CC BY
62
Вестник ДВО РАН. 2015. № 6
УДК 577.2
В.А. ГОЛОТИН, Л.А. БАЛАБАНОВА, Н С. БУЙНОВСКАЯ, Г.Н. ЛИХАЦКАЯ, А.А. БУЛГАКОВ, О.В. ЧЕРНИКОВ, ИВ. ЧИКАЛОВЕЦ, В.А. РАССКАЗОВ
Щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina как инструмент в исследовании свойств рекомбинантных белков
Высокоактивная щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina KMM 296 (CmAP) является эффективной ферментной меткой рекомбинантных белков для исследования их свойств. Слияние CmAP с угле-водсвязывающими белками морских моллюсков в генно-инженерных векторах позволяет усовершенствовать лектин-ферментные методы для диагностики патологий человека.
Ключевые слова: Crenomytilus grayanus, Apostichopus japonicus, галактозосвязывающий лектин, маннансвя-зывающий лектин, гибридный белок.
Alkaline phosphatase from the marine bacteria Cobetia marina as a tool to study the properties of recombinant proteins. V.A. GOLOTIN12, L.A. BALABANOVA1,2, N.S. BUINOVSKAYA1, G.N. LIKHATSKAYA1, A.A. BULGAKOV1, O.V. CHERNIKOV1, I.V. CHIKALOVETS1, V.A. RASSKAZOV1 (1G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok; 2Far-Eastern Federal University, Vladivostok).
Highly active alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina KMM 296 (CmAP) is an effective enzyme for recombinant proteins labeling for the study of their properties. Merging CmAP with carbohydrate-binding proteins from marine mollusks in genetic engineering vectors improve the lectin-enzymatic methods for the diagnosis of human pathologies.
Key words: Crenomytilus grayanus, Apostichopus japonicus, galactose-binding lectin, mannan-binding lectin, fusion protein.
Первые примеры применения щелочной фосфатазы (ЩФ) в качестве ферментной метки описаны в методиках маркировки моноклональных антител методом химической конъюгации белков [10, 18, 21]. Данный метод давал превосходную по яркости и интенсивности окраски иммунохимическую маркировку срезов тканей и мазков клеток,
"ГОЛОТИН Василий Александрович - кандидат биологических наук, младший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток ), научный сотрудник (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), БАЛАБАНОВА Лариса Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток), инженер-микробиолог (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), БУЙНОВСКАЯ Нина Сергеевна - аспирант, ЛИХАЦКАЯ Галина Николаевна - кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, БУЛГАКОВ Александр Александрович - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ЧЕРНИКОВ Олег Викторович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, ЧИКАЛОВЕЦ Ирина Владимировна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, РАССКАЗОВ Валерий Александрович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: [email protected]
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований ДВО РАН «Дальний Восток» (проект № 15-1-5-020), гранта научного фонда ДВФУ (проект № 14-08-06-10_и).
содержащих цитоплазматические и поверхностные антигены, например антиген-16, присутствующий в образцах при карциноме со злокачественной эффузией [10]. Метод также применим для иммуноблоттинга при обнаружении антигенных молекул после их переноса с ДСН-полиактиламидного геля на нитроцеллюлозные листы [10]. Другим примером использования ЩФ в медицине является маркировка ДНК вируса гепатита В (HBV) для его обнаружения в сыворотке крови [21]. Модицифированная ЩФ ковалентно связывается с одной нитью ДНК, и тогда этот энзиматический комплекс визуализируется с помощью субстрата при блот-гибридизации. Эти эксперименты показали перспективу применения ЩФ как чувствительного, быстрого, безопасного и дешевого метода обнаружения ДНК вируса. Разработан похожий метод обнаружения ДНК с использованием хемилюминес-центных субстратов [18].
Щелочные фосфатазы также могут быть применены для обнаружения отходов производства: специфическая реакция с использованием пара-нитрофенил фосфата (п-НФФ) модифицирована для анализа пресноводных отложений [17]. Существенные корреляции между фосфатазной активностью и общим числом жизнеспособных клеток, а также концентрацией аденозинтрифосфата открывают перспективы использования ЩФ в качестве индикатора микробной плотности и биомассы в пресноводных отложениях [15].
В молекулярной биологии ЩФ является надежным инструментом для увеличения эффективности лигирования генетического вектора. Дефосфорилируя концевые фосфатные группы вектора, фермент предотвращает лигирование его концов [19, 23].
