CC BY
26
УДК 616.728.3
РОЛЬ ПРООКСИДАНТНЫХ ПРОЦЕССОВ В НАРУШЕНИИ РЕДОКС-БАЛАНСА В КРОВИ И СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ГОНАРТРОЗЕ*
© 2013 г. А.А. Плотников
Плотников Андрей Александрович - аспирант, кафедра Plotnikov Andrey Alexandrovich - Post-Graduate Student,
биохимии и микробиологии, факультет биологических Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of
наук, Южный федеральный университет, ул. Большая Biological Sciences, Southern Federal University, B.
Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, Russia, 344006, e-
[email protected]. mail: [email protected].
Исследовано состояние прооксидантной системы в крови и синовиальной жидкости больных гонартрозом (ГА) в процессе консервативного и эндоартрохирургического лечения. Выявлено развитие окислительного стресса в крови и синовиальной жидкости (СЖ) больных ГА, что сопровождалось повышенной продукцией активированных кислородных метаболитов и активацией пе-рекисного окисления липидов. Интенсификация свободнорадикального окисления и усиление прооксидантных свойств СЖ больных ГА зависели от выраженности патологического процесса и тяжести оперативного вмешательства.
Ключевые слова: окислительный стресс, гонартроз, прооксиданты, синовиальная жидкость, плазма крови.
The aim of the present study to investigate the role of redox-balance disorder in blood and synovial fluid in patients with osteoarthritis of the knee joint during conservative and endоarthrosurgical treatment. Revealed the development of oxidative stress in the synovial fluid, which was accompanied by an increased production of reactive oxygen metabolites, and the activation of lipid peroxidation. Oxidative stress in synovial fluid depended on the severity pathological process and the methods of treatment.
Keywords: oxidative stress, osteoarthritis of the knee joint, prooxidants, synovial fluid, plasma of blood.
Гонартроз (ГА), или артроз коленных суставов, относится к мультифакториальным дегенеративно-дистрофическим заболеваниям с хроническим неуклонно прогрессирующим течением. ГА, как и артроз в целом, представляет серьезную социально-экономическую проблему и является одной из основных причин преждевременной потери трудоспособности и инвалидности.
Дегенеративно-дистрофические заболевания коленного сустава обнаруживаются приблизительно у 15^30 % населения и являются постоянно возрастающей медицинской и социальной проблемой. Ос-
новные механизмы развития артроза (в том числе ГА) связаны с дисбалансом процессов репарации и деградации матрикса хряща на фоне хронического воспаления в синовиальной оболочке, гиперэкспрессией провоспалительных цитокинов, активацией свободнорадикального окисления (СРО) в тканях сустава. Это в свою очередь приводит к развитию окислительного стресса, в индукции и развитии которого важнейшая роль отводится активированным кислородным метаболитам (АКМ), среди которых активным формам кислорода, азота и хлора, продуктам перекисного окисления липидов (ПОЛ), обла-
*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (гос. задание Минобрнауки 2013 г. № 4.5282.2011).
дающим высоким деструктивным потенциалом, придается особое значение [1, 2].
Цель работы - исследование состояния проокси-дантной системы в крови и синовиальной жидкости (СЖ) больных ГА в процессе консервативного и эн-доартрохирургического лечения.
Материалы и методы исследования
Проведено клинико-биохимическое обследование 102 больных ГА в возрасте 54,1±2,5 года. Их разделили на 4 группы: 1-я - пациенты, получавшие консервативное лечение; 2-я - пациенты, которым проводили артроскопию без повреждения костной основы; 3-я - с повреждением; 4-я - пациенты, которым проводили артротомию. Пациенты находились на лечении в Центральной городской больнице г. Ростова-на-Дону. В качестве контроля использовали кровь 20 практически здоровых людей - доноров обоего пола в возрасте 46,2±0,7 года.
Кровь собирали утром натощак из локтевой вены, в качестве антикоагулянта использовали К3-ЭДТА (2,0 мг/мл крови). Лимфоциты выделяли из цельной крови в градиенте плотности фиколл-верографина [3]. К полученной суспензии лимфоцитов добавляли неионный детергент «Тритон Х-100» в конечной концентрации 0,1 % для получения лизата, который затем анализировали. Образцы СЖ получали путем пункции коленного сустава, после чего пробы центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин и получали су-пернатант СЖ. Материалы для биохимического исследования: плазма крови, лизат лимфоцитов и СЖ, взятая из пораженных суставов пациентов.
