CC BY
56
УДК 635.21:631.531.02
рост и развитие ростковых черенков картофеля IN vitro ПРИ использовании препарата SKQ1
П.А. ГАЛУШКА, аспирант
А.И. УСКОВ, кандидат биологических наук, зав. отделом
Д.В. КРАВЧЕНКО, кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник
ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН E-mail: [email protected]
Резюме. Для ускорения процессов морфогенеза ростковых черенков картофеля сортов Жуковский ранний и Крепыш в культуре in vitro использовали синтезированные в НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского (МГУ) специфические регуляторы внутриклеточного баланса активных форм кислорода - митохондриально ориентированные антиоксиданты SkQ, которые представляют собой соединения проникающего катиона трифенилдецилфос-фония и производныхпластохинонахлоропластов. Препарат добавляли в питательную среду МурасигеСкуга (МС) после авто-клавирования в концентрациях 0,25 и 2,5 нМ.
Использование SkQ1 в дозе 0,25 нМ не оказывало влияния на морфогенную активность ростковых черенков.
В случае применения SkQ 1 в концентрации 2,5 нМ общее количество морфогенноактивных ростковых черенков для сорта Жуковский ранний через 20 дней после посадки в среднем за два года составляло - 40 % против 15 % в контроле, через 40 дней - 67,5 % против 55 %, у сорта Крепыш оно увеличивалось с 17,5 до 27,5 % и с 52,5 до 57,5 % соответственно. В этом же варианте через 40 дней после введения в культуру in vitro количество черенков с признаками ризогенеза возрастало, по сравнению с контролем, у сорта Жуковский ранний на 12,5 %, у сорта Крепыш - на 23,5 %, а высота микрорастений регенерантов увеличилась на 15 и 9 мм соответственно. Через 40 дней культивирования на среде с SkQ 1 (2,5 нМ) к первому черенкованию были пригодны 62 % растений сорта Жуковский ранний и 47 % сорта Крепыш, против соответственно 29 и 21 % в контроле.
В среднем за годы исследований общий выход стеблевых черенков после первого черенкования микрорастений-регенерантов при добавлении SkQ 1 (2,5 нМ) для сорта Жуковский ранний возрастал в 2,7раза, для сорта Крепыш - в 1,9раза.
Ключевые слова: ростковые черенки, культура in vitro, ионы Скулачева.
Начальный этап воспроизводства исходного материала в семеноводстве картофеля - получение оздоровленных исходных растений, свободных от патогенов, которые обладают физиологическим статусом, обеспечивающим высокую энергию роста и продуктивность [1].
Один из лимитирующих факторов, сдерживающих ускоренное размножение, - время регенерации микрорастений из эксплантов и черенков при введении базовых клонов в культуру in vitro. В целях его сокращения перспективно использование биологически активных веществ (БАВ), ускоряющих процессы морфогенеза [2].
Цель наших исследований - оптимизация процесса воспроизводства исходного материала, направленная на сокращение времени культивирования микрорастений в условиях in vitro с использованием ускоряющих регенерацию микрорастений биологически активных веществ.
Условия, материалы и методы. Исследования по изучению роста и развития ростковых черенков в условиях in vitro проводили в 2008-2009 гг. во ВНИИКХ на сортах с различной длиной вегетационного периода: Жуковский ранний - 70...80 дней (супер-ранний) и Крепыш
- 80.90 дней (ранний).
Для ускорения процессов морфогенеза использовали синтезированные в НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского (МГУ) специфические регуляторы внутриклеточного баланса
активных форм кислорода (АФК) - митохондриальноориентированные антиоксиданты SkQ, которые представляют собой соединения проникающего катиона три-фенилдецилфосфония и производных пластохинона хлоропластов [3, 4].
Для закладки опытов использовали ростковые черенки. Схема опыта включала применение препарата SkQ1 (10- (6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфониум) в концентрациях 0,25 и 2,5 нМ. Повторность опыта - 20 черенков на вариант. В контроле растения выращивали на обычной среде. Препарат SkQ1 добавляли в питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) после автоклавирования.
Математическую обработку результатов опыта проводили с использованием дисперсионного анализа [5].
результаты и обсуждение. Добавление в искусственную питательную среду ионов Скулачева (SkQ1) способствовало развитию морфогенеза ростковых черенков в культуре in vitro. Наиболее выраженно это воздействие проявлялось в первые 2.3 недели после введения черенков в культуру.