Одним из направлений молекулярной генетики в настоящее время является белковая инженерия, включающая в себя разработку методов модификации белков, конструирование новых белков с заданными свойствами, и ЩФ может применяться для мониторинга получения таких белков и изучения их свойств.
Сегодня существует немало примеров использования ЩФ в химерных белках, полученных генно-инженерными методами. Генно-инженерный химерогенез усовершенствовал способ получения меченных ферментом антител для использования их в иммунофер-ментном анализе (ELISA) [22, 25]. Эти методы избавляют от необходимости подбирать условия получения антител к новым клеточным маркерам, использовать химическую модификацию антител конъюгацией с ферментом, зачастую губительную для фермента, и в результате сводят процедуру получения меченых антител до одного этапа. Однако традиционные иммунохимические методы, в большинстве случаев основанные на выявлении белковых антигенных детерминант, часто не позволяют дифференцировать типы опухолей, выявлять их на ранних этапах возникновения, оценивать способность к метастазиро-ванию. Поэтому в последнее время приоритетными технологическими решениями для более ранней и дифференциальной диагностики патологических состояний человека, в особенности онкологий различного генеза, являются методики, основанные на применении лектинов. Установление тонких структурных различий в углеводной части опухолевых маркеров послужило стимулом для развития нового направления - разработки лектин-иммунных методов их исследования (ELLA) [3, 12, 14]. Известны примеры применения генно-инженерных решений, основанных на использовании химерных конструкций с лек-тинами, для усовершенствования лектин-иммуноферментных методов анализа профилей гликозилирования [20]. Однако примеры создания функциональных химерных лектинов с щелочной фосфатазой немногочисленны. В данной работе показана эффективность использования мономерной высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии С. marina KMM 296 в качестве ферментной метки для исследования рекомбинантных белков на примере получения химерных лектинов морских моллюсков.
Получение гибридного бифункционального галактозосвязывающего
лектина CmAP/CGL
Ранее из морской мидии Crenomytilus grayanus был выделен и охарактеризован галактозоспецифичный (Gal/GalNAc-специфичный) лектин (CGL), на основе
которого разработаны методы твердофазного лектин-ферментного анализа (ТЛФА) для выявления различий в гликозилировании онкофетальных антигенов (ОФА) [4-6]. Показано, что лектин проявляет специфичность к углеводным цепям, характерным для злокачественного роста, таким как Т-антиген (Gal-1-3GalNAc-O-Ser/Thr) и Tn-антиген (GalNAc-O-Ser/Thr). С помощью одной из сконструированных тест-систем с использованием CGL протестированы сыворотки беременных женщин (в том числе с угрозой невынашивания) и сыворотки женщин с онкопатологией. Выявлены достоверные различия между группами женщин с нормально протекающей беременностью и с угрозой невынашивания, с одной стороны, и между группами женщин с угрозой невынашивания и онкозаболеванием, с другой [6]. Для выявления различий в гликозилировании еще одного ОФА - раково-эмбрионального антигена (РЭА) также разработан метод ТЛФА на основе CGL. Результаты эксперимента показали существенную разницу в связывании CGL с раковоэмбриональными антигенами (РЭА) из сывороток онкологических больных и здоровых доноров. Средний уровень лектин-реактивных гликоформ РЭА в образцах со всеми видами онкопатологий был в 2-3 раза выше среднего уровня, определенного для здоровых людей [6]. Кроме того, установлено, что CGL является высокочувствительным гистохимическим маркером, в частности для различных субпопуляций нейроцитов симпатической нервной системы. Меченный ферментной меткой CGL позволяет определять не только тела нейронов Б-типа, но и их немиелиновые аксоны [4]. Также изучена специфика локализации рецепторов муцинового типа в клетках низко-дифференцированной аденокарциномы толстой кишки человека. Выявлены основные типы локализации этих рецепторов. Показано, что лектин CGL, меченный ферментной меткой, наиболее интенсивно связывается с внутриклеточными мембранами, цитоплазмой и секретом опухолевых клеток, синтезирующих муцины [5].
С целью усовершенствования методов очистки рекомбинантного галактозосвязываю-щего лектина морской мидии Crenomytilus grayanus и исследования его углеводсвязываю-щих свойств разработана генетическая конструкция для синтеза гибридного белка в клетках Esherichia coli с использованием гена щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina KMM 296 (CmAP).
