CC BY
46
УДК 618.36-008.64+(611.814.1:616-008.62)]613.24
РОЛЬ ЭТ-кВ И ЦИТОКИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У ЖЕНЩИН С ОЖИРЕНИЕМ НА ФОНЕ ДИСФУНКЦИИ ГИПОТАЛАМУСА
И.В.Жуковец, С.С.Целуйко
Амурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95
РЕЗЮМЕ
Изучена роль транскрипционного ядерного фак-тора-карра B (NF-kB) и цитокинов в формировании плацентарной недостаточности у 64 беременных с ожирением на фоне дисфункции гипоталамуса (основная группа). Группу контроля составили 30 условно здоровых беременных. Уровень TNF-a, IL-1Р и IL-10 определяли в гомогенате плаценты (3840 недель). Во всех случаях проведено морфологическое исследование плаценты электронно-микроскопическими и общегистологическими методами. У беременных основной группы в сравнении с контролем выявлено увеличение TNF-a до 68,7±0,79 пг/мл (р=0,007) и IL-1P до 93,7±0,92 пг/мл (р=0,021) в гомогенате плаценты, снижение IL-10 до 19,7±1,02 пг/мл (р=0,000), на фоне повышения активности NF-kB в 1,2 раза (р=0,007), что сопровождалось нарушением созревания ворсинчатого хориона, инволютивно-дистрофическими изменениями структур хориона, микроциркулятор-ными нарушениями. Полученные результаты свидетельствуют, что развитие плацентарной недостаточности у женщин с ожирением на фоне дисфункции гипоталамуса ассоциированы с иммунными изменениями, обусловленными активацией NF-kB с последующим выбросом цитокинов, имеющих влияние на процессы ангиогенеза, коагуляции и апоптоза на уровне плаценты, с формированием первичной, а при срыве компенсаторных процессов - хронической плацентарной недостаточности.
Ключевые слова: дисфункция гипоталамуса, ожирение, NF-kB, цитокины.
SUMMARY
ROLE OF NF-kB AND CYTOKINES IN THE FORMATION OF PLACENTAL INSUFFICIENCY
IN OBESE WOMEN WITH HYPOTHALAMIC DYSFUNCTION
I.V.Zhukovets, S.S.Tseluyko
Amur State Medical Academy, 95 Gor 'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The role of nuclear factor kappa B (NF-kB) and cytokines in the formation of placental insufficiency in 64 pregnant women with obesity and hypothalamic dysfunction (the main group) was studied. 30 relatively healthy women made the control group. The level of TNF-a, IL-ip and IL-10 were defined in the ho-mogenate of placenta (38-40 weeks). In all cases the morphological study of placenta was done with elec-
tronic-microscopic and histological methods. The pregnant women of the main group in comparison with the control one were revealed to have the increase of TNF-a till 68.7±0.79 pg/mL (p=0.007) and of IL-ip till 93.7±0.92 pg/mL (p=0.021) in the homogenate of placenta, the reduction of IL-10 till 19.7±1.02 pg/ml (p=0.000), against 1.2 times increase in the activity of NF-kB factor (р=0.007), which was accompanied by a violation of maturation of chorionic villi, involutive and degenerative changes in the structure of the chorion, microcirculatory disturbances. The obtained results indicate that the development of placental insufficiency in obese women with hypothalamic dysfunction are associated with immune changes caused by the activation of NF-kB followed by the release of cytokines which influence the processes of angiogenesis, coagulation and apoptosis in placenta, with the formation of the primary and under the failure of compensatory processes chronic placental insufficiency.
Key words: hypothalamic dysfunction, obesity, NF-kB, cytokines.
По данным мета-анализа за 2014 год, более 1,4 млрд взрослых людей во всем мире имеют избыточный вес, 500 млн - ожирение, в России страдает ожирением 25% населения и 30% имеет избыточную массу тела [7]. Данная проблема сопряжена с дисфункцией гипоталамуса (ДГ) и нарушениями в центрах энергетического обмена [4, 9].
