Seasonal Dynamics of stress proteins in Leaves of medicinal plants in a natural environment of Irkutsk and on the shores of the lake Baikal Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 42-50 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Zhivetiev, Kolesnichenko, Graskova and Voinikov

ORIGINAL ARTICLE

Seasonal Dynamics of Stress Proteins in Leaves of Medicinal Plants in a Natural Environment of Irkutsk and on the Shores of the Lake Baikal

M.A. Zhivetiev, A.V. Kolesnichenko, I.A. Graskova,

V.K. Voinikov

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, PO 317, Irkutsk, 664033, Russia

*E-Mail: [email protected]

Received August 7, 2014

We study leafs of five plant species, growing in Irkutsk city and on the southeastern shore of Lake Baikal. These species are Achillea asiatica Serg., Taraxacum officinale Wigg., Plantago major L., Veronica chamaedrys L. and Alchemilla subcrenata Buser. In its leafs we identify some types of stress-induced proteins. In autumn, the accumulation of stress proteins in leafs of plants both from shores of Lake Baikal and from Irkutsk have been registered.

Key words: medicinal herbs, leafs, stress proteins, stress-induced proteins

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

43

Seasonal Dynamics of Stress Proteins in Leaves...

ORIGINAL ARTICLE

Сезонная динамика стрессовых белков в листьях лекарственных растений в естественных условиях обитания города Иркутск и на побережье озера Байкал

М.А. Живетьев, А.В. Колесниченко, И.А. Граскова,

В.К. Войников

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, Россия

*E-Mail: [email protected]

Поступила в редакцию 7 Августа 2014 г.

Изучались листья пяти видов лекарственных растений, произрастающих на юговосточном побережье озера Байкал и в городе Иркутск: Achillea asiatica Serg., Taraxacum officinale Wigg., Plantago major L., Veronica chamaedrys L., Alchemilla subcrenata Buser. В их листьях определяли стрессовые белки. Осенью накопление стрессовых белков в листьях растений наблюдали как в растениях с побережья Байкал, так и из Иркутска.

Key words: лекарственные растения, листья, стрессовые белки

Известно, что растения для защиты своих тканей от перепадов температуры и других стрессовых условий активно синтезируют ряд защитных белков, таких как белки теплового (БТШ) (Guy, 1990) и холодового (БХШ) шока (Trunova, 2007). Впервые синтез БТШ в ответ на гипертермию был обнаружен в 1974 году (Tissieres et al., 1974), а первым шагом в изучении

собственно молекулярных механизмов экспрессии

генов БХШ при воздействии низкой температуры считают открытие Guy с соавторами (1985) cor-генов (cold regulated genes) - целого семейства генов, кодирующего COR-белки, обладающих свойствами высокой гидрофильности и термоустойчивости и экспрессирующихся при гипотермии (Trunova, 2007; Koshkin, 2010). При этом показано, что эти белки не обладают ферментативными свойствами и они большей

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Zhivetiev et al.

44

частью низкомолекулярны (Trunova, 2007). молекулярной массы, из которых наибольшим

Наиболее изучена экспрессия генов гоМ5а и вниманием ученых пользуются БТШ с

cor6.6, которые кодируют COR15a и COR6.6 белки молекулярными массами 60, 70, 90 кДа (Koshkin,

(Thomashow, 1999). Изучение функций COR15a 2010). Не менее значимы такие стрессовые белки

белков позволило предположить, что они важны как БТШ101 (Queitsch et al., 2000), БХШ310

для формирования устойчивости к (Kolesnichenko et al., 1996) и другие (Voinikov,

низкотемпературному стрессу, особенно 2011; Voinikov, 2013).

морозостойкости, так как предотвращают переход В условиях Сибири важно изучение действия

мембран из ламеллярной фазы в гексагональную у известных фундаментальных механизмов

зимующих растений при межклеточном адаптации растительных организмов к

образовании льда (Artus et al., 1996; Steponkus et специфическим температурным условиям региона

al., 1982). Показано, что транскрипты cor-генов не только в модельных экспериментах, но и в

обнаруживаются через 2 ч конститутивно уже при естественных условиях среды произрастания

отсутствии низкой температуры (Stockinger et al., растений.

