CC BY
9
УДК 582.998.16:581.46:54.061/.062:547.587 DOI: 10.15587/2313-8416.2016.67614
РОЗРОБКА МЕТОДИКИ 1ДЕНТИФ1КАЦ11 ФЕНОЛЬНИХ СПОЛУК У ПИЖМА КВ1ТКАХ
© М. Ю. Золотайкша, Т. М. Гонтова, Е. Е. Котова, А. Г. Котов, С. М. Губарь
Tanacetum vulgare L. - широко розповсюджена на територи Украши рослина, яка мае значну сировинну базу. Bidcymmcmb нацiонально'i нормативноi документаци на цей вид сировини вказуе на актуальтсть доcлiджень у цьому напрямку та розробку сучасних методiв iдентифiкацii фенольних сполук, як основно'1' групи бiологiчно активнихречовин (БАР).
Мета. Розробка методики iдентифiкацii фенольних сполук у квтках пижма звичайного, гармошзовано '1' з вимогами Свропейсько1' фармакопе'1' (€Ф).
Методи. Для досягнення поставлено'1' мети використовували утфшовану ТШХ-методику, яка описана у монографiях Державно'1' фармакопе'1' Украти (ДФУ) для iдентифiкацii фенольних сполук в ргзних видах ЛРС. Проводили визначення валiдацiйних характеристик методики для до^джуваного виду сировини. Результати. Розроблено методику iдентифiкацii фенольних сполук методом ТШХ у сировиш пижма квтки з урахування сучасних пiдходiв СФ до стандартизаци ЛРС. Валiдацiю методики iдентифiкацii проводили за такими валiдацiйними характеристиками як cпецифiчнicть, робастсть i прецизштсть. Ця методика запропонована для включення у монографт «Пижма звичайного квтки» до ДФУ. Висновки. Вперше розроблено методику iдентифiкацii суми фенольних речовин у квтках пижма звичайного методом ТШХ. У результатi валiдацii методики iдентифiкацii фенольних сполук за валiдацiй-ними характеристиками (cпецифiчнicть, робастсть i прецизштсть) були обран наступш умови хро-матографування: ТШХ-пластинки з шаром cилiкагелю на алюмiнiевiй тдложщ, об 'ем нанесення як дос-лiджуваних зразюв так i стандартних зразюв 10 мкл, рухома фаза: мурашина кислота безводна-вода-метилетилкетон-етилацетат у cпiввiдношеннi (10:10:30:50), виявлення - обприскування розчинами амi-ноетилового ефiру дифенiлборноi кислоти в метанолi та макроголу в метанолi та перегляд при 365 нм. Методику визначення яюсного складу фенольних сполук пижма запропоновано для включення у проект монографи «Пижма звичайного квiтки»
Ключовi слова: лкарська рослинна сировина, cтандартизацiя, пижма квтки, флавоно1ди, метод тон-кошарово'i хроматографа
Tanacetum vulgare L. is widespread herb in Ukraine, having a substantial resource base. The absence of national normative documentation for this type of herbal material points to the relevance of research in this area and development of modern methods for identification of phenolic compounds as a main group of biologically active substances.
Aim. Development of harmonized with European Pharmacopoeia (PhEur) requirements method for identification ofphenolic compounds in Tansy flowers.
Methods. For the purpose mentioned above, a standardized TLC-method described in the State Pharmacopoeia of Ukraine (SPhU) monographs for identification of phenolic compounds in different types of herbal material was used. Validation parameters of the method for the studied herb were determined.
Results. A TLC method for identification of phenolic compounds in Tansy flowers considering modern PhEur approaches to standardization of herbs was developed. Validation of the identification method was carried out for the following validation parameters: specificity, robustness, and precision. This method was offered for implementation to the SPhU monograph «Tansy flowers».
