CC BY
49
9 blok 116_polosy coll.qxd 12.05.2009 18:54 Pag^" 17
Генетика в педиатрии
И.Ю. Смирнова
Сибирский государственный медицинский университет, Томск
Роль полиморфизма гена нейрональной NO-синтазы в формировании атопического дерматита у детей и чувствительности к терапии
Контактная информация:
Смирнова Ирина Юрьевна, аспирант кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета
Адрес: 634050, г. Томск, Московский тр., д. 2, тел.: (382 2) 51-36-96, e-mail: [email protected] Статья поступила: 10.11.2008 г., принята к печати: 09.03.2009 г.
Как известно, оксид азота участвует в формировании аллергического воспаления. Одним из ферментов, образующих NO, является нейрональная NO-синтаза (nNOS). Цель исследования — установить значение полиморфизма 276С-Т гена nNOS в формировании атопического дерматита у детей. В исследование включено 119 детей в возрасте от 1 до 18 лет, больных атопическим дерматитом. Выявлено, что полиморфизм 276С-Тгена nNOS ассоциирован с развитием атопического дерматита у детей, а также с лучшим ответом на проводимую базисную терапию. Не обнаружено связи полиморфизма 276С-Тгена nNOS с тяжестью болезни, уровнем IgE в сыворотке крови.
Ключевые слова: атопический дерматит, дети, базисная терапия, нейрональная NO-синтаза, полиморфизм гена.
Атопический дерматит (АтД) является одним из часто встречающихся аллергических (соматических) заболеваний у детей. Распространенность этого заболевания среди детей, по данным ISAAC (в Испании, Германии и странах Юго-Восточной Азии) составляет 5-15% [1]. Клинические проявления болезни, косметические дефекты, постоянный зуд кожи, необходимость соблюдения диеты негативно влияют на общее развитие ребенка, а также на качество его жизни [2]. В основе иммунологических нарушений при АтД лежит нарушение баланса Th 1 и Th 2 лимфоцитов. Поданным отдельных авторов (R.H. Chang и соавт., 1997; A. Fischer и соавт., 2003), NO может вносить значительный вклад в формирование аллергических болезней, что подтверждается высокой концентрацией нитритов (метаболитов NO), в сыворотке крови детей с АтД, по сравнению со здоровыми [3-7].
Точный механизм участия NO в развитии аллергического воспаления в коже не описан, однако, согласно исследованиям PJ. Barnes (1996) и L. Fabio и соавт. (2004), NO опосредует увеличение экспрессии интерлейкина 4 (IL 4). Другие авторы указывают, что NO может подавлять образование цитокинов (IL 2 и интерферон 7), характерных для Th 1 типа воспаления, и не влияет на активность мРНК IL 4 [8, 9].
NO синтезируется в результате окисления аминокислоты L-аргинина до L-цитруллина посредством фермента NO-син-тазы (NOS), который имеет три изоформы: индуцибель-ную — iNOS и две конститутивных: нейрональную — nNOS и эндотелиальную — eNOS [10]. Все конститутивные (nNOS, eNOS) NOS образуют NO в низких концентрациях (пикомолярных) через несколько секунд после стимуляции рецепторов одним из медиаторов (ацетилхолин, брадикинин, гистамин и др.). Таким образом осуществляются базальная
О
17
I.Yu. Smirnova
Siberian State Medical University, Tomsk
Role of neuronal NO-synthase gene polymorphism in formation of atopic dermatitis in children and in sensitivity to therapy
It's known, nitrogen oxide takes part in formation of the allergic inflammation. One of the enzymes, which produce NO, is the neuronal NO-synthase (nNOS). The research objective is to determine the value of nNOS 276С-Т gene polymorphism in formation of atopic dermatitis in children. The research incorporated 119 children aged from 1 to 18, suffering from atopic dermatitis. The author has identified that nNOS 276С-Т gene polymorphism is associated with the development of atopic dermatitis in children, as well as with the best response to the performed basic therapy. The research proved that there is no relation between nNOS 276С-Тgene polymorphism and illness severity, level of IgE in blood serum.
Key words: atopic dermatitis, children, basic therapy, neuronal NO-synthase, gene polymorphism.
Q.