1997), а трансформированные гоМ5а геном В связи с этим целью работы было изучить

растения арабидопсиса повышали свою наличие ряда белков, синтезирующихся в ответ на

морозостойкость на 1 °С. Арабидопсис, тепловой и холодовой стресс (БТШ101, БТШ70,

трансформированный введением сразу нескольких БТШ60, БТШ17.6, а также COR14b) в относительно

генов (cor14, cor15 и cor6.6) в целом значительнее жаркий (начало августа) и холодный (конец

повышал морозостойкость, но опять же не более, октября) периоды вегетации травянистых

чем на 2-3 °С. Наибольшее повышение растений.

морозостойкости достигалось при длительном MATERIALS AND METHODS

действии гипотермии, которая экспрессировала Объектами исследования служили листья пяти

весь комплекс генов стрессовых белков, а не видов лекарственных растений: тысячелистник

только cor-гены, что, в свою очередь, доказало азиатский (Achillea asiatica Serg.), одуванчик

существование многих других генов, лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.),

экспрессирующихся пониженной температурой и подорожник большой (Plantago major L.), вероника

регулирующихся не только ее краткосрочным, но и дубравная (Veronica chamaedrys L.), манжетка

длительным воздействием (Trunova, 2007; городковатая (Alchemilla subcrenata Buser). Все эти

Stockinger et al., 1997). виды являются многолетними и с приходом зимы их

Действительно, наряду с синтезом надземная часть полностью отмирает. Отбор

низкомолекулярных шаперонов (15-35 кДа) растений производили соответственно на левом

выявлен синтез БТШ и БХШ более высокой берегу реки Выдриная в 700 м от уреза озера

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

45

Seasonal Dynamics of Stress Proteins in Leaves...

Байкал на территории стационара СИФИБРа и в Иркутске на территории дендрариума СИФИБРа. Эти территории характеризовались

существенными отличиями не только температурного режима, но и в уровнях выпадения осадков и глубины залегания грунтовых вод. В летний период на Байкале выпадает больше атмосферных осадков, чем в Иркутске, однако быстрое просыхание хорошо дренируемых почв приводит к иссушению верхнего слоя почвы. Наоборот, в Иркутске, несмотря на меньшее количество осадков, почва, питаемая грунтовыми водами, оставалась хорошо увлажненной. Нами было подсчитано суммарное количество осадков непосредственно за 10 дней перед отбором проб. Выяснилось, что в августе, непосредственно перед сбором проб, растения находились в условиях недостаточной влагообеспеченности. Особенно мало осадков выпало на р. Выдриная. Наоборот, в октябре, меньшее количество осадков перед сбором проб наблюдалось в Иркутске. В августе, как и в середине лета, температура была стабильно выше в Иркутске, чем на побережье Байкала, причем ход температур был на р. Выдриная заметно сглажен по сравнению с городом, где наблюдались частые сильные перепады температур день/ночь. В середине октября в г. Иркутск было на несколько градусов теплее, чем на побережье оз. Байкал, но в дни отбора проб, с середины месяца, наступило сильное похолодание (с 5-6 до -1 - -2 °С), причем минимальная температура ночью в эти дни достигала на р. Выдриная -5 °С, в то время как в

Иркутске ночью она падала до -7,5 °С. Таким образом, растения в Иркутске и на р. Выдриная находятся в неравнозначных климатических условиях, что предполагает у них присутствие отличий в реализуемых адаптационных механизмах в зависимости от места произрастания.

Для анализа листья тысячелистника азиатского, одуванчика лекарственного и подорожника большого отбирались на обеих экспериментальных площадках, а листья вероники дубравной и манжетки городковатой, массово представленные на стационаре «р. Выдриная», но не встречающиеся в Иркутске, исследовались только на первом участке. Пробы отбирались в два часа дня 10 августа и 19 октября 2009 г.