Женщины с ожирением на фоне ДГ составляют группу высокого акушерского и перинатального риска. Беременность при ожирении сопровождается многократным увеличением риска развития гестационного сахарного диабета, преэклампсии и плацентарной недостаточности (ПН) [4, 6].
Несмотря на освещенность проблемы, формирование ПН у беременных с ожирением на фоне ДГ остается недостаточно изученным, данные работы единичны и основаны лишь на морфологическом исследовании плаценты. Вместе с тем патогенетические механизмы, связанные с ожирением, могут иметь значение в формировании ПН.
Одним из ключевых факторов имеющим значение в развитии ожирения является транскрипционный ядерный фактор (NF-kB) [3]. NF-kB - белок, регулирующий транскрипцию генов, то есть активность синтеза новых белков в клетке, что является критической функцией в механизмах развития и функционирования [5]. NF-kB модулирует экспрессию более чем 150 генов, вовлеченных в процессы апоптоза, ангиогенеза, дифференцировки и пролиферации [5]. NF-kB стимулирует экспрессию провоспалительных цитокинов
(TNF-a, IL-6 и IL-1P) в адипоцитах и макрофагах, которые ингибируют передачу инсулинового сигнала, вызывают инсулинорезистентность и ожирение [3, 5].
Исследования данного транскрипционного фактора, применительно к клиническим заболеваниям, сравнительно новы и противоречивы [3]. Учитывая регулирующую роль NF-кВ, участвующего в транскрипции генов синтеза цитокинов и апоптоза, можно полагать, что изменение его активности приводит к существенным сдвигам метаболических процессов в плаценте и формированию ПН.
Цель исследования - оценить роль NF-kB и цито-кинов в формировании ПН у беременных с ожирением на фоне ДГ наряду с морфологическим исследованием плаценты.
Материалы и методы исследования
Проведен анализ течения беременности и исхода родов у 72 беременных женщин с ожирением на фоне ДГ - основная группа. Группу контроля составили 30 условно здоровых беременных. В основной группе беременных в 8 случаях произошел самопроизвольный аборт при сроке 7-8 недель. В связи с этим, анализ течения беременности во втором и третьем триместрах в основной группе изучали у 64 беременных. Обследование беременных женщин проводилось на базе Государственного автономного учреждения здравоохранения Амурской области «Амурская областная клиническая больница. Областной перинатальный центр» и Государственного автономного учреждения здравоохранения Амурской области «Городская клиническая больница. Городской родильный дом». Исследования проводили с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ №266 от 19.06.2003 г., от всех здоровых и больных лиц было получено информированное согласие.
Для приготовления гомогената плаценту забирали в течение 10-15 мин после родов. Её поверхность со стороны базальной пластинки отмывали большим количеством физиологического раствора. Плодовая часть плаценты срезалась скальпелем пластинками площадью 2-3 см и толщиной не более 1 мм. Кусочки ткани помещали в 200 мл физиологического раствора, отмывали от клеток крови, перемешивая в течение 15 мин на магнитной мешалке. Для получения экстрактов отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали, растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли физиологический раствор в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл физиологического раствора). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и центрифугировали при 4000 g при температуре +4°С.
Надосадочную жидкость разливали мелкими аликво-тами и хранили при -20°С до проведения иммунофер-ментного анализа (ИФА).
Уровень TNF-a, IL-1P и IL-10 в гомогенате плаценты (38-40 недель) определяли с помощью наборов «Интерлейкин 1-ИФА-БЕСТ», «альфа-ТОТ-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), «Интер-лейкин 10» (BenderMed Systems, США), активность NF-kB - с помощью наборов «Cayman» (США).