Уровень свободнорадикальных процессов оценивали по интенсивности Н2О2-люминол-индуциро-ванной хемилюминесценции (ЛХЛ) [4], интенсивность ПОЛ определяли по содержанию ТБК-поло-жительных продуктов в пересчете на малоновый ди-альдегид (МДА) [5]. Для оценки состояния проокси-дантной системы крови и СЖ определяли активность прооксидантных ферментов - миелопероксидазы (МПО) и НАДФН-оксидазы. Активность МПО определяли спектрофотометрическим методом [6], активность НАДФН-оксидазы оценивали по восстановлению 2,6-дихлорфенилиндофенола (ДХФДФ) в присутствии НАДФН [7]. Определение уровня нитри-
Параметры ЛХЛ в СЖ
тов/нитратов (NOx ) в плазме крови проводили при помощи реактива Грисса после предварительного восстановления нитрата в нитрит гранулированным кадмием по методу [8]. Статистическую обработку данных проводили с помощью MS Excel 2007 и Statistica 6.0. Для каждой серии рассчитывали средние арифметические значения показателей и их стандартные ошибки (M±m). Анализ выпадающих значений проводили с использованием критерия Шовене. Для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали t-критерий Стьюдента. При p < 0,05 различия считали статистически значимыми, при 0,05 < p < 0,1 предполагали тенденцию к статистической значимости различий.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенного исследования установлено, что у больных ГА в СЖ происходит интенсификация свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствует повышение образования АКМ, определяемое по интенсивности хемилюминесценции СЖ. Выявляется повышение большинства параметров ЛХЛ в группах пациентов, которым применяли эндоартро-хирургические технологии по сравнению с 1 -й группой больных, которым проводили консервативное лечение (табл. 1).
Установлено, что в СЖ высота быстрой вспышки (h) возрастает на 21^71 % во 2^4-й группах больных, которым применяли эндоартрохирургические технологии по сравнению с пациентами, получавшими консервативное лечение.
Данный параметр указывает на предельно возможную интенсивность ПОЛ после введения гидро-пероксида, что наблюдается в 4-й группе пациентов, которым проводили артроскопию. Амплитуда медленной вспышки у больных 2^4-й групп возрастает на 41^54 % относительно 1-й группы. Этот показатель прямо пропорционален окисляемости тканевых липи-дов и концентрации металлов переменной валентности и обратно пропорционален содержанию эндогенных антиоксидантов. Увеличение светосуммы ЛХЛ на 34^61 % во 2^4-й группах позволяет сделать вывод о преобладании прооксидантного статуса СЖ по сравнению с больными 1 -й группы.
Таблица 1
при ГА, M±m, n=10-24
Группа обследованных Параметры ЛХЛ
Амплитуда быстрой вспышки (h), усл.ед., p (А %) Высота медленной вспышки (H), усл.ед., p (А %) Светосумма медленной вспышки (Sm), усл.ед., p (А %) Скорость окисления липидов (tga), усл.ед, p (А %)
1-я 56,55±3,78 44,28±4,71 270,65±32,95 41,19±4,77
2-я 68,30±4,05 0,05<p<0,1 (+21) 62,64±5,08 <0,05 (+41) 362,47±26,92 <0,05 (+34) 53,82±4,34 0,05<p<0,1 (+31)
3-я 74,76±1,59 <0,01 (+32) 68,30±2,66 <0,01 (+54) 381,31±25,71 <0,05 (+41) 57,17±4,65 <0,05 (+39)
4-я 75,55±2,67 <0,05 (+71) 87,19±8,35 <0,05 (+54) 435,30±19,48 <0,05 (+61) 74,92±2,82 <0,01 (+82)
Примечание. р (А %) - достоверность различий и различие, %, относительно доноров (плазма, мононуклеарная фракция крови) и по сравнению с 1-й группой больных (СЖ).