Для построения генетической конструкции амплифицированы кодирующие участки генов высокоактивной щелочной фосфатазы из хромосомы морской бактерии C. marina KMM 296 и кДНК лектина C. grayanus, которые последовательно лигированы в плазмиду pET-40b(+) (Invitrogen) через гибкий линкер (G4S)3. Линкер включали в последовательность праймера, комплементарного З'-концу гена CmAP. В результате скрининга реком-бинантных колоний обнаружено, что гибридный белок (CmAP/CGL) обладает высокой фосфатазной активностью (2500 ед/мг). Наличие ферментативной активности позволяет проводить детекцию рекомбинантного лектина CmAP/CGL как при хроматографической очистке, так и при проведении лектин-иммуноферментного анализа по расщеплению хромогенного субстрата и-нитрофенилфосфата (X = 405 нм). Результаты проведения реакции прямой гемагглютинации с использованием рекомбинантного химерного лектина CmAP/CGL показали наличие его высокой лектинсвязывающей активности (рис. 1). Гибридный бифункциональный белок CmAP/CGL очищали с помощью ионообменной (ДЕ-АЕ-целлюлоза, Whatman), металлоаффинной хроматографий (Ni-NTA агароза, Qiagen), гель-фильтрации (сефакрил S-200HR, Sigma) и анионообменной рехроматографии (FPLC, monoQ, GE), в результате чего удалось очистить образец в 210 раз. Степень чистоты полученного препарата оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ).
Из рис. 1 видно, что существует линейная зависимость между концентрацией химерного белка CmAP/CGL и лигандом, указывающая на высокую специфичность такого взаимодействия. Высокая чувствительность метода позволяет использовать CmAP/CGL в малых концентрациях (менее 2 мкг/мл), что весьма перспективно для диагностики различных патологий [6].
При исследовании структуры химерного лектина CmAP/CGL методом молекулярного моделирования с помощью программы МОЕ 2014.09 (http:// www.chemcomp.com/) выявили, что оба функциональных домена CmAP/ CGL разобщены в пространстве и могут работать независимо друг от друга. Для построения его полноатомной модели использовали кристаллические структуры щелочной фосфатазы Vibrio sp. (код PDB: 3E2D_A) и лектина мидии Mytilus galloprovincialis (Mytilec) (код PDB: 3WMV) (рис. 2). Оптимизацию структуры модели CGL выполняли методами минимизации энергии и молекулярной динамики с использованием программ MOE 2014.09 и GRO-MACS 5.0 [13]. Модель комплекса CGL с субстратом построена методом ЗД-суперпозиции кристаллической структуры комплекса Mytilec с молекулой GalNAc (код PDB: 1WMV), что позволило предположить расположение аминокислотных остатков в трех углеводсвязывающих сайтах связывания лектина и методом получения химерных мутантных белков, содержащих в своем составе щелочную фосфатазу CmAP, подтвердить значимость каждого остатка.
По итогам ТЛФА установлено, что у мутантных белков CmAP/CGL с разрушенными сайтами связывания ферментативная активность уменьшалась пропорционально уменьшению углеводсвязы-вающей активности лектина, что подтверждает высокую эффективность использования CmAP при генно-инженерном мечении лектина CGL с целью исследования его свойств. Полученный ре-комбинантный бифункциональный гибридный лектин CmAP/CGL с активностью щелочной фосфатазы является перспективным инструментом в методах выявления различий в гликозилировании онкофетальных антигенов.