Для микроскопического исследования использовали парафиновые среды плаценты, фиксированные в 10% растворе нейтрального формалина с последующей окраской гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом по методу Мак-Мануса. Для получения полутонких и ультратонких срезов кусочки плаценты из нескольких зон фиксировали в 2,5% глютаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере по методике J.J.Coalson et al. (1986), с последующей дофиксацией в 1% растворе че-тырехокиси осмия. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB NOWA 8800 (Швеция). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим по методу M.Sato, E.Shamoto (1973). Электронно-микроскопическое исследование и фотографирование проводили на электронном микроскопе Technai G2 Spirit Twin (Голландия). Микроскопирова-ние и фотографирование препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином и ШИК-реактивом по методу Мак-Мануса, а также полутонких срезов, осуществляли на фотомикроскопе Microphot-FXA (NIKON, Япония). Обработку материала для растровой электронной микроскопии проводили по методу Ю.А.Ровенского (1979), просмотр препаратов осуществлялся на микроскопе S3400 (Япония).
Математическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы Microsoft Excel и пакета статистических программ Statistica 6.0. Для определения достоверности различий количественных показателей в группах использовался критерий Манна-Уитни и Стьюдента. Принимались во внимание уровни значимости (р) - 0,05; 0,01; 0,001. Исследование связи между количественными признаками осуществляли при помощи парного коэффициента линейной корреляции Спирмена (r): r=0,7-1 - сильная зависимость; r=0,69-0,3 - умеренная зависимость; r>0,29 - слабая зависимость. Точное вычисление значимости различных долей (процентов) проводилось по методу углового преобразования Фишера. Результат считался достоверным при р(ф)<0,05; <0,01; <0,001. Для проведения сравнительного анализа эффективности диагностических показателей использовался Receiver Operator Characteristic анализ. Судить о качестве теста можно по экспертной шкале для значений площади под кривой (AUC), где 0,9-1 - отличное, 0,8-0,9 - очень хорошее, 0,7-0,8 - хорошее, 0,6-0,7 - среднее, менее 0,6 - неудовлетворительное качество модели.
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что индекс массы тела в основной группе был 32,44±0,31 кг/м2, в контрольной - 21,8±0,28
кг/м2 (р=0,000).
Частота осложнений настоящей беременности в основной группе составила 212,5%, что было выше, чем в контрольной в 4,3 раза (50,0%). В первом триместре беременность осложнилась самопроизвольным абортом у 8 (11,1%), угрожающим абортом у 28,1% женщин. В контрольной группе угрожающий аборт был у 10% (рф=0,02), самопроизвольного аборта не зафиксировано. Анемия диагностирована у каждой четвертой беременной основной группы, что было достоверно выше, чем в контрольной (25 и 10%, соответственно, рф=0,03). Преэклампсия установлена у 35,9% беременных основной группы, что было достоверно выше, чем в контрольной (3,3%, рф=0,006), из них у 21 (91,3%) -средней тяжести, у 2 (8,7%) - тяжелая. Внутриутробная гипоксия плода и ПН выявлены у 40,6% беременных женщин основной группы, в контрольной - у 6,6% (рф=0,008). Предлежание плаценты в 3 триместре было у 14,1% беременных основной группы, в контрольной - у 3,3% (ир=1,83, рф=0,03). Нужно отметить, что во втором триместре предлежание хориона диагностировано у 23 (35,9%) беременных основной группы. Замедление роста плода выявлено у 6,3% беременных в основной группе, в контрольной - не установлено. Ге-стационный сахарный диабет диагностирован у 3,1% беременных основной группы.
Уровень цитокинов в гомогенате плаценты у родильниц основной (п=64) и контрольной (п=30) групп отражен в таблице.