Так, общее количество морфогенноактивных ростковых черенков при использовании препарата SkQ1 в концентрации 2,5 нМ для сорта Жуковски й ранни й через 20 дней после посадки в среднем за два года составляло - 40 % против 15 % в контроле, через 40 дней после посадки - 67,5 % против 55 %. Общее количество морфогенных ростковых черенков сорта Крепыш увеличивалось с 17,5 до 27,5 % и с 52,5 до 57,5 % соответственно (табл. 1).
Таблица 1. Изменение количества морфогенных ростковых черенков в зависимости от концентрации препарата SkQ1__________________________
Сорт Вариант 2008 г. 2009 г. Среднее
шт.| % шт.\ % шт. %
Жу- через 20 дней после посадки
ков- МС (контроль) 4 20 2 10 3,0 15,0
ский- МС+SkQ1 (0,25 нМ) 4 20 -- - -
ран- МС+SkQ1 (2,5 нМ) 6 30 10 50 8,0 40,0
ний через 40 дней после посадки
МС (контроль) 17 85 5 25 11,0 55,0
МС+SkQ1 (0,25 нМ) 15 75 -- - -
МС+SkQ1 (2,5 нМ) 17 85 10 50 13,5 67,5
Кре- через 20 дней после посадки
пыш МС (контроль) 2 10 5 25 3,5 17,5
МС+SkQ1 (0,25 нМ) -- - -
МС+SkQ1 (2,5 нМ) 4 20 7 35 5,5 ю - см
через 40 дней после посадки
МС (контроль) 14 70 7 35 10,5 52,5
МС+SkQ1 (0,25 нМ) -- - -
МС+SkQ1 (2,5 нМ) 13 65 10 50 11,5 57,5
Добавление в среду препарата SkQ1 в концентрации 0,25 нМ не оказывало влияния на морфогенную активность ростковых черенков сорта Жуковский ранний.
Следует также отметить более высокую отзывчивость на применение ионов Скулачева ростковых черенков сорта Жуковский ранний, по сравнению с сортом Крепыш. Как правило, при использовании SkQ1 в концентрации 2,5 нМ у сорта Жуковский ранний наблюдали на 2.3 шт., или на 10.12,5 % больше морфогенноактивных ростковых черенков, чем у сорта Крепыш.
Добавление ионов Скулачева в питательную среду МС стимулировало процессы ризогенеза у ростковых черенков обоих изучаемых сортов. В среднем за два года исследований их количество через 40 дней после введения в культуру in vitro возрастало в варианте с SkQ1 (2,5 нМ) у сорта Жуков-
— Достижения науки и техники АПК, №04-2011
Таблица 2. Изменение количества ростковых черенков с признаками ризогенеза в зависимости от концентрации препарата SkQ1 (через 40 дней после введения в культуру in vitro)
Вариант 2008 г. 2009 г. Среднее
шт.\ % шт. 1 % шт. %
Жуковский ранний
МС (контроль) 16 80 4 20 10,0 5 0
МС+SkQI (0,25 нМ) 13 65 - - -
МС+SkQI (2,5 нМ) 15 75 10 50 12,5 Ю 2, 6
Крепыш
МС (контроль) 8 40 5 25 6,5 32,5
МС+SkQI (0,25 нМ) 6 30 - - - -
МС+SkQI (2,5 нМ) 12 60 10 50 11,0 5 0
ский ранний на 12,5 %, у сорта Крепыш - на 23,5 % (табл. 2).
Для характеристики морфогенеза ростковых черенков в культуре in vitro помимо времени инициации этих процессов более важное практическое значение имеет интенсивность их протекания, выражаемая временем регенерации и количеством микрорастений, получаемых из исходных черенков.
Таблица 3. Изменение высоты микрорастений в зависимости от концентрации препарата SkQ1 (через 40 дней после введения ростковых черенковв культуру in vitro)
Вариант Высота микрорастений, мм
2008 г. 1 2009 г. среднее
Жуковский ранний
МС (контроль) 36 34 35
МС+SkQI (0,25 нМ) 29 - -
МС+SkQI (2,5 нМ) 45 55 50
НСР095 8,6 Крепыш 13,2 -
МС (контроль) 26 25 26
МС+SkQI (0,25 нМ) 25 - -
МС+SkQI (2,5 нМ) 23 46 35
НСР095 6,9 14,6
Через 40 дней культивирования на среде с Бк01 (2,5 нМ) к первому черенкованию были пригодны 62 % растений сорта Жуковский ранний и 47 % сорта Крепыш, против соответственно 29 и 21 % в контроле [6]. Это позволило значительно повысить коэффициент размножения оздоровленных исходных растений.
В среднем за годы исследований общий выход стеблевых черенков после первого черенкования микрорастений, регенерированных из первоначально введенных в культуру 20 ростковых черенков, при культивировании материала на питательной среде МС с добавлением препарата Бк01 в концентрации 2,5 нМ для сорта Жуковский ранний возрастал в 2,7 раза, для сорта Крепыш - в 1,9 раза.
