская М.М. Цикл развития трематоды Spelotrema pygmaeum, паразитирующей у птиц // Доклады АН СССР. - 1949. - Т. LXVI (1). -С. 133-135.
2. Белопольская М.М. Семейство Microphallidae Travassos, 1920. В кн. Трематоды животных и человека. - М.: Изд АН СССР, 1963. - ХХ1. - С. 260-499.
3. Гинецинская Т.А. Трематоды, их жизненные циклы, биология и эволюция. - М.: Наука, 1968. - 411с.
4. Котикова Е.А. Нервная система Acoela, Plathelminthes и Rotifera -морфологический аспект: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Санкт-Петербург, 2009.
5. Рыбаков А.В., Незлин Л.П. Локализация холинестеразы и биогенных аминов в жизненном цикле микрофаллид и гимнофаллид (Trematoda) // Матер. Всес. конф. «Простые нервные системы и их значение для теории и практики». - Казань, 1988.- С. 256-260.
6. Судариков В.Е., Шигин А.А., Курочкин Ю.В. и др. Метацеркарии трематод -паразиты гидробионтов России. - М.: Наука, 2002. - Т. 1. - 298 с.
7. Tolstenkov O.O., Terenina N.B., Serbina E.A., Gustafsson M.K.S. The spatial relationship between the musculature and the 5-HT and FMRFamide immuno-reactivities in cercaria, metacercaria and adult Opisthorchis felineus (Dige-nea) //Acta Parasitologica. - 2010. - V. 55, N 2. - P. 123-132.
8. Barton C.L., Halton D.V., Shaw C. et al. An immunocytochemical study of putative neurotransmitters in the metacercariae of two strigeoid trematodes from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Parasitology Research. - 1993. - V. 79. -P. 389-396.
9. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies of antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study for the hiperimmune rabbit // J. Exper. Med. - 1955. - V. 102. - Р. 4960.
10. Sebelova S., Stewart M.T., Mousley A. et al. The musculature and associated innervation of adult and intramolluscan stages of Echinostoma caproni (Trematoda) visualised by confocal microscopy // Parasitology Research. - 2004. -V. 93. - P. 196-206.
11. StewartM.T., Mousley A., Koubkova B. et al. Gross anatomy of the muscle systems and associated innervation of Apatemon cobitidis proterorhini metacerca-riae Trematoda: Strigeidea), as visualised by confocal microscopy // Parasitology. -2003. - V. 126. - P. 273-282.
12. StewartM.T., Marks N.J., Halton D.W. Neuroactive substances and associated major muscle systems in Bucephaloides gracilescens (Trematoda: Digenea) metacercariae and adult // Parasitology Research. - 2003. - V. 91. - P. 12-21.
13. Wahlberg M.H. The distribution of F-actin during the development of Di-phyllobothrium dendriticum (Cestoda) // Cell and Tissue Research. - 1998. - V. 291. - Р. 561-570.
Serotoninergic components in the nervous system of Microphallus piriformis (Odhner, 1905) metacercaria: Trematoda, Microphallidae
N.B. Terenina, O.O. Tolstenkov, M. Gustafsson, C.O. Movsessian
Using immunocytochemical method and confocal scanning laser microscopy presence and localization of neurotransmitter serotonin was studied in Microphallus piriformis (Microphallidae) metacercariae. TRITC-conjugated phalloidin was used for staining of musculature. Serotonin immunoreactive cells and fibers were detected in the brain ganglion, in longitudinal nerve chords as well as near abdominal and oral suckers, genital pore. The data received suggest that in trematodes, which have the tendency to progenetic development, the innervation of reproductive organs exists as early as on the stage of metacercaria.
Keywords: trematodes, nervous system, neurotransmitters, serotonin.