Таблица
Уровень цитокинов и активность NF-kВ в гомогенате плаценты у родильниц в исследуемых
группах
Показатели, пг/мл Контрольная группа Основная группа р
TNF-a 65,74±0,74 68,7±0,79 0,007
IL-ip 90,76±0,81 93,7±0,92 0,021
IL-10 28,02±0,54 19,7±1,02 0,000
NF-kB 3,33±0,07 4,17±0,29 0,009
Согласно данным, представленным в таблице, у родильниц основной группы уровень Т№-а и ГЬ-1р в го-могенате плаценты был достоверно выше (р=0,007 и р=0,021), Ш-10 - достоверно ниже (р=0,000), чем в контрольной. При этом у ГЬ-10 была наибольшая степень достоверности. В основной группе отношение ТОТ-а/ГЬ-Ш в гомогенате плаценты составило 4,72±0,5, в контрольной в 2 раза ниже - 2,39±0,07 (р=0,000).
Обнаруженные количественные изменения в спектре цитокинов на локальном уровне свидетельствуют о их влиянии на течение и исход беременности. На сегодняшний день доказано, что ТОТ-а и ГЬ-1р активируют внутрисосудистую коагуляцию во вновь образовавшихся материнских сосудах под действием того же 1Ь-1р, как ангиогенного фактора [1, 2], что нарушает кровоток на уровне плаценты. Кроме того,
TNF-a вызывает апоптоз трофобласта [8]. IL-10 принадлежит главная роль в подавлении избыточной продукции провоспалительных цитокинов [1] - он обладает мощным противовоспалительным и иммуно-модулирующим действием, соответственно, на фоне снижения IL-10 уровень провоспалительных цитокинов будет расти. В исследованиях in vivo показано, что снижение продукции IL-10 может уменьшать эффективность фетопротективных механизмов, направленных на защиту плода от деструктивных факторов материнского организма и приводить к нарушениям процессов имплантации [2, 8].
Активность NF-kB в плаценте у родильниц основной (n=64) и контрольной (n=18) групп отражена в таблице. Согласно приведенным данным, активность NF-kB в плаценте у родильниц основной группы была выше в 1,2 раза, в сравнении с контрольной (р=0,009). При определении корреляции между NF-kB и цитоки-нами в аспирате из полости матки выявлена сильная корреляция во всех случаях - между NF-kB и TNF-a (r=0,76; p<0,001), NF-kB и IL-1P (r=0,77; p<0,001) и между NF-kB и IL-10 (r=0,79; p<0,001), что определяло компенсаторную воспалительную реакцию на уровне плаценты при доношенной беременности и являлось основным патогенетическим механизмом формирования ПН. Цитокины, регулируемые NF-kB, представляют собой систему, нарушения в которой могут привести к срыву саморегуляции, снижению иммуно-толерантности, нарушению процессов ангиогенеза и апоптоза, что приобретает особое значение в развитии и функционировании плаценты.
При проведении анализа эффективности показателя NF-kB в гомогенате хориона для данного заболевания, получили площадь под кривой AUC NF-kB = 0,82 (чувствительность - 86%, специфичность - 82%), что говорило об очень хорошей клинической значимости NF-kB в гомогенате плаценты (рис. 1).
1,2 j
п й /
U, о 0,6 0,4 0,2 —6—
■0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
специфичность
Рис. 1. ROC-кривая МБ-кВ в гомогенате плаценты.
Полученные данные позволяют заключить, что №-кВ принимает непосредственное участие в процессах имплантации, а его высокий уровень ассоциируется с угрожающим самопроизвольным абортом и формированием ПН.
При морфологическом исследовании зрелой пла-
центы от женщин с ожирением на фоне ДГ (п=64) выявлены нарушения архитектоники ворсинчатого дерева, которые выражались в неравномерном распределении и утолщении стволовых и промежуточных ворсин, умеренном уменьшении числа терминальных ворсин (рис. 2). Строма промежуточных и терминальных ворсин развита умеренно. В промежуточных ворсинах она более плотная, тогда как в терминальных - более рыхлая. На периферии имелись уплотненные участки соединительнотканных волокнистых структур, расположенные вокруг сосудов. Также встречались очаги фиброза и отека (рис. 2).
• - .• ». • V V —-
-'Яр с '»
"Ч . • Г
\ 1 .
