CC BY
75
УДК 616-092.18:616.127-089
РОЛЬ НЕЙРОПЕПТИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТУЧНЫХ КЛЕТОК ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ МИОКАРДА
Е.С. ГОЛОВНЕВА, Г.К. ПОПОВ, Д.Л. СИНЦОВ*
Любое повреждающее воздействие на ткань, в том числе и лазерное хирургическое вмешательство, приводит к развитию местного воспаления в зоне повреждения, в процессе которого происходит целый ряд репаративных структурных и функциональных изменений. Пусковым моментом таких изменений выступает воздействие нейропептидов (кортикотропин-релизинг фактор (КРФ) и субстанция Р), высвобождаемых из нервных окончаний. Эти медиаторы вызывают активацию тучных клеток, которые являются источником цитокинов, медиаторов и факторов роста, влияющих на процессы воспаления и регенерации. Рецепторы кортикотропин-релизинг фактора, обнаруженные на поверхности кардиомиоцитов, гладко-мышечных клетках и в эндотелии сосудистой стенки предопределяют восприимчивость данных типов клеток к действию КРФ, вырабатывающегося непосредственно в сердце клетками иммунной системы (лимфоцитами, макрофагами), эндотелием, тучными клетками, а также выделяемого симпатическими нервными волокнами [2-3, 6, 8]. Субстанция Р, экспрессия которой в сердце связана с чувствительными нервными волокнами, также участвует в развитии воспалительного процесса в окружающих тканях [2, 7, 9].
Одним из эффектов субстанции Р и кортикотропин-релизинг фактора является воздействие на тучные клетки, приводящее к их дегрануляцию. При этом, биологически активные вещества, содержащиеся в гранулах мастоцитов, попадают в окружающие ткани, оказывая влияние как на сосудистый тонус (гистамин), так и на состояние миокарда в целом (факторы роста, интерлейкины). Патогенетическая роль субстанции Р, кортико-тропин-релизинг фактора и тучных клеток в воспалительных и аллергических процессах, в прогрессировании атеросклероза широко обсуждается многими исследователями в последние годы [1, 4-5, 7]. Динамика экспрессии нейропептидов, их воздействие на тучные клетки, влияние на выраженность ишемических изменений тканей и сосудистую реакцию при лазерном хирургическом повреждении миокарда до сих пор не были изучены.
Цель исследования - сравнительное изучение динамики экспрессии субстанции Р, КРФ, морфо-функциональных особенностей тучных клеток при воздействии лазерного излучения и механическом повреждении сердца.
Материал и методы. Проведение эксперимента осуществлялось на 132 беспородных крысах. Изучались 4 экспериментальные группы: однократное высокоинтенсивное лазерное воздействие (инфракрасный диодный лазер) на стенку левого желудочка нормального и ишемизированного миокарда с формированием канала; механическое формирование канала с использованием стерильной иглы в нормальном и ишемизированном миокарде. Ишемические изменения миокарда моделировали созданием у животных хронического гиподинамического стресса путем иммобилизации в узких пластиковых лотках.
Выведение из эксперимента проводилось через 1 минуту, 1 час, 1 и 5 суток. Кусочки ткани миокарда фиксировали нейтральным формалином и после стандартной гистологической обработки получали парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином-эозином для уточнения локализации повреждения ткани миокарда и толуидиновым синим (рН 2,0) для выявления тучных клеток. Ишемические изменения кардиомиоцитов выявляли окраской ГОФПК (гематоксилин-основной фуксин-пикриновая кислота). Уровень экспрессии кортикотропин-релизинг фактора и субстанции Р определялся на замороженных криостатных срезах миокарда иммуно-гистохимическим методом с применением специфических антител (,S'7GMA) и системы иммуномечения ШМиМЛЯК (1СЫ). В качестве ферментной метки использовали щелочную фосфатазу, которую затем выявляли окраской по Бернстон. Морфометрические исследования проводились с использованием компьютерной системы анализа видеоизображения «Диаморф-цито». Статистическая обработка цифровых данных проводилась методом непараметрической статистики с использо-
* ОГУЗ ЦОСМП «Челябинский государственный институт лазерной хирургии»,г. Челябинск. 454021. Пр. Победы 287, т. 8(351)7412368
ванием критерия Ньюмена-Кейлса и ранговой корреляции по Спирмену с помощью программ Microsoft Excel 2000, «Диаморф Ипсо®». Различия считали достоверными при р<0,05.