Conclusion. TLC method for identification ofphenolic compounds in Tansy flowers was developed for the first time. As a result of validation of the given method for identification of phenolic compounds, by validation parameters (specificity, robustness, and precision), following chromatography conditions were selected: Silica gel coated Aluminum-backed TLC plates, application volume for both test samples and reference samples was 10 fl, mobile phase: formic acid concentrated - water - methyl ethyl ketone - ethyl acetate (10:10:30:50 V/V/V/V), detection - spraying with solutions of aminoethyl diphenylborinate in methanol and macrogol in methanol and view under 365 nm UV. The method for quantitative determination ofphenolic compounds in Tansy flowers was offered for implementation in «Tansy flowers» draft monograph
Keywords: herbal material, standardization, Tansy flowers, flavonoids, thin-layer chromatography method
1. Вступ
Tanacetum vulgare L. - широко розповсюджена на територи Украши рослина, яка мае значну сировинну базу. На вичизняному фармацевтич-ному ринку Украши представлен препарати -«Пижма квики» у пачках i фггочай «Гращя № 20
(Очищуючий)» виробництва ПрАТ «Лжтрави», м. Житомир; косметичний зааб «Угрин» (ВАТ '^м-фармзавод "Червона зiрка", м. Харшв), дiетичнi добавки «Фггочай № 5 противоглисний» («Naturalis», м. Житомир), «Пижма» таблетки (ТОВ «Фь рма «Дашка»).
2. Постановка проблеми у загальному ви-глядi, актуальнiсть теми та и зв'язок з важливими науковими чи практичними питаннями.
У лиературних першоджерелах дiючi речо-вини сировини пижма звичайного представленi де-шлькома класами бiологiчно активних речовин (БАР), серед яких переважають фенольнi сполуки, а саме: флавоно!ди - лютеолш, лютеолiн-7-глiкозид, акацетин, кверцетин, цинарозид, космосе!н, тiллiа-нiн, рутин; гiдроксикоричнi кислоти - хлорогенова та кофейна; також мктить ефiрну олiю, до складу яко! входить туйон, камфора, борнеол тощо; алкало-!ди, гiркоти, оргашчт кислоти [1-3]. Це обумовлюе широкий спектр фармаколопчно! активностi дано! лжарсько! рослинно! сировини (ЛРС) тако! як, анти-гельмiнтна, жовчогiнна, протизапальна, жарозни-жуюча, сечогiнна, гiпертензивна, знеболююча [4]. Вщсутшсть нацiонально! нормативно! документацп на цей вид сировини вказуе на актуальшсть досль джень у цьому напрямку та розробку сучасних ме-тодiв щентифжацп фенольних сполук, як основно! групи БАР.
3. Анагаз останнiх дослiджень i публiкацiй
Проведено критичний аналiз юнуючо! документацп на сировину пижма звичайного [5-7]. Яшсть квiток пижма звичайного на сьогодшшнш день регламентуеться Державною фармакопеею СРСР XI (ДФ XI), що була розроблена 25 рошв тому та сучасними фармакопеями - Державною фармакопеею Росшсько! Федерацп (ДФ РФ XII) i Державною фармакопеею Республiки Бшорусь (ДФ РБ). Крiм того, дана сировина описана в Британсь-кш гомеопатичнiй Фармакопе! (BHP). Проте моно-графiя на пижма квiтки у Державнш фармакопе! Укра!ни вiдсутня.
4. Видшення iieiuipiiiieiiiix рашше частин загальноТ проблеми
Iдентифiкацiя квiток пижма звичайного у мо-нографi! «Квiтки пижма», вщповщно до ДФ XI проводиться, за макро- та мжроскошчними ознаками. Роздш «Макроскопiя» регламентуе опис лише ко-шик1в. Дiагностичнi ознаки загального ложа коши-к1в, трубчастих квiток, чашечки, верхiвкового листя та стеблових частин генеративного пагону не рег-ламентуються, але е складовими сировини. У зв'язку з цим, нами проведет дослщження у цьому напрямку, що будуть запропоноваш у проектi моно-графп «Пижма звичайного квiтки» для ДФУ [10]. Обов'язковою вимогою ДФУ до ЛРС е щентифжа-щя основних БАР за допомогою сучасних аналггич-них методiв, таких як ТШХ, ГХ, ВЕРХ [8, 9]. БАР у сировиш пижма не визначаються за допомогою жо-дного фiзико-хiмiчного методу. Для проведення iдентифiкацi! нами обрано експрес метод - ТШХ аналiз, тому що вш е достовiрним, доступним та економiчно виправданим.
Отже, очевидна актуальшсть розробки методики вдентифжацп фенольних сполук у кытках пижма звичайного за допомогою ТШХ анатзу.
5. Формулювання мети (задач) статтi
Розробка методики щентифжацп фенольних
сполук у квитах пижма звичайного методом ТШХ, гармошзовано! з вимогами £Ф до ЛРС.