Таблица 4. Выход стеблевых черенков при использовании препарата Бк01 (после первого черенкования микрорастений-регенерантов)
Вариант
Число стеблевых черенков, шт. 2008 г. I 2009 г. I среднее
Жуковский ранний
МС (контроль) 12 10 11,0
МС+SkQ1 (0,25 нМ) 11 - -
МС+SkQ1 (2,5 нМ) 25 Крепыш 34 29,5
МС (контроль) 7 8 7,5
МС+SkQ1 (0,25 нМ) 7 - -
МС+SkQ1 (2,5 нМ) 18 10 14
В наших иследованиях высота микрорастений-регенерантов через 40 дней после введения ростковых черенков в культуру in vitro при добавлении в питательную среду МС препарата SkQ1 в концентрации 2,5 нМ была заметно больше. В среднем за 2 года достоверное ее увеличение, по сравнению с контролем, у сорта Жуковский ранний составило 15 мм, Крепыш - 9 мм.
При дальнейшем культивировании in vitro растения сорта Крепыш, выращенные из черенков на среде с SkQ1 в концентрации 2,5 нМ, через 15 дней превосходили контрольные по высоте в среднем за два года на 3 мм, сорта Жуковский ранний - на 6 мм. Через 30 дней культивирования у сорта Жуковский ранний различия между вариантами по высоте микрорастений сохранялись, а у сорта Крепыш нивелировались.
Выводы. Использование ионов Скулачева (SkQ1) в концентрации 2,5 нМ в целях стимулирования регенерации исходных микрорастений из ростковых черенков в культуре in vitro способствовует интенсификации процессов морфо- и ризогенеза и сокращению времени регенерации. В результате общий выход стеблевых черенков, полученных после первого черенкования микрорастений-регенерантов, возрастает в зависимости от сорта в 1,9-2,7 раза.
Литература.
1. Усков А.И. Воспроизводство оздоровленного исходного материала для семеноводства картофеля: обоснование стратегии. //Достижения науки и техники АПК, 2009. - № 6, с.30-33.
2. Усков А.И., Кравченко Д.В., Овечкин С.В. Влияние биологически активных веществ на рост и развитие оздоровленных растений картофеля при размножении в культуре in vitro /Вопросы картофелеводства. Материалы школы молодых ученых. -М.: ВНИИКХРоссехозакадемии, 2004. - с.50-55.
3. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации О2 как особая функция дыхательных систем клетки. // Биохимия, 1994. - т.59, вып.12, с.1910-1912.
4. Mitochondria - Targeted Plastoquinone Derivatives as Tools to Interrupt Execution of the Aging Program. 1. Cationic Plastoquinone Derivatives: Synthesis and in vitro Studies/Antonenko Y.N, Avetisyan A.V., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Chertkov V.A., Domnina L.V., Ivanova O.Yu., Izyumov D.S., Khailova L.S., Klishin S.S., Korshunova G.A., Lyamzaev K.G., Muntyan M.S., Nepryakhina O.K., Pashkovskaya A.A., Pletjushkina O.Yu., Pustovidko A.V., Roginsky V.A., Rokitskaya T.I., Ruuge E.K., Saprunova V.B., Severina I.I., Simonyan R.A., SkulachevI.V., SkulachevM.V., Sumbatyan N.V., Sviryaeva I.V., Tashlitsky V.N., Vassiliev J.M., Vyssokikh M.Yu., L.S. Yaguzhinsky L.S., Zamyatnin A.A. Jr., and V.P. Skulachev// Biochemistry (Moscow), 2008. - v.73, №12.-p.1273-1287.
5. Усков А.И., Кравченко Д.В., Галушка П.А. Влияние препарата SkQ1 на рост и развитие ростковых эксплантов картофеля в условиях in vitro. // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 8-12 сентября 2008 г. - с.420-421.
6. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
POTATO SPROUT CUTTINGS IN VITRO GROWTH AND DEVELOPMENT CHANGING BY SKQ1
PREPARATION USING P.A. Galushka, A.I.Uskov, D.V. Kravchenko
Summary. Skulachev,s ions (SkQ1 - 2,5 nM) using in vitro have intensified potato sprout cuttings morphogenesis processes and have reduced micro-plants regeneration time. Consequently total amount of stem cuttings, produced during the first regeneration cutting, have increased up 1,9-2,7 times according the genotype.
Key words: sprout cuttings, culture in vitro, Skulachev’s ions.
Достижения науки и техники АПК, №04-2011
41