Скорость окисления липидов, о которой судят по величине тангенса угла наклона левого плеча медленной вспышки, возрастает в 3-й группе на 39, в 4-й - на 82 %, а во 2-й наблюдается тенденция к возрастанию на 31 %. Интенсификация ЛХЛ, показанная в СЖ больных ГА, может отражать повышенную продукцию таких АКМ, как супероксидный анион-радикал (О2 ),
Содержание МДА и N0 в плазме
гидроксильный радикал (ОН^) и гипохлорит, являющийся продуктом миелопероксидазной реакции.
Повышенная продукция АКМ в СЖ больных ГА приводит к активации ПОЛ и накоплению его промежуточного молекулярного продукта - МДА, уровень которого во 2^4-й группах больных возрастает на 64, 117 и 190 % относительно 1-й группы (табл. 2).
Таблица 2
крови и СЖ при ГА, М±т, п=10-41
Группа Плазма крови СЖ
МДА, нМ/мг белка, р (А %) NOx", мкМ/л, р (А %) МДА, нМ/мг белка, р (А %) NOx", мкМ/л, р (А %)
Доноры 18,76±0,44 16,31± 0,39 - -
1-я 22,68±0,95 0,05< p < 0,1 (+21) 19,80±1,78 >0,1 18,33±0,85 19,73±0,96
2-я 25,48±1,16 <0,05 (+36) 21,51±1,23 <0,05 (+32) 30,07±2,72 <0,001 (+64) 23,34±1,41 <0,05 (+18)
3-я 25,51±1,62 <0,01 (+36) 30,21±6,23 <0,01 (+85) 39,78±2,85 <0,001 (+117) 25,37±2,39 <0,05 (+21)
4-я 23,05±0,62 <0,001 (+23) 42,70±14,07 < 0,001 (+162) 53,17±12,27 <0,001(+190) 53,23±19,52 <0,001 (+133)
В плазме крови больных ГА также наблюдается накопление МДА, но значительно менее выраженное. Уровень МДА в плазме крови обследованных групп пациентов увеличивается на 21^36 % по сравнению с донорами.
Следует отметить, что все параметры ЛХЛ и уровень МДА в СЖ обследованных групп больных ГА прогрессивно увеличиваются с наивысшими значениями в группе пациентов, которым проведена артротомия, что коррелирует с тяжестью оперативного вмешательства. Это может свидетельствовать о том, что при хирургическом лечении артроза коленного сустава происходит интенсификация процессов СРО, которая зависит от травматичности применяемых артроскопических технологий.
По-видимому, увеличение интенсивности ПОЛ во 2-, 3-й группах пациентов может быть связано с операционным стрессом, который развивается при применении эндоартрохирургических технологий. Известно, что СРО усиливается при стрессе любой этиологии, а продукты ПОЛ рассматриваются как первичные медиаторы стресса [9].
Анализ динамики клеточного, гуморального и фагоцитарного звеньев иммунной системы также свидетельствует о зависимости параметров крови и СЖ от техники оперативного вмешательства [10].
Особая роль в патогенезе ГА принадлежит оксиду азота (N0^), который способен ингибировать синтез макромолекул хряща, увеличивать активность мат-риксных металлопротеиназ, повышать количество простагландинов и лейкотриенов, уменьшать выработку антивоспалительных цитокинов, способствовать апоптозу хондроцитов [11].
Интенсивность продукции N0^ оценивали по уровню его стабильных метаболитов N0^. Нами установлено, что в СЖ больных ГА наблюдается повышение уровня N0^ на 18, 29 и 133 % во 2^4-й группах (табл. 2) по сравнению с 1-й, что отражает продукцию оксида азота в синовии. Известно, что при
остеоартрозе хондроциты наряду с провоспалитель-ными медиаторами генерируют NO\ сверхпродукция которого осуществляется главным образом индуци-бельной NO-синтазой (NOS 2) [11]. Установлено, что в группе больных с консервативным лечением ГА содержание NOx- в плазме крови остается в пределах нормы. В группе пациентов, которым применяли эн-доартрохирургическое вмешательство различной степени тяжести, наблюдается прогрессивное повышение уровня NOx- в плазме крови, как и в СЖ. В плазме крови при артроскопии без повреждения костной основы концентрация NOx- возрастает на 32, при арт-роскопии с повреждением костной основы - на 85, при артротомии - на 162 % относительно контроля.