6. Виклад основного матерiалу дослщження (методiв i об'eктiв) з обгрунтуванням отриманих результатiв
Для дослвдження використовували 7 зразк1в сировини пижма звичайного, з1браних у р1зних репо-нах Укра!ни у 2014 рощ, а саме: Харшвсько! (1), Сумсько! (2), Льв1всько! (3), Полгавсько! (4), Доне-цько! (5), Чершпвсько! (6) та Лугансько! (7) областей. Ус1 зразки заготовляли самостшно, збирали у липш мюящ тд час масового цвтння, висушували та збертали ввдповщно до правил загот1вл1 ЛРС.
Розробка методики iдентифiкацii фенольних сполук методом ТШХ. Для досягнення поставлено! мети використовували ушфжовану ТШХ-методику, яка описана в монографиях ДФУ для щентифжацп фенольних сполук в р1зних видах ЛРС [11]. Наша робота складалася з наступних еташв: встановлення основно! групи БАР за лгтературними джерелами, що е специф1чними для пижма киток; виб1р станда-ртних зразшв; виб1р умов хроматографування. Валь дацш методики щентифжацп проводили за такими валщацшними характеристиками як специф!чшсть, робасшсть 1 прецизшшсть. Вивчення робасносп проводили визначенням впливу типа пластинки, насиченосп камери, об'ему нанесення та впливу проявника. Специф!чшсть методики вивчали, порь внюючи хроматограф1чний профшь випробовуваних розчишв сировини !з зонами стандартних зразшв. Прецизшшсть методики вивчали, пор1внюючи хро-матограф!чш профш випробовуваних зразшв сировини, одержан! на р!зних пластинках, р!зними ана-л!тиками, в р!зш дн!.
Результати проведеного л1тературного анал1зу показали, що для сировини пижма характерними е так! класи сполук як флавоно!ди та г!дроксикоричн! кислоти. Тому було виршено проводити щентифжа-ц1ю саме за цими класами сполук. Зпдно анал!зу ре-зультат!в наукових робгт, представлених у професш-них фахових виданнях, встановлен! специф!чн! речо-вини, за якими доречно проводити щентифжащю, а саме лютеол1н, лютеол!н-7-гл!козид, хлорогенова та кофейна кислоти [12].
При розробщ методики нами були використан! ТШХ-пластинки з шаром силжагелю (5-40 мкм) !з р!зними п1дложками, а саме скляною ! алюмшевою. Результати оц!нювали, з точки зору вщтворюваносп хроматограф!чного профшю, отриманого на р!зних пластинках. Для подальших досл1джень було обрано ТШХ-пластинки з шаром силжагелю на алюмшевш шдложщ. У процес! розробки використовували р!зш об'еми нанесення - 10 мкл, 20 мкл та 50 мкл. В результат! експерименту було пщбрано необх!дн! об'еми нанесення випробовуваного розчину ! розчи-н!в пор!вняння, яш склали 10 мкл, що дозволяють отримати репрезентативн! та вщтворюваш хроматог-рами. При вибор! рухомо! фази ! в!дпов!дних умов
детектування для щентифшаци флавонощв 1 пдрок-сикоричних кислот у сировиш пижма, нами були використаш наступш умови.
Перш1 умови. Рухома фаза: оцтова кислота льодяна-вода-бутанол у сшвввдношенш (17:17:66), виявлення - обприскування розчинами амшоетило-вого еф1ру дифеншборно! кислоти в метанол1 та мак-
роголу в метанол1 та перегляд при 365 нм. Даш умови описаш в монографи ДФУ «Римськог ромашки квтки» при вдентифжаци в сировиш флавоно!дних сполук (лютеол1ну, ашгешну, лютеолш-7-глюкозиду та ш.). Хроматограми випробовуваних розчишв р1з-них зразк1в пижма квггок, одержат в умовах зазна-чено1 методики, наведено на рис. 1.
