CC BY
47
Специальный выпуск: Материалы XIXмеждународного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке"
18-20 декабря 2017, г. Москва —--—
РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ КАК ОНКОМАРКЕРОВ В КРОВИ
Сунграпова К.Ю., Хиляль А., Сяткин С.П.
Российский университет дружбы народов, г., Москва, Российская Федерация
Аннотация. Содержание полиаминов в крови вызывает интерес не только у исследователей, но и у практикующих врачей. Уровни полиаминов в крови были исследованы как неспецифические маркеры рака. Однако также, как и большинство других предполагаемых биохимических маркеров, они не перешли в клиническую практику, поскольку не было простого, технически доступного, дешевого, эффективного метода определения этих соединений в крови. Большинство методов, используемых в настоящее время для анализа полиаминов, имеет разную чувствительность и точность, требует дорогостоящего и сложного оборудования.
Введение. Полиамины (путресцин, спермин и спермидин) - это полифункциональные низкомолекулярные азотсодержащие соединения, которые в низких концентрациях присутствуют в крови у здоровых людей. Функцию транспорта полиаминов в организме осуществляют эритроциты, в которых полиамины находятся в свободном состоянии и не комплексируются с высокомолекулярными веществами [7]. В 1980 году Swendseid M.E. и соавт. предположили, что эритроциты могут захватывать излишки полиаминов, образующихся в организме [5]. Они подтвердили это своими исследованиями, показав, что до 88% спермидина и 53% спермина циркулируют вместе с эритроцитами, которые служат переносчиками полиаминов из места их синтеза [5].
Сообщалось, что в плазме человека полиамины также могут образовать конъюгаты с пептидами [7, 8]. Полагают, что связывание полиаминов пептидами плазмы может быть важным физиологическим механизмом защиты организма от токсического действия высоких концентраций полиаминов [7, 8].
Концентрация полиаминов в цельной крови зависит от их содержания в форменных элементах, поскольку известно, что уровень полиаминов в плазме и сыворотке крови очень низкий [7, 8]. В сыворотке и плазме крови содержание путресцина и спермидина выше, чем спермина [7, 8]. В цельной крови преобладает спермидин [7, 8].
Согласно Ворончихину Л.Л. и соавт. (1986), в белых клетках крови наибольшее количество полиаминов приходится на долю спермина [8]. Это значит, что содержание полиаминов в цельной крови связано не только с ядерными клетками [8].
Известно, что развитие опухоли приводит, как правило, к накоплению полиаминов в организме. Поэтому концентрация полиаминов в крови изменяется при некоторых патологических процессах. Установлено, что эта концентрация увеличена на разных стадиях заболевания. В связи с этим концентрация полиаминов в крови, особенно в эритроцитах, считается показателем пролиферации клеток. Этот показатель имеет клиническое значение для наблюдения за лечением онкологических больных.
Опухолевые клетки, которые обычно проявляют высокую степень пролиферации, синтезируют повышенные уровни полиаминов [2]. Эти уровни в эритроцитах у онкологических больных хорошо коррелирует с уровнем заболевания, и, следовательно, определение содержания полиаминов в эритроцитах следует рассматривать в качестве онкомаркеров для оценки терапевтической эффективности.
Важным показателем изменения уровней спермина и спермидина в эритроцитах является отношение спермидин/спермин (Спд/Спм), которое может указывать на тип опухоли. Благодаря Russell D.H. (1983), известно, что спермин - это маркер дифференцировки, а спермидин - это маркер пролиферации [4].
Обзор некоторых методов определения содержания полиаминов в крови. Распределение количества полиаминов в крови и моче различается [3]. Путресцин и спермидин являются основными полиаминами в моче, а спермин присутствует в небольших количествах [3]. В моче эти полиамины находятся в ацетилированных формах, поэтому их перед анализом необходимо гидролизовать в свободную форму [3]. Кроме того, качество анализа напрямую зависит от количества мочи, т.е. тщательности и аккуратности ее сбора. Таким образом, метод не является простым и удовлетворительным как диагностический метод мониторинга наличия опухоли.
В отличие от содержания полиаминов в моче, большие количества спермидина и спермина и только следовые количества путресцина присутствуют в крови и, в основном, находятся в свободной форме, поэтому не нужно их гидролизовать перед анализом [3]. Таким образом, метод является простым в заборе и пробоподготовке.
В настоящее время известно большое число методов определения полиаминов и их производных в крови и моче: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) [9], жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) и электрофоретический метод. Одним из типичных методов является метод ВЭЖХ. Однако этот метод, как известно, считается сложным и трудоемким, несмотря на высокую воспроизводимость результатов, высокое разрешение и чувствительность [3, 6, 7]. Этот метод требует использования специального дорогостоящего оборудования, приборов и дорогих, особо химически чистых реактивов [3, 7].
Специальный выпуск: Материалы XIXмеждународного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке"
18-20 декабря 2017, г. Москва —--—
Прямое определение полиаминов в биологических жидкостях затруднено, поскольку они представляют собой небольшие алифатические молекулы без каких-либо структурных особенностей, которые позволили бы проводить их прецизионное определение, не прибегая к дериватизации [1]. Таким образом, большинство хроматографических методов использует дериватизацию полиаминов с помощью дансилхлорида с последующим флуоресцентным детектированием [1].