Получение гибридного бифункционального маннансвязывающего лектина CtoAP/MBL-AJ
Данные об углеводной специфичности лектинов и их способности выявлять углеводные детерминанты в составе гликоконъюгатов опухолевых клеток, особенно ме-тастазирующих, нашли широкое применение в онкологии. Лектины используют как инструмент исследования перерождения нормальных клеток в злокачественные [7, 11, 16]. Полученная информация, в свою очередь, является составной частью изучения механизма канцерогенеза. Наиболее интересными с этой точки зрения являются лектины с
Концентрация <>.'Л1'.СС_ мкг/мл
Рис. 1. Зависимость относительной активности очищенного рекомбинантного белка CmAP/CGL от разных концентраций муцина желудка свиньи (PSM) в лектин-фермент-ном методе. По оси абцисс показана концентрация СтАР/ CGL (мкг/мл), по оси ординат - относительная активность ЩФ гибрида CmAP/CGL
Рис. 2. Теоретическая модель пространственной структуры гибрида CmAP/CGL. NGA - ^ацетилгалактозосвязывающие сайты CGL
высоконаправленной углеводной специфичностью. Показано, что к числу таких лектинов относится маннансвязывающий лектин С-типа дальневосточного трепанга MBL-AJ [8]. Лектин MBL-AJ не взаимодействует с компонентами сыворотки крови здорового человека, что является крайне важным при его использовании в различных диагностических исследованиях, в частности с применением методов иммуноцитохимии, что позволяет избегать ложноположительных результатов и получать достоверную информацию о структурных изменениях углеводных цепей гликоконъюгатов, сопровождающих патологические изменения. Результаты исследований углеводного профиля гликоконъюгатов MBL-AJ могут найти широкое практическое применение при разработке методов диагностики рака. Уникальность углеводной специфичности лектина дальневосточного трепанга MBL-AJ и перспективность его использования как диагностического маркера подтверждается результатами экспериментов по взаимодействию с раковоэмбриональными антигенами. Лектин трепанга показал способность взаимодействовать с такими маркерами опухолевого роста, как альфа-фетопротеин, раковоэмбриональный антиген, эмбриональный альфа-1-кислый гликопротеин, эмбриональный альфа-2-глобулин. На основе наличия у лектина MBL-AJ уникального углевод-распознающего домена, определяющего его способность распознавать микрогетерогенность гликоконъюгатов раковых и нормальных клеток, был разработан новый метод диагностики рака шейки матки [1]. При специфичности 93,6 % чувствительность лектин-иммуноферментного метода определения лектинсвязанных антигенов в вагинальных секретах у женщин с раком шейки матки составила 87,8 %. Предсказательная ценность положительного диагноза в исследовании - 87 %, а предсказательная ценность отрицательного диагноза - 95,2 %. Авторами установлены статистически достоверные различия значений лектинсвязанных антигенов между здоровыми женщинами и пациентками с диагнозом рака шейки матки (p < 0,001), а также между пациентками с доброкачественными и злокачественными заболеваниями (p < 0,001). По своим основным параметрам (чувствительность, специфичность) новый лектин-иммуноферментный метод превосходит известные методы определения опухолевых маркеров РЭА (общей концентрации) и SCC в сыворотке крови [9, 24].
Поскольку для количественного определения лектин-субстратного комплекса в данном методе, как и для лектина CGL, требуется дополнительное получение антител к MBL-AJ, меченных пероксидазой А хрена, представляется перспективным использовать CmAP в качестве цветного маркера для визуализации образовавшихся комплексов при лектин-иммуноферментном анализе. Для этого использовали генно-инженерные подходы. После того как была установлена структура лектина дальневосточного трепанга MBL-AJ (GenBank: AAT42221), появилась возможность разработать методы получения рекомби-нантного аналога MBL-AJ [2]. Однако рекомбинантный лектин выпадал в труднорастворимый осадок, который после рефолдинга в восстанавливающих условиях проявлял лишь 60 % иммуногенных свойств природного белка MBL-AJ. В результате использования генно-инженерных CmAP-содержащих химерных конструкций для синтеза рекомбинантного лектина MBL-AJ удалось получить полностью растворимый бифункциональный гибрид CmAP/MBL-AJ с активностью ЩФ морской бактерии и специфичностью маннансвязыва-ющего лектина MBL-AJ. Такая оптимальная конструкция представляет из себя плазмиду pET40CmAP/MBL-AJ. Плазмида состоит из 8194 пар оснований и характеризуется наличием NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и последовательности фрагмента ДНК размером 2034 п.о., содержащего химерный ген, начинающий трансляцию со щелочной фосфатазы CmAP (N-конец) и заканчивающийся маннансвязывающим лекти-ном С-типа MBL-AJ с С-концевой части молекулы рекомбинантного белка, соединенным со щелочной фосфатазой гибким линкером (G)4S(G)4S(G)4SEL (рис. 3).
Для выяснения структурных особенностей и углеводной специфичности маннан-связывающего лектина трепанга A. japonicus проведен молекулярный докинг лектина с модельным манноолигосахаридом. На основе этих данных в лектин были введены точечные аминокислотные замены с целью исследования его взаимодействия с лигандом (см. таблицу).