Результаты. Экспрессия кортикотропин-релизинг фактора в интактном миокарде была выражена в адвентиции артериальных сосудов и в ткани миокарда, окружающей артерии крупного и среднего калибра. Также значительная экспрессия КРФ была отмечена в эпикардиальных областях. Базальный уровень экспрессии КРФ составлял 22,99±1,02 у.е. После лазерного повреждения и после механического воздействия отмечалось плавное нарастание экспрессии КРФ к 5 суткам опыта до 34,34±1,02 у.е. после лазерного и до 21,59±1,00 у.е. после механического повреждения интактного миокарда. Экспрессия субстанции P в исследованных препаратах сердца выявлялась в адвентициальной оболочке коронарных артерий и крупных венозных сосудов и, в первые минуты эксперимента, в стенках сформированного лазером канала. В зоне механического повреждения миокарда не было выявлено значительного усиления экспрессии субстанции P. На ранних сроках (минуты, 1 час) субстанция P экспрессировалась максимально (22,94±1,40 у.е. после механического и 18,85±1,08 у.е. после лазерного повреждения миокарда), к 5 суткам уровень этого нейропептида в тканях снижался (7,47±0,55 у.е. после механического и 8,29±0,65 у.е. после лазерного повреждения миокарда) до базальных уровней.
Индекс дегрануляции тучных клеток (ИДТК), представляющий собой соотношение числа дегранулированных тучных клеток к общему числу тучных клеток, резко нарастал сразу же после повреждения и был максимален в первые минуты после воздействия, снижаясь к 5 суткам. При лазерном воздействии на сердце индекс дегрануляции тучных клеток был выше, чем при механическом воздействии на сроках 1 минута (в нормальном миокарде), 1 сутки (в ишемизированном миокарде) (табл. 1-2).
Таблица І
Динамика индекса дегрануляции тучных клеток после воздействия на нормальный миокард
Лазерное воздействие Механическое воздействие
нормальный миокард 31,62±0,93 31,62±0,93
1 минута 76,60±2,10*а 58,06±2,05*
1 час 72,06±3,35* 68,57±3,30*
1 сутки 68,56±1,90* 60,56±4,00*
5 суток 55,04±1,65* 48,12±1,30*
* достоверное различие показателей до и после повреждающего воздействия (р<0,05); а достоверное различие между показателями групп животных с лазерным и механическим воздействием (р<0,05)
Таблица 2
Динамика индекса дегрануляции тучных клеток после повреждения ишемизированного миокарда
Лазерное воздействие Механическое воздействие
Ишемизированный миокард 29,22±0,95 29,22±0,95
1 минута 67,83±1,33* 71,33±3,10*
1 час 70,31±2,75* 57,86±3,20*
1 сутки 59,83±3,41*а 38,07±3,49
5 суток 44,16±1,39* 40,49±2,08
* достоверное различие показателей до и после повреждающего воздействия (р<0,05); а достоверное различие между показателями групп животных с лазерным и механическим воздействием (р<0,05)
Изучение динамики площади ишемических изменений миокарда по данным окраски ГОФПК (выраженная фуксинофи-лия кардиомиоцитов) выявило отсутствие достоверной разницы по этому показателю между группами животных с механическим и лазерным повреждением миокарда. Обнаруживались отличия сосудистой реакции в зонах повреждения на 5 сутки эксперимента. В группе с лазерным воздействием диаметр внутреннего просвета капилляров, артерий и вен был больше, а толщина стенки сосудов несколько меньше, чем у животных с механическим повреждением сердца, при этом удельная площадь крове-
носных сосудов в группе с лазерным воздействием была достоверно больше, чем в группе с механическим повреждением, что говорит о более выраженном процессе неоангиогенеза. Корреляционный анализ динамики индекса дегрануляции тучных клеток в миокарде после лазерного и механического повреждения и динамики экспрессии субстанции Р и кортикотропин-релизинг фактора показал, что есть прямая корреляционная зависимость сильной степени между ИДТК и экспрессией субстанции Р и обратная корреляционная - между ИДТК и экспрессией КРФ.