I-
П
и
регуляция тонуса сосудов и нейротрансмиссия. Активация iNOS происходит на уровне транскрипции и обеспечивает в тысячу раз большую продукцию NO, в сравнении с конститутивными NOS. Высокие концентрации данного метаболита принимают участие в поддержании воспаления [11]. Согласно проведенным исследованиям, ген nNOS является «кандидатным» для формирования бронхиальной астмы (БА) [12]. Известно несколько полиморфных вариантов гена nNOS, но наиболее изученными в отношении БА, по данным зарубежной литературы, являются 276C-T и (AAT)n. Отмечено, что риск развития астмы и атопии выше у пациентов, имеющих эти варианты гена nNOS [13-16]. Данных о вкладе различных изоформ NOS в подверженность АтД нет. Известно, что источником nNOS в коже являются различные клетки-участники аллергического воспаления: кератиноци-ты, меланоциты, фибробласты, периферические нервные волокна, которые иннервируют сосуды кожи, а также эози-нофилы и тучные клетки [11, 17, 18]. Предположительно, nNOS может регулировать воспаление в коже, синтезируясь в провоспалительном клеточном паттерне.
Цель данного исследования — установить степень участия полиморфизма 276C-T гена nNOS в формировании АтД у детей.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Для достижения цели исследования спланировано одномоментное исследование в дизайне случай-контроль. Критериями включения в исследование были: наличие верифицированного диагноза АтД (продолжительность болезни на момент включения в исследование по данным формы 112 не менее 6 мес); возраст пациентов от 1 года до 18 лет; подписанное информированное согласие родителей или официальных опекунов. Наличие аллергического ринита, бронхиальной астмы или другой аллергической болезни было критерием исключения из исследования.
Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (протокол заседания № 669 от 19.11.2007).
В исследование включено 119 детей, больных АтД (56 девочек и 63 мальчика). Больные распределились по тяжести следующим образом: 52% (n = 62) страдали легким АтД, среднетяжелым и тяжелым — 28% (n = 34) и 19,5% (n = 23), соответственно. Группу контроля составили 96 условно здоровых детей (без аллергических болезней, гельминтозов и другой соматической патологии).
На каждого пациента заполнялась индивидуальная регистрационная карта, в которую были внесены данные анамнеза, клинического осмотра, эффективности лечения, результаты генотипирования. В рамках данного исследования протоколом было предусмотрено, что в случае отсутствия обострений болезни в течение последних 12 нед по данным амбулаторной карты (форма 112) на фоне применения терапии, соответствующей степени тяжести (согласно рекомендациям,
изложенным в программе «Атопический дерматит и инфекции кожи у детей: диагностика, лечение и профилактика», Москва, 2004 г.), ответ на лечение считался адекватным [2]. У всех пациентов проводилось взятие крови в количестве 5 мл для молекулярно-генетического исследования. Выделение геномной ДНК из венозной крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Исследование генотипа осуществлялось методом ПЦР, с использованием набора «Titan One Tube RT-PCR System» (Roche Diagnostics GmbH, Германия) согласно приложенной инструкции.
При проведении статистической обработки стратификацию данных выполняли таким образом, чтобы ответить на вопрос: связано ли наличие полиморфизма 276C-T гена NOS1 с развитием дерматита у детей? Кроме того, дополнительно были исследованы отношения шансов для таких параметров как пол, клинические симптомы АтД, эффективность лечения. Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета программ «Statistica for Windows 6.0». Для расчета отношения рисков и отношения шансов использовалась программный продукт «Statcalc».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе полиморфизма вариабельного участка С276Т гена NOS1 установлено, что риск развития АтД достоверно выше у детей, имеющих аллель Т.
Данные, представленные в табл. 1, демонстрируют, что вероятность формирования дерматита у детей, имеющих гомозиготу по СС значительно ниже, чем при другом генотипе. Одновременно с этим, при наличии гетерозиготы или гомозиготы ТТ этот риск выше в 2,06 и 1,79 раза соответственно. Приведенные данные свидетельствуют о возможном про-тективном эффекте гомозиготы СС участка 267 в экзоне 29 гена нейрональной NOS на формирование АтД. Исследование вероятности формирования АтД при ассоциации полиморфизма С276Т гена nNOS с полом (OR = 0,65; CI95% 0,28-1,50, р = 0,15), тяжестью заболевания (OR = 0,74; CI95% 0,32-1,72, р = 0,22), уровнем IgE в сыворотке крови (OR = 0,39; CI95% 0,10-1,48, р = 0,09), возрастом пациента при дебюте болезни (OR = 1,21; CI95% 0,50-2,93, р = 0,5) не продемонстрировало достоверных взаимосвязей.