Лектин MBL-AJ Сольватация*, kcal/mol Аффинность**, kcal/mol
Дикий тип W100A Q103H A156N F159K A156N/F159K -57,70 -7,69 -44,77 -5,66 -46,35 -6,62 -58,68 -8,49 -65,58 -8,21 -74,53 -9,49
Рис. 4. Результаты ИФА мутантных форм лектина в составе CmAP/MBL-AJ. В качестве лиганда использовали муцин желудка свиньи в одинаковой концентрации, химерные белки были двукратно разведены. По оси абсцисс - концентрация лиганда (нг/мл), по оси ординат - относительная активность CmAP/MBL-AJ, измеренная по активности CmAP (ОП при X = 400 нм)
Энергия взаимодействия и степень сродства
Рис. 3. Структурная модель мономера гибрида связывания MBL-AJс лигандами
CmAP/MBL-AJ. С-конец CmAP связан линкером (G4S)3 с N-концом MBL-AJ. Сферами обозначены ионы металлов: в CmAP - два иона Zn2+ и один ион Mg2+; в MBL-AJ - ион Ca2+
В результате тестирования полученных экспериментальным путем мутантных форм гибридного лектина методом лектин-ферментного анализа установлено, что при мутации W100A происходит уменьшение связывания лектина с лигандом на 14±3 %, соответствующее расчетным данным. Мутации Q103H и A156N приводили к ухудшению связывания лектина с лигандом соответственно на 12 и 8 %,
а замена а.о. F159K улучшала связывание с лигандом на 10 %. Однако наибольшей угле-вод-связывающей активностью обладал двойной мутант A156N/F159K, который показывал на 25 ± 5 % большую аффинность к муцину, чем гибрид с природным типом лектина (рис. 4). Кроме того, при использовании гибридного лектина чувствительность лектин-иммуноферментного метода повышалась в 2 раза по сравнению с чувствительностью природного лектина. Увеличение чувствительности может объясняться тем, что удельная активность используемой для визуализации лектин-субстратного комплекса пероксида-зы А хрена составляет 576 ед./мг, в то время как активность ЩФ в гибриде достигает 1500 ед./мг в 0,1 М трис-HCl буферном растворе и 5000 ед./мг в 1 М ДЭА.
Таким образом, использование высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP как ферментной метки для углеводсвязывающих рекомбинантных белков позволяет повысить не только эффективность методов исследования их структурно-функциональных особенностей, но и чувствительность лектин-иммуноферментных методов, а также уменьшить время проведения и стоимость ранней диагностики и дифференциации раковых опухолей.
* Обобщенные энергии взаимодействия - несвязанные взаимодействия между рецептором и лигандом, включая Ван-дер-Ваальсовые взаимодействия, взаимодействие Кулона и обобщенные неявные энергии взаимодействия растворителя.
** Предполагаемая аффинность - функция расчета GBVI/WSA dG.
ЛИТЕРАТУРА
1. Булгаков А.А., Родионова О.М., Апаносевич В.И., Петрова И.Ю., Елисейкина М.Г. Способ диагностики рака шейки матки: пат. 2343485 Российская Федерация. 2007.
2. Василенко А.А., Ковальчук С.Н., Булгаков А.А., Петрова И.Ю., Рассказов В.А. Получение и рефолдинг рекомбинантного маннан-связывающего лектина голотурии Apostichopus japonicus // Биология моря. 2012. Т. 38, № 1. C. 72-78.
3. Галич И.П., Евтушенко Н.В. Изменение гликозилирования при онкогенезе и развитии других патологических процессов // Онкология. 2003. Т. 5, № 1. C. 4-9.
4. Фуртак В.А., Тихонов Я.Н., Чикаловец И.В., Лукьянов П.А. Гистопатология рецепторов лектина CGL в спинномозговых ганглиях крыс // Тихоокеан. мед. журн. 2000. № 4. С. 41-43.
5. Фуртак В.А., Курика А.В., Белогорцева Н.И., Чикаловец И.В., Клещенко Ю.Е. Клеточная локализация рецепторов муцинового типа, выявляемых новым GalNac/Gal-специфичным лектином из морской мидии Crenomytilus grayanus в опухолях толстой кишки человека // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1999. Т. 128, № 10. С. 441-444.
6. Чикаловец И.В., Молчанова В.И., Булгаков А.А., Черников О.В., Петрова И.Ю., Лукьянов П.А. Использование лектинов морских гидробионтов для диагностики ряда социально значимых заболеваний человека // Вестн. ДВО РАН. 2010. № 5. С. 125-130.
7. Чиссов В.И., Старинский В.В., Сотникова Е.Н. Ранняя диагностика онкологических заболеваний. М.: Медицина, 1994. 193 с.
8. Bulgakov A.A., Eliseikina M.G., Petrova I.Yu., Nazarenko E.L., Kovalchuk S.N. Isolation and properties of a mannan-binding lectin from the holothurian Apostichopus japonicus // Glycobiology. 2007. Vol. 17, N 12. P. 1284-1298.