• • & 4
б''' 5
* < С' У. '■' ; »>£«» "
Чч.
Рис. 2. Зрелая плацента женщины основной группы, беременность 38-39 недель. 1 - промежуточная ворсинка, 2 - терминальная ворсинка, 3 - синци-тиальные узелки, 4 - строма ворсинки, 5 -кровеносный сосуд, 6 - межворсинчатое пространство. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: 300.
В промежуточных ворсинах просвет артериальных сосудов сужен. В их стенке обнаруживалось значительное число гладких миоцитов, вены имели широкий просвет. Большое число сосудов было полнокровным (рис. 2) располагалось в периферической зоне ворсинок.
Синцитиотрофобласт однослойный. Его толщина в ядерной зоне увеличивалась до 9,2±0,03 усл. ед. (в контрольной группе - 5,6±0,05 усл. ед., р<0,05), а в безъядерной (синцитиокапиллярной) зоне - до 2,5±0,02 усл. ед. (в контрольной группе - 1,8±0,03 усл. ед., р<0,05). Ядра крупные. Хроматин представлен глыб-ками конденсированного гетерохроматина различного размера (рис. 2, 3). Ядра в синцитиотрофобласте расположены неравномерно. Часто встречались синци-тиоядерные узелки, образованные гиперхромными ядрами, что способствовало образованию межворсинчатых ядерных «мостиков», увеличивающих плотность межворсинчатого пространства.
В некоторых случаях встречались объединения терминальных ворсинок в единый конгломерат между собой и с промежуточной ворсинкой (рис. 3). В результате снижался доступ материнской крови к ворсинкам хориона. На нарушение обменных процессов в плаценте также указывало повышенное количество ШИК-позитивных гранул в стенке кровеносных сосудов, в базальной мембране и по ходу волокон в соединительной ткани (рис. 3).
Рис. 3. Зрелая плацента женщины основной группы, беременность 38-39 недель. 1 - синцитиотро-фобласт, 2 - строма ворсинки, 3 - ШИК - позитивные гранулы, 4 - кровеносный капилляр, 5 - межворсинчатое пространство. Окраска: ШИК-реакция по Мак-Ма-нусу. Увеличение: 600.
Рис. 4. Зрелая плацента женщины основной группы, беременность 38-39 недель. 1 - ядро синци-тиотрофобласта, 2 - микроворсинки, 3 - вакуоли, 4 -межворсинчатое пространство, 5 - кровеносный сосуд, 6 - базальная мембрана. Электронная микроскопия. Увеличение: 13500.
При электронно-микроскопическом исследовании были отмечены изменения в ультраструктуре синци-тиотрофобласта и базальной пластины. Обнаруживалась умеренная вакуолизация цитозоля синцитиотрофобласта. Ядра обычной овальной формы, имели неровные контуры. Гетерохроматин был расположен в виде глыбок по периферии ядра. В базальной части обнаруживались интердигитации. Базальная мембрана неравномерная по толщине, прерывистая, с очаговым накоплением основного вещества (рис. 4).
Следовательно, структурные особенности плацент у женщин с ожирением на фоне ДГ имеют остаточные проявления компенсированной первичной ПН, которая в дальнейшем при срыве механизмов компенсации приводит к развитию хронического процесса.
Заключение
Развитию ПН у женщин с ожирением на фоне ДГ приводят иммунные изменения - активация №-кВ с
последующим выбросом цитокинов, имеющих влияние на процессы ангиогенеза, коагуляции и апоптоза на уровне хориона и плаценты, с формированием первичной, а при срыве компенсаторных процессов - хронической ПН. Структурные нарушения плаценты, вызванные прогрессированием ПН, связаны с нарушением созревания ворсинчатого хориона (наличие ворсин разных размеров, различной степени зрелости и васкуляризации), инволютивно-дистрофическими изменениями структур хориона (увеличение количества фибриноида, фиброз стромы ворсин, сужение межворсинчатого пространства, деструкция и вакуолизация микроворсинок и органелл трофобласта ворсин), мик-роциркуляторными нарушениями (снижение показателя васкуляризации ворсин).