5 6 7 ст 1 ст 2 ст 3
Рис. 1. Хроматограми метанольних екстракпв пижма квгток, заготовлених у р1зних областях Украши, та стандартних
зразкв 1-3: 1 -Харквська обл.; 2 - Сумська обл.; 3 - Льв1вська обл.; 4 - Полтавська обл.; 5 - Луганська обл.; 6 - Чершпвська обл.; 7 - Донецька обл.; ст. 1 - стандартш зразки лютеолшу (верхня зона) та лютеолшу-7-глюкозиду (нижня зона); ст. 2 - стандартш зразки рутину та хлорогеново! кислоти; ст. 3 - стандартний зразок кофейно! кислоти
Друп умови. Рухома фаза: мурашина кислота безводна-вода-метилетилкетон-етилацетат у сшвввд-ношенш (10:10:30:50), виявлення - аналопчно першим умовам. Даш умови е ушфжованими 1 викорис-товуються в дешлькох монограф1ях ДФУ («Берези
листя», «Бузини квтки»,» Глоду листя та квтки», «Глоду плоди», «Липи квтки» та т.). Хроматограми випробовуваних розчишв р1зних зразшв пижма квь ток, одержат в умовах зазначено! методики, наведено на рис. 2.
Рис. 2. Хроматограми метанольних екстракпв пижма кыток, заготовлених у р1зних областях Украши, та стандартних
зразюв: 1 - Харквська обл.; 2 - Сумська обл.; 3 - Льв1вська обл.; 4 - Полтавська обл.; 5 - Луганська обл.; 6 - Чершпвська обл.; 7 - Донецька обл.; ст. 1 - стандартний зразок лютеолшу (верхня зона) та лютеолшу-7-глюкозиду (нижня зона); ст. 2 - стандартний зразок кофейно! кислоти; ст. 3 - стандартний зразок хлорогеново! кислоти
Як видно iз наведених даних рис.1, 2, хромато-графiчнi профш випробовуваних розчишв, одержат в рiзних умовах, дуже близькi, вибiр був зупинений на 2 умовах, осшльки вони е ушфжованими. ^енти-чш результати були отриманi також при вивченш прецизiйностi методики - хроматографiчнi профiлi випробовуваних розчинiв не змшювалися при отри-маннi на рiзних серiях пластинок, рiзними аналиика-ми, в рiзнi днi.
У результата проведеного дослвдження 7 серiй квпок пижма виявлено 6 основних характерних зон на хроматографiчному профiлi випробовуваних розчишв, одержаних iз сировини, з яких вдентифжова-но 3 зони у порiвняннi iз зонами стандартних зраз-к1в. Всi дослвджуваш зразки сировини мiстили лютеолш, лютеолiн-7-глiкозид та хлорогенову кислоту. Наявшсть кофейно! кислоти не вiдмiчалася у жод-ному зразку.
У результата вивчення хроматографiчного профiлю екстрактiв сировини було встановлено, що серед флавоно!дних сполук переважають представ-ники флавонiв. Такий факт сввдчить про перспектив-нiсть розробки методики шльшсного визначення су-ми флавонощв iз перерахунком на лютеолш, що бу-де проведено у наших подальших дослвдженнях.
7. Висновки
Вперше розроблено методику iдентифiкацi! суми фенольних речовин у квитах пижма звичайного методом ТШХ.
У результата ватдацд методики вдентифжацп фенольних сполук за валщацшними характеристиками (специфiчнiсть, робаснiсть i прецизiйнiсть) були обранi наступнi умови хроматографування: ТШХ-пластинки з шаром силжагелю на алюмiнiевiй шдло-жщ, об'ем нанесення як дослiджуваних зразшв так i стандартних зразкiв 10 мкл, рухома фаза: мурашина кислота безводна-вода-метилетилкетон-етилацетат у сшввщношенш (10:10:30:50), виявлення - обприску-вання розчинами амiноетилового ефiру дифеншбор-но! кислоти в метанолi та макроголу в метанолi та перегляд при 365 нм.
Методику визначення яшсного складу фено-льних сполук пижма запропоновано для включення у проект монографй' «Пижма звичайного квпки».
Лiтepатуpа
1. Хворост, П. П. Желчегонные вещества пижмы обыкновенной [Текст] / П. П. Хворост, Г. В. Оболенцева, Н. Ф. Комиссаренко. - К.: Наук. думка, 1984. - 137 с.
2. Яковлева, А. И. Биологически активные вещества пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L., произростаю-щей в центральной Якутии [Текст] / А. И. Яковлева, В. В. Семенова // Химия растительного сырья. - 2010. -№ 3. - С. 147-152.
3. Kurkin, V. A. The flavonoids as the criteria of the identity and quality of the medicinal plants and phyto-pharmaceuticals [Text] / V. A. Kurkin, E. V. Avdeeva, A. V. Kur-kina et al. // Drug Discovery & Therapy. - 2013. - P. 170.