Выделение белка осуществляли по стандартной методике (Pobezhimova et a/., 2004). Количество белка определяли по методу Lowry с соавторами (1951). Электрофорез в ПААГ проводили в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970) на приборе Mini-PROTEAN III Cell (BIO-RAD, США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (“AMERSHAM“, США) и последующую обработку антителами проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Все образцы исследовались в трех повторностях.

Анализ сканированных мембран проводился при помощи программы «GEL Analysis 1,0».

RESULTS AND DISCUSSION

Было исследовано наличие БТШ с молекулярными массами 70 (рис. 1, А) и 60 ^ (рис. 1, Б) в растениях, собранных в начале августа и

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Zhivetiev et al.

46

второй половине октября.

С наступлением осенних заморозков наблюдали накопление Hsp 70. На р. Выдриная сильнее всего увеличение синтеза Hsp 70 происходило у вероники и одуванчика, в Иркутске - у подорожника. Экспрессия Hsp 60 так же в большинстве случаев увеличивалась с осенним понижением температур (рис. 1 Б).

Также были проведены исследования на наличие таких стрессовых белковых молекул как Hsp 101, Hsp 17,6 и Cor 14 b в пробах растений, собранных в начале августа и конце октября (рис. 2).

На рисунках 3 и 4 представлены графические результаты обработки мембран в программе GEL Analysis.

Из всех изученных растений вероника дубравная показала наиболее высокое накопление в октябре БТШ 60 и 70 в своих листьях. При этом, именно у этого растения, отличающейся, по-видимому, высокой терморезистентностью, других стрессовых белков не накапливалось.

На фоне повсеместного увеличения в октябре БТШ 70, обращает на себя внимание слабое уменьшение содержания БТШ 60 у тысячелистника и одуванчика в г. Иркутск, что может быть связано с процессами деадаптации в листьях растений. Об этом же, по-видимому, свидетельствует ранее показанное нами уменьшение активности пероксидазы в листьях лекарственных растений в Иркутске в этот же период (Zhivet'ev et al., 2010).

Высокое содержание БТШ 101 манжетки в

августе можно связать с засухой и высокими дневными температурами в этом месяце. Отсутствие детектирования его у других видов может свидетельствовать либо о видоспецифичности данного защитного механизма, либо об отсутствии необходимости синтеза данного типа БТШ в связи с наличием и достаточно высокой степенью активности других защитных механизмов.

Низкомолекулярные БТШ детектировались только на Байкале и только у манжетки и подорожника в октябре, что может быть связано с их большей уязвимостью к гипотермии и отличиями в микроклиматических условиях мест произрастания.

В этой связи интересным может быть высокое содержание COR 14 b в листьях одуванчика в октябре на побережье Байкала при видимом его отсутствии в это же время на территории города Иркутск. Иначе вели себя COR 14 b в листьях тысячелистника, а особенно - подорожника, которые в Иркутске уже активно отмирали и завершали сезон вегетации, а на Байкале продолжали активно вегетировать.

Таким образом, исследуемые растения в той или иной мере накапливали разнообразный спектр стрессовых белков в ответ на неблагоприятные высокие температуры летом и низкие осенью. Выявлена видовая специфика по составу стрессовых белков в зависимости от вегетационного периода и условий произрастания. Наиболее часто их накопление происходит осенью.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

47

Seasonal Dynamics of Stress Proteins in Leaves...

AMikittHNHicf)

FlQutagu wajw

\ttnHtica chaiHandrya

AlcAumfilaanUcrtHafa

Arftiilwmietrw

PtiWfligO ГЩАГ f frente# cfovrwfrfn'f AMuttitilia nitbiMUtia

Рисунок 1. Стрессовые белки в листьях одуванчика Taraxacum officinale, подорожника Plantago major, тысячелистника Achillea asiatica, вероники Veronica chamaedrys, манжетки Alchemilla subcrenata в августе и октябре 2009 в г. Иркутск и на побережье Байкала: А -Hsp 70; Б -Hsp 60

Рисунок 2. Стрессовые белки Hsp 101, Cor 14 b и Hsp 17,6 в листьях одуванчика Taraxacum officinale, подорожника Plantago major, тысячелистника Achillea asiatica, вероники Veronica chamaedrys, манжетки Alchemilla subcrenata в августе и октябре 2009 в г. Иркутск и на побережье Байкала

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Zhivetiev et al.