ЛИТЕРАТУРА
1. Андриевская И.А. Механизмы и закономерности развития нарушений морфофункционального состояния плаценты и кислородтранспортной функции периферической крови рожениц и крови пуповины при обострении герпес-вирусной инфекции: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Иркутск, 2011. 50 с.
2. Бурменская О.В. Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 2014. 34 с.
3. Гунько В.О., Погорелова Т.В., Линде В.А. Участие фактора №-хВ и его регуляторных белков в развитии осложнений беременности // Проблемы репродукции. 2013. Т.19, №2. С.88-91.
4. Жуковец И.В., Целуйко С.С. Особенности формирования хориона у женщин с дисфункцией гипоталамуса // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2013. Вып.47. С.91-97.
5. Кайдашев И.П. Активация ядерного фактора кВ как молекулярной основы патогенеза метаболического синдрома // Пат. физиол. и эксперим. терапия. 2013. №3. С. 65-72.
6. Макаров И.О., Боровкова Е.И., Казаков Р. Д. Характер метаболических изменений у беременных с ожирением // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2013. №3. С.38-41.
7. Подзолкова Н.М., Колода Ю.А., Подзолков А.В. Терапия бесплодия у пациенток с ожирением: современный взгляд на проблему // Проблемы репродукции. 2012. Т.18, №3. С.37-40.
8. Haider S., Knofler M. Human Tumour Necrosis Factor: physiological and pathological roles in placenta and endometrium // Placenta. 2009. Vol.30. №2. Р.Ш-Ш.
9. Brain Innate Immunity Regulates Hypothalamic Arcuate Neuronal Activity and Feeding Behavior / W.L.Reis [et al.] // Endocrinology. 2015. Vol.156, №4. Р.1303-1315.
REFERENCES
1. Andrievskaya I.A. Mechanisms and patterns of violations of morphofunctional state of the placenta and the oxygen-function peripheral blood of pregnant women and umbilical cord blood during acute herpes virus infection: abstract of thesis...PhD of biological sciences. Irkutsk; 2011 (in russian).
2. Burmenskaya O.V Molecular genetic markers of the immune response in inflammatory diseases of the female reproductive system: abstract of thesis.. .PhD of biological sciences. Moscow; 2014 (in russian).
3. Gun'ko VO., Pogorelov T.V., Linde V.A. Problemy reproduktsii 2013; 19(2):88-91.
4. Zhukovets I.V, Tseluyko S.S. Chorion formation peculiarities in women with hypothalamus dysfunction. Bul-leten' fiziologii i patologii dyhaniya - Bulletin physiology andpathology of respiration 2013; 47: 91-97 (in russian).
5. Kaidashev I.P. Patologicheskaya fiziologiya i eksper-imentalnaya terapiya 2013; 3:65-72.
6. Makarov I.O., Borovkov E.I., Kazakov R.D. Rossiyskiy vestnik akushera -ginekologa 2013; 3:38-41.
7. Podzolkova N.M., Koloda Yu.A., Podzolkov A.V Problemy reproduktsii 2012; 18(3):37-40.
8. Haider S., Knofler M. Human Tumour Necrosis Factor: physiological and pathological roles in placenta and endometrium. Placenta 2009; 30(2):111-123.
9. Reis W.L., Yi C.X., Gao Y., Tschop M.H., Stern J.E. Brain Innate Immunity Regulates Hypothalamic Arcuate Neuronal Activity and Feeding Behavior. Endocrinology 2015; 156(4):18-49. 1303-1315.
Поступила 07.04.2015
Контактная информация Ирина Валентиновна Жуковец, кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии, Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95.
E-mail: [email protected] Correspondence should be addressed to Irina V. Zhukovets,
MD, PhD, Associate Professor of Department of Obstetrics and Gynecology,
Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: [email protected]