4. Путырский, И. Универсальная энциклопедия лекарственных растений [Текст] / И. Путырский, В. Прохоров. - Мн.: Книжный дом; Махаон, 2000. - 656 с.
5. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Т. 2 [Текст]. - Контроль качества вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья. - М.: Победа, 2008. - С. 399-400.
6. Государственная фармакопея Российской Федерации XII издания. Ч. 1 [Текст]. - М.: Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. - 704 с.
7. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2 [Текст]. - Общин методы анализа. Лекарственное растительное сырье. - 11-ое изд. - М.: Медицина, 1990. - С. 247-249.
8. Котов, А. Г. Фармакопейные аспекты стандартизации качества лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе [Текст]: автореф. дис. ... д-ра фарм. наук / А. Г. Котов. - Харьков, 2013. - 40 с.
9. Котов, А. Г. Правила викладання та порядок роз-робки монографш на лжарську рослинну сировину [Текст] / А. Г. Котов // Управлшня, економжа та забезпечення якосп в фармаци. - 2011. - № 6 (20). - С. 16-22.
10. Золотайкша, М. Ю. Морфолого-анатомiчнi ознаки надземних оргашв пижма звичайного [Текст] / М. Ю. Золотайкша, Л. М. ^ра, Т. М. Гонтова // Фармацев-тичний часопис. - 2016. - № 1. - С. 23-29.
11. Котова, Е. Е. Систематизащя фармакопейних ви-мог до методв контролю якосп лжарсько! рослинно! сировини. Утфжоват ТШХ-методики щентифжацп [Текст] / Е. Е. Котова, А. Г. Котов // Фармаком. - 2015. - № 1. -С. 41-47.
12. Куркина, А. В. Исследование флавоноидного состава цветков пижмы обыкновенной [Текст] / А. В. Кур-кина // Химия природних соединений. - 2011. - № 4. -С. 209-212.
References
1. Hvorost, P. P., Obolenceva, G. V., Komissarenko, N. F. (1984). Zhelchegonnye veshhestva pizhmy obyknovennoj. Kyiv: Nauk. dumka, 137.
2. Jakovleva, A. I., Semenova, V. V. (2010). Biolog-icheski aktivnye veshhestva pizhmy obyknovennoj Tanacetum vulgare L., proizrostajushhej v central'noj Jakutii. Himija ras-titel'nogo syr'ja, 3, 147-152.
3. Kurkin, V. A., Avdeeva, E. V., Kurkina, A. V. et al. (2013). The flavonoids as the criteria of the identity and quality of the medicinal plants and phytopharmaceuticals. Drug Discovery & Therapy, 170.
4. Putyrskij, I., Prohorov, V. (2000). Universal'naja jenciklopedija lekarstvennyh rastenij. Minsk: Knizhnyj dom; Mahaon, 656.
5. Gosudarstvennaja farmakopeja Respubliki Belarus'. Vol. 2 (2008). Kontrol' kachestva vspomogatel'nyh veshhestv i lekarstvennogo rastitel'nogo cyr'ja. Moscow: Pobeda, 399-400.
6. Gosudarstvennaja farmakopeja Rossijskoj Feder-acii XII izdanija. Chep. 1 (2008). Moscow: Izdatel'stvo «Nauchnyj centr jekspertizy sredstv medicinskogo prime-nenija», 704.
7. Gosudarstvennaja farmakopeja SSSR. Issue 2 (1990). Obshhin metody analiza. Lekarstvennoe rastitel'noe syr'e. Moscow: Medicina, 247-249.
8. Kotov, A. G. (2013). Farmakopejnye aspekty standartizacii kachestva lekarstvennogo rastitel'nogo syr'ja i preparatov na ego osnove. Kharkiv, 40.
9. Kotov, A. G. (2011). Pravyla vykladannja ta porja-dok rozrobky monografij na likars'ku roslynnu syrovynu. Up-ravlinnja, ekonomika ta zabezpechennja jakosti v farmacii', 6 (20), 16-22.
10. Zolotajkina, M. Ju., Sira, L. M., Gontova, T. M. (2016). Morfologo-anatomichni oznaky nadzemnyh organiv pyzhma zvychajnogo. Farmacevtychnyj chasopys, 1, 23-29.