Véronique Ducros и соавт. (2009) считают, что метод ВЭЖХ проявляет не достаточную чувствительность, особенно для минорного полиамина, которым является путресцин, в эритроцитах [1]. Они разработали первый метод ЖХ-МС/МС для определения полиаминов в эритроцитах [1]. Чувствительность этого метода позволяет снизить объем выборки эритроцитов [1]. Специфичность анализа ЖХ-МС/МС позволяет идентифицировать и количественно определить путресцин в пятикратно уменьшенном объеме вводимой пробы, в отличие от метода ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием [1]. Но этот метод, как большинство хроматографических методов, имеет существенные недостатки: требует много времени проведения анализа и ограниченного хранения по времени образцов хроматограмм.
Isobe и соавт. (1987) разработали быстрый и надежный ферментативный анализ полиаминов в цельной крови на основе комбинации субстратной специфичности полиминоксидазы (ПАО) от Aspergillus terreus и путресциноксидазы (ПУО) от Micrococcus rubens [3]. Принцип этого метода заключается в двухстадийной ферментативной реакции [3]. Хиноновый краситель, полученный из H2O2, образующегося в реакции окисления, определяют спектрофотометрически [3]. Этот метод позволяет легко определить общие количества путресцина, кадаверина, спермидина и спермина в крови и, видимо, превосходит другие методы по простоте и быстроте анализа [3]. С помощью этого метода один исследователь может выполнить не менее 20 измерений в течение 1 часа [3].
Однако авторы патента США Tagaki K. и MiZunami-shi (2005) считают, что метод Isobe и соавт. является проблематичным из-за диагностической точности относительно некоторых типов заболеваний [5]. Они предложили метод определения полиаминов в эритроцитах с высокой точностью, в котором используется только полиаминоксидаза, имеющая субстратную специфичность к спермину и спермидину, или полиаминоксидаза, имеющая субстратную специфичность к спермину. Элюат из эритроцитов, отделенных и очищенных от крови, реагирует с этими ферментами, и образующаяся перекись водорода определяется с помощью высокочувствительного хромогена, такого, как хромоген на основе дифениламина [5]. Этот метод эффективен как диагностический метод [5]. Спермидин и спермин имеют большее значение в качестве индикаторных веществ по сравнению с другими полиаминами in vivo. Так, определение общего количества спермидина и спермина в эритроцитах эффективно в качестве онкомаркера также, как для оценки терапевтических эффектов при проведении хирургического лечения, введении противоопухолевых агентов (химиотерапии) и лучевой терапии.
Обсуждение. Концентрации спермина, спермидина и путресцина выражали в нмоль/1010 клеток, нмоль/мл, нмоль/мг белка [1, 2, 7, 8]. Данные по содержанию полиаминов в крови существенно отличаются у различных авторов, что, как видно, зависит от чувствительности методов их определения, от малого числа проведенных исследований и других причин [7, 8]. Однако следует отметить, что почти все авторы не обнаружили свободного путресцина в цельной крови здоровых людей, а некоторые авторы выявили его в очень низких количествах с помощью ЖХ-МС/МС и ферментативных методов. Paul Elworthy и Edward Hitchcock (1989) сообщили причину низкого количества путресцина. Они предположили, что путресцин переносится белками плазмы после связывания трансглутаминазой [2]. Низкая концентрация в крови делает его недоступным для количественного определения [2].
Существенных различий в концентрациях полиаминов в крови в зависимости от пола и возраста авторами не выявлено [1, 2, 3, 5, 7, 8]. У обоих полов были повышенные уровни спермидина. Диапазон концентраций спермина и спермидина был одинаковым как для мужчин, так и для женщин [2].
Заключение. Динамика изменений уровней полиаминов в крови в ходе исследования и лечения является актуальной для дальнейшей разработки эффективного метода определения полиаминов, который не только может определить количества полиаминов, но и прямо определить соединения полиаминов.
Определение статистически достоверных отличий в отношениях Спд/Спм для полиаминов в крови могло бы указывать на конкретный тип опухоли. До настоящего времени такого рода сопоставления изменений этого показателя с типом опухоли не проводились. Это требует дальнейшего изучения.
Специальный выпуск: Материалы XIXмеждународного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке"
18-20 декабря 2017, г. Москва —--—
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Ducros V., Ruffieux D., Belva-Besnet H., de Fraipont F., Berger F., Favier. A. Determination of dansylated polyamines in red blood cells by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Analytical Biochemistry 2009. July; 390(1). P. 46-51.
[2] Elworthy P., Hitchcock E. Polyamine levels in red blood cells from patient groups of different sex and age // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1989. Dec. 8; 993(2-3). P. 212-216.
[3] Isobe K., Yamada H., Soejima Y., Otsuji S. A rapid enzymatic assay for total blood polyamines // Clinical Biochemistry 1987. June; 20(3). P. 157-161.
[4] Russell D.H. Clinical relevance of polyamines // Crit. Rev. Clin. Lab. Scie. 1983. 18(3). P. 261-311.
[5] Swendseid M.E., Panaqua M., Kopple J.D. Polyamine concentrations in red cells and urine of patients with chronic renal failure // Life Sci. 1980. Feb. 18; 26(3). P. 533-539.
[6] Takagi K., Mizunami-shi. Patent US 20050277166A1.
[7] Николаев А., Плосконос М., Гончарова Л. Роль полиаминов в различных биологических объектах. LAP: 2012. С.96
[8] Ворончихина Л.Д., Демьянова В.Т., Ситников С.А. Содержание полиаминов в крови здоровых людей // Вопр. мед. хим. 1986. T. XXXII. № 2. C. 43-45.
[9] Сяткин С.П. Микрометод флуорометрического определения полиаминов и путресцина тканей животных тонкослойной хроматографией на пластинках Силуфола УВ-254 // Вопр. мед. химии. 1981. Т. 27, № 6. С. 848-851.