48

Рисунок 3. Динамика содержания стрессовых белков в листьях одуванчика Taraxacum officinale, подорожника Plantago major, тысячелистника Achillea asiatica, вероники Veronica chamaedrys, манжетки Alchemilla subcrenata в августе и октябре 2009, р. Выдриная.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

49

Seasonal Dynamics of Stress Proteins in Leaves...

Рисунок 4. Динамика содержания стрессовых белков в листьях одуванчика Taraxacum officinale, подорожника Plantago major, тысячелистника Achillea asiatica в августе и октябре 2009, г. Иркутск

REFERENCES

Artus N.N., Uemura M., Steponkus P.I., Gilmour SJ, Lin CT, Tomashow MF. (1996) Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc. Acad. Sci. USA. 93, 13404-13409.

Guy C.I., Niemi K.J., Brambl R. (1985) Altered gene expression during cold acclimation of spinach. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 81,3673-3677.

Guy C.L. (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant. Physiol, and Plant. Mol. Biol. 41, 187-223. Kolesnichenko A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K., Misharin S.I., Antipina A.I. (1996) Antigen from winter rye accumulated under low temperature. Russ J Plant Physiol, 43, 771-776.

Koshkin E.I. (2010) Fiziologiya ystoychivosti selskokhozyaystvennykh kultur: uchebnik. M.: Drofa, 638 s.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Zhivetiev et al.

50

Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature., 227, 680-685.

Lowry O. H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. and Randall R.L. (1951) Protein Measurements with the Folin Phenol Reagent. J. Biol.Chem, 193, 265-275.

Pobezhimova T.P., Kolesnichenko A.V., Grabelnyh

O. I. (2004) Metody izucheniya mitokhondriy rasteniy. Polyarografiya i elektroforez. M.: OOO “NPK “PROMEKOBEZOPASNOST”, 98 s.

Queitsch C., Hong S.W., Vierling E., Lindquist S. (2000) Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell. 12(4), 479-92

Steponkus P., Dowgert M., Evans R., Gordon-Kammt W. (1982) Cryobiology of isolated protoplast. In: Plant cold hardiness and freezing stress: Li

P. ,Sakai A. (eds.) N.Y.: Acad. Press. N.Y., V. 2., pp. 459-475.

Stockinger E.J., Gilmour S.J., Thomashow M.F. (1997) Arabidopsis thaliana CBF 1 encodes an AP 2 domain-containing transcriptional activator

that binds to the C-repeat/ DRE, a cis-acting transcription in response to low temperature and water deficit. Proc. Nat. Acad. USA, 94, 10351040.

Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. (1974) Protein synthesis in salivary glands of D. Melanogaster. Relation to chromosome puffs J. Mol. Biol., 84, 389-398.

Voinikov V.K. (2011) Mitokhondrii rasteniy pri temperaturnom stresse, Salyaev R.K. (red.) Novosibirsk: Akademicheskoye izdaniye “Geo”, 163 s.

Voinikov V.K. (2013) Energeticheskaya i informatsionnaya sistemy rastitelnykh kletok pri giporepmii, Calyaev R.K. (red.) Novosibirsk: Nauka, 212 s.

Zhivet'ev M.A., Rachenco E.I., Putilina T.E., Krasnobaev V.A., Graskova I.A., Voinikov V.K. (2010) Activity and isoenzyme spectrum of peroxidases and dehydrins of some plant species, growing on the shores of lake Baikal, under abiotic stress. Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 6(4), 42-50.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014