Сдвиг редокс-баланса и возрастание прооксидант-ного потенциала СЖ и плазмы крови больных ГА, особенно после применения эндоартрохирургических технологий, может быть связан, с одной стороны, с активацией прооксидантных ферментов, среди которых важнейшими являются МПО и НАДФН-оксидаза, а с другой стороны, - с нарушениями сопряженности функционирования компонентов антиоксидантной системы (табл. 3).
Исследование активности МПО, являющейся маркером воспалительной реакции, показывает, что при консервативном лечении ГА наблюдается её увеличение на 27 % в мононуклеарах периферической крови относительно контроля, в то время как применение эндоартрохирургических технологий не оказывает влияния на активность фермента. Это подчеркивает важную роль фермента, синтезирующего гипогалои-ды, в развитии хронической воспалительной реакции, которая имеет место в группе больных ГА, получавших консервативное лечение (табл. 3).
Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что в группе пациентов с консервативным лечением ГА не выявлено достоверных различий активности НАДФН-оксидазы в мононуклеарах крови (лимфоцитах, моноцитах) относительно контроля.
Таблица 3
Активность МПО и НАДФН-оксидазы в мононуклеарной фракции крови при гонартрозе, M±m, n=10-25
Показатель Группа обследованных
Доноры 1-я 2-я 3-я 4-я
МПО, у.е./мг-мин, р (А %) 3,03±0,24 3,86±0,25 < 0,05 (+27) 3,35±0,27 > 0,1 3,62±0,50 > 0,1 3,33±0,34 > 0,1
НАДФН-оксидаза, мМЕ/мин-г, р (А %) 87,73±4,79 109,29±11,37 > 0,1 122,84±14,06 < 0,05 (+40) 135,71±20,46 < 0,05 (+55) 143,11±26,89 < 0,01(+63)
В то же время при оперативном вмешательстве наблюдается её прогрессивное повышение, что согласуется с тяжестью хирургического вмешательства на коленном суставе. В ходе исследования установлено, что при артроскопии без повреждения костной основы происходит увеличение активности НАДФН-окси-дазы на 40, с повреждением - на 55, при артротомии -на 63 % относительно группы доноров.
Таким образом, проведенное исследование показывает, что при ГА развивается выраженный окислительный стресс, характеризующийся повышением продукции активированных кислородных метаболитов в крови и СЖ больных ГА на фоне активации прооксидантных ферментов. Выраженность окислительного стресса зависит от тяжести патологического процесса и травматичности применяемых эндоартро-хирургических технологий.
Литература
1. Мендель О.И., Наумов А.В., Алексеева Л.И., Верт-кин А.Л., Шамуилова М.М., Лучихина Л.В. Остеоартроз и сердечно-сосудистые заболевания. Общие факторы риска и клинико-патогенетические взаимосвязи. Оптимизация терапии // Профилактическая медицина. 2010. № 3. С. 35 - 41.
2. Насонов Е.Л. Новый взгляд на этиопатогенез остео-артроза // Consilium Medicum. 2007. Экстравыпуск. С. 3 - 7.
Поступила в редакцию_
3. Beyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. 1968. Vol. 21, suppl. 97. P. 77 -89.
4. Шестаков B.A., Байчевская H.O., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция плазмы крови в присутствии перекиси водорода // Bonp. мед. химии. 1979. № 2. С. 132 - 137.
5. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. М., 1977. С. 66 - 68.
6. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический метод определения миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках // Лаб. дело. 1991. № 3. С. 56 - 59.
7. Длужевская Т.С., Погорелова Т.Н., Афонин А.А. Активность НАДФН-оксидазы в оценке состояния новорожденных детей // Педиатрия. 1989. № 3. С. 44 - 47.
8. Голиков П.П., Николаева Н.Ю. Метод определения нитрита/нитрата (NOx") в сыворотке крови // Вопр. биомед. химии. 2004. № 1. С. 79 - 83.
9. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М., 2006. 556 с.
10. Кролевец И.В., Петручик А.С., Андреева И.И. Динамика параметров иммунной системы при различных технологиях оперативного лечения посттравматического гонар-троза // Цитокины и воспаление (Cytokines & Inflammation). 2008. Т. 7, № 3. С. 53 - 54.
11. Abramson S.B. Osteoarthritis and nitric oxide // Osteoarthritis & Cartilage. 2008. Vol. 16, suppl. 2. P. 15 - 20.
4 октября 2013 г.