9. Chi-Mou Juang M.D., Peng-Hui Wang M.D., Ming-Shien Yen M.D., Chiung-Ru Lai M.D., Heung-Tat Ng M.D., Chiou-Chung Yuan M.D. Application of Tumor Markers CEA, TPA, SCC-Ag in Patients with Low-Risk FIGO Stage IB and IIA Squamous Cell Carcinoma of the Uterine Cervix // Gynecologic Oncology. 2000. Vol. 76 (1). P. 103-106.
10. Cordell J.L., Falini B.A., Erber W.N., Ghosh A.K., Abdulaziz Z., MacDonald S., Pulford K.A., Stein H., Mason D.Y. Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase // JHC. 1984. Vol. 32. P. 219-229.
11. Davina J.H.M., Stadhouders A.M., Haelst U.J.G.M. van, Lamers G.E.M., Kenemans P. Concanavalin A Peroxidase labeling in cervical exfoliative cytopathology // Gynecol. Oncology. 1985. Vol. 22 (2) . P. 212-223.
12. Fanayan S., Hincapie M., Hancock W.S. Using lectins to harvest the plasma/serum glycoproteome // Electrophoresis. 2012. Vol. 33 (12). P. 1746-1754.
13. Hess B., Kutzner C., van der Spoel D., Lindahl E. GROMACS 4: algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation // J. Chem. Theory Comp. 2008. Vol. 4. P. 435-447.
14. Kuzmanov U., Kosanam H., Diamandis E.P. The sweet and sour of serological glycoprotein tumor biomarker quantification // BMC Medicine. 2013. Vol. 11. P. 31.
15. Menzorova N.I., Seytkalieva A.V., Rasskazov V.A. Enzymatic methods for the determination of pollution in seawater using salt resistant alkaline phosphatase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus intermedius // Mar. Pollut. Bull. 2014. Vol. 79. P. 188-195.
16. Reddi A.L., Sankaranarayanan K., Arulraj H.S., Devaraj N., Devaraj H. Enzime-linked PNA lectin-binding assay of serum T-antigen in patient with SCC of the uterine cervix // Cancer Letters. 2000. Vol. 149. P. 207-211.
17. Sayler G.S., Puziss M., Silver M. Alkaline phosphatase assay for fresh water sediments: application to perturbed sediment systems // AEM. 1979. Vol. 38. P. 922-927.
18. Schaap P., Akhavan H., Romano L.J. Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes // Clinic. Chem. 1989. Vol. 35. P. 1863-1864.
19. Szeberenyi J. Problem-solving test: DNA manipulation with alkaline phosphatase and polynucleotide kinase // Biochem. Mol. Biol. Educ. 2014. Vol. 42 (4). P. 348-350.
20. Takahashi K., Moyo P., Chigweshe L., Chang W.C., White M.R., Hartshorn K.L. Efficacy of recombinant chimeric lectins, consisting of mannose binding lectin and L-ficolin, against influenza A viral infection in mouse model study // Virus Res. 2013. Vol. 178 (2) P. 495-501.
21. Tu Z., Ke L.-H., He G. The application of alkaline phosphatase labeled HBV probe in serum detection // Virus Genes. 2004. Vol. 28. P. 151-156.
22. Urban R.G., Dreyfus L.A., Whipp S.C. Construction of a bifunctional Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STb)-alkaline phosphatase fusion protein // Infect. Immun. 1990. Vol. 58 (11). P. 3645-3652.
23. Wang H., Gao J., Wong A.H., Hu K., Li W., Wang Y., Sang J. Rfa2 is specifically dephosphorylated by Pph3 in Candida albicans // Biochem. J. 2013. Vol. 449(3). P. 673-681.
24. Yuan C.C., Wang P.H., Ng H.T., Tsai L.C., Juang C.M., Chiu L.M. Both TPA and SCC-Ag levels are prognostic even in high-risk stage Ib-IIa cervical carcinoma as determined by a stratification analysis // Eur. J. Gynaecol. Oncol. 2002. Vol. 23 (1). P. 17-20.
25. Zhang X., Xie J., Sun Y., Xu H., Du T., Liu Z., Chen J., Zheng Z., Liu K., Zhang J., Kan M., Li X., Xiao Y. High-level expression, purification, and characterization of bifunctional ScFv-9R fusion protein // Appl. Microbiol. Bio-technol. 2014. Vol. 98 (12) P. 5499-5506.