При анализе терапии пациентов, включенных в исследование, установлено, что адекватную противовоспалительную терапию получали 92,8% детей (n = 104). Часть больных (n = 15) использовала только симптоматическую терапию, в связи с этим они были исключены из статистической обработки данных при расчете ассоциации полиморфизма 276C-T гена NOS1 с чувствительностью к терапии. Более половины пациентов 54% (n = 57) показали хороший ответ на терапию в соответствии с критерием эффективности лечения, принятым в рамках протокола исследования (отсутствие обострений на протяжении последних 12 нед адек-
18
Таблица 1. Распределение генотипов полиморфизма 276 С/Т гена nNOS у больных АД и в контрольной группе и риск формирования АД у носителей данных генотипов
Генотип Больные АтД Контроль RR CI95% р
n = 119 % n = 96 %
CC 59 49,53 91 94,97 0,68 0,53-0,88 0,003
CT 45 37,81 4 4,10 6,86 2,54-18,5 < 0,001
TT 15 12,66 1 1,04 10,86 1,63-49,9 0,006
Примечание:
СС — гомозигота по аллелю С; СТ — гетерозигота по аллелю С; ТТ — гомозигота по аллелю Т; RR — относительный риск; С195% — 95% — доверительный интервал; р — достигнутый уровень значимости.
Таблица 2. Наличие эффекта от лечения атопического дерматита при различных вариантах 276С-Т гена NOS1
Генотип Есть эффект Нет эффекта OR CI95% р
n = 57 % n = 47 %
CC 21 36,81 30 63,82 0,33 0,14-0,79 0,006
CT 25 43,85 14 29,78 1,84 0,76-4,52 0,14
TT 11 19,29 3 6,38 3,51 0,82-17,09 0,10
Примечание:
СС — гомозигота по аллелю С; СТ — гетерозигота по аллелю С; ТТ — гомозигота по аллелю Т; OR — отношение шансов; С195% — 95% — доверительный интервал; р — достигнутый уровень значимости.
ватного лечения). Количество детей, имеющих 1 и/или более обострений за последние 12 нед, составило 46% (п = 47). Достоверных различий по возрасту, «стажу» болезни у пациентов, для которых рассчитывалась ассоциация полиморфизма с эффективностью лечения, не было.
Согласно результатам, представленным в табл. 2, у пациентов-гомозигот по аллелю С, вероятность положительного эффекта на терапию достоверно ниже в сравнении с детьми, имеющими аллель Т. Наличие аллеля Т, в целом, ассоциировано с лучшим ответом на противовоспалительную терапию (013 = 2,6; С195% 1,34-5,06, р = 0,003). По некоторым данным полиморфизм 276С-Т гена пЫОБ увеличивает экспрессию пЫОБ, что может обусловливать увеличение синтеза N0 [15].
Известно, что использование топических глюкокортикостероидов (ТГКС) для лечения атопического дерматита приводит к снижению активности iN0S и не влияет при этом на активность конститутивных форм [19]. Высокие концентрации нитритов в сыворотке крови у больных АтД связаны с повышением активности именно индуцибельной N0S, что влечет за собой большинство эффектов, поддерживающих воспаление и требующих для этого больших концентраций
N0 [20]. Конститутивные формы N0S, в частности, нейрональная, вырабатывают N0 в различных клетках кожи в небольших количествах [21, 11]. ТГКС ингибируют эти эффекты N0 не напрямую, а опосредованно, через подавление воспаления и элиминацию аллергена [19]. Установлено, что малые количества N0, образуемые конститутивными N0S, поддерживают активированную пролиферацию кератино-цитов, вызывая гиперкератоз кожи при различных патологических состояниях в коже (таких как псориаз, бактериальное воспаление, заживление кожных ран) [4, 20, 22]. Вероятно, постоянное образование малых количеств N0 при дерматите у пациентов-носителей полиморфизма 276С-Т гена nN0S способствует хронизации воспаления, усилению процессов гиперкератоза и лихенификации. Применение базисной терапии ТГКС уменьшает выраженность аллергического воспаления, при этом активность nN0S снижается до физиологической.
Таким образом, наличие аллеля Т ассоциировано с риском формирования АтД у детей, кроме того, пациенты-носители данного аллеля демонстрируют хорошую чувствительность к проводимой терапии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мачарадзе Д.Ш., Шанидзе М.А., Джишкариани M.F! Распространенность аллергических заболеваний по данным литературы и ISAAC // Астма. — 2005. — Т. 6, № 1-2. — С. 7-9.
2. Атопический дерматит и инфекции кожи у детей: диагностика, лечение, профилактика. Научно-практическая программа. — М.: Союз педиатров России, 2004. — C. 52.
3. Taniuchi S., Kojima T., Hara Mt. et al. Increased serum nitrate levels in infants with atopic dermatitis // Allergy. — 2002. — V. 57, № 9. — Р 856-857.
4. Rowe A., Farrell A., Bunker C. Constitutive endothelial and inducible nitric oxide synthase in inflammatory dermatoses // Br. J. Dermatol. — 1997. — V. 136, № 1. — Р 18-23.
5. Guzik T.J., Adamek-Guzik T., Ccerniawska-Mysik G. et al. Nitric oxide metabolite levels in children and adult patients with atopic eczema / dermatitis syndrome // Allergy. — 2002. — V. 57. — FI 856-857.
6. Chang R., Feng M., Liu W. Nitric oxide increased interleukin 4 expression in T lymphocytes // Immunology. — 1997 — V. 90 — F. 364-369.
7. Fischer A., Folkerts G., Geppetti P. et al. Mediators of asthma: nitric oxide// Fulm. Pharmacol. Ther. — 2002. — V. 15. — F. 73-81.
8. Barnes FJ. NO or NO in asthma // Thorax. — 1996. — V. 51. — F 218-220.
9. Fabio L., Ricciardolo M., Peter J. et al. Nitric oxide in health and disease of the respiratory system // Physiol. Rev. — 2004. — V. 84. — Р. 731-765.
10. Michel Th., Feron O. Nitric Oxide Synthases: Which, Where, How, and Why? // J. Clin. Invest. — 1997. — V. 100. — F 2146-2152.
11. Cals-Grierson M., Ormerod A.D. Nitric oxide function in the skin // Nitric oxide. — 2004. — № 10. — F 179-193.
12. Фрейдин М.Б. Генетические основы подверженности к бронхиальной астме. — Томск, 2001. — 198 с.
13. Holla L., Buckova D., Vacha J. Neuronal nitric oxide synthase gene polymorphism and IgE-mediated allergy in the Central European population // Allergy. — 2004. — V. 59, № 5. — F 548-552.
14. Gao F, Kawada H., Kasamatsu T. et al. Variants of NOS1, NOS2, and NOS3 genes in asthmatics // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2000. — V. 27, № 3. — F 761-763.
15. Maruo. N., Kayashima O. Expression of neuronal nitric oxide synthase in dermal infiltrated eosinophils in eosinophilic pustular folliculitis // British Journal of Dermatology. — 1999. — V. 140, № 3. — R 417-420.
16. Martinez B., Barrios K., Vergara C. et al. NOS1 gene polymorphism associated with asthma and specific immunoglobulin E response to mite allergens in a Colombian population // Int. Arch. Allergy Immunol. — 2007. — V. 144, № 2. — F 105-113.
17. Ahluwalia A. Topical glucocorticoids and the skin-mechanisms of action: an update // Mediators of Inflammation. — 1998. — V. 7. — F. 183-193.
18. Shimizu Y., Sakai M., Umemura Y. et al. Immunohistochemical localization of nitric oxide synthase in normal human skin: expression of endothelial-type and inducible-type nitric oxide synthase in keratinocytes // J. Dermatol. — 1997. — V. 24, № 2. — F 80-87.
19. Grasemann H., Yandava C.N. et al. Neuronal NO synthase (NOS1) is a major candidate gene for asthma // Clin. Exp. Allergy. — 1999. — V. 29. — F. 39-41.
20. Frank S., Kampfer H., Wetzler Ch. Nitric oxide drives skin repair: Novel functions of an established mediator. // Kidney International. — 2002. — V. 61. — F 882-888.
21. Bruch-Gerharz D., Kolb-Bachofen V., Ruzicka T. Nitric oxide and its implications in skin homeostasis and disease — A review // Arch. Dermatol. Res. — 1998. — № 2. — F 643-651.
22. Neeta G., Vasudha B., Dakshayani F et al. A study of serum nitric oxide levels in psoriasis // Indian Journal of Dermatology, Venerology and Leprology. — 2005. — V. 71, № 3. — F 254-257.
19
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ/ 2009/ ТОМ 6/ № 2