Заключение. Данные проведенных экспериментов подтверждают роль субстанции Р как сильнейшего дегранулятора тучных клеток после хирургического повреждения миокарда, вне зависимости от вида воздействия (лазерное или механическое). Можно предполагать, что усиление экспрессии субстанции Р в первые минуты после локального повреждения миокарда является одним из факторов, привлекающих тучные клетки в зону развивающегося воспаления. Эти данные свидетельствуют о необходимости интенсивной профилактики ишемии миокарда у больных в первые сутки после операции трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации, когда под действием медиаторов, выделяемых тучными клетками возможны неблагоприятные сосудистые реакции в виде спазма, либо отека сосудистой стенки. По нашим данным, КРФ не оказывал такого выраженного влияния на дегрануляцию тучных клеток как субстанция Р, более того, усиление экспрессии этого нейропептида сопровождалось некоторым снижением индекса дегрануляции мастоцитов. Повышение уровня кортикотропин-релизинг фактора при лазерном воздействии не только не оказывает негативного влияния, но и может способствовать процессу восстановления миокарда и неоангиогенеза, о чем говорит динамика сосудистой реакции и ишемических изменений. Кортикотропин-релизинг фактор может быть одним из регуляторов протективных и репаративных процессов в сердце. Это подтверждается рядом исследований роли КРФ и родственных пептидов при ишемии миокарда [10-11].
Литература
1. Azzolina A. // Biochim. Biophys. Acta.- 2003.- Vol. 1643(1-3).- P.75-83.
2. Blennerhassett M.G. // John Wiley & Sons, Inc. J. Neuro-biol.- 1998.- Vol.35.- P.173-182.
3. Cao J. // J. Immunol.- 2005.- Vol.174(12).- P.7665-7675.
4. Esposito P. // Brain Res.- 2003.- Vol.968(2).- P.192-198.
5. LaineP. // Circulation.- 1999.- Vol.99.- P.361-369.
6. Lytinas M. // Int. Arch. Allergy Immunol.- 2003.-Vol. 130(3).- P.224-231.
7. Matsumoto I. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.- 2004.- Vol.287(4).- P.969-980.
8. PangX. // JPET.- 1998.- Vol.287.- P.307-314.
9. Rozniecki J.J. // Brain Res.- 1999.- Vol.849(1-2).- P.1-15.
10. Terui K. // Journal of Endocrinol.- 2001.- Vol.169.- P.177.
11. WeisingerR.S. // Endocrinology.- 2004.- Vol.145.- P.5598.
THE ROLE OF THE NEUROPEPTIDES IN REGULATION OF MORPHO-
FUNCTIONAL STATE OF MAST CELLS AFTER SURGICAL DAMAGE OF MYOCARDIUM
E.S. GOLOVNEVA, G.K. POPOV, D.L. SINTSOV Summary
Mast cells, expression of substance P and corticotrophin-releasing factor were investigated after laser and the mechanical damage of myocardium. Increase of substance P expression was registered at 1-2 minutes after operation that coincided with maximum of mast cell degranulation. Maximum of corticotrophin-releasing factor expression fell on 5 day after damage, i.e. the period of reparative process development. The authors suppose that substance P has the function of alteration mediator, and CRF plays the protective role after laser injury of myocardium.
Key words: neuropeptides, myocardium
УДК 615.015+616-001.8
АНТИГИПОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПРОИЗВОДНОГО АМИНОТИО-ЛОВ - БИС (N-АЦЕТИЛІ-ЦИСТЕИНАТО )АКВОЦИНК(П) ДИСЕМИ-ГИДРАТА - У КОШЕК В УСЛОВИЯХ НОВОЙ МОДЕЛИ ОСТРОЙ ГИПОКСИИ В НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ
А. В. ЕВСЕЕВ, М. А. ЕВСЕЕВА, В. А. ПРАВДИВЦЕВ*
Введение. В условиях эксплуатации летательных аппаратов, подводных лодок всегда присутствует некоторая вероятность отказа систем, обеспечивающих регенерацию газовых смесей обитаемых замкнутых пространств. Ухудшение качественных характеристик газовых смесей инициирует развитие экзогенной формы острой гипоксии с гиперкапнией (ОГсГк) у членов экипажа, чтонарушает их общее состояние и работоспособность [1], в первую очередь, из-за нарушений функций ЦНС [2, 15].
Успехи современной химии и фармакологии позволили осуществить синтез и внедрить в практику т. н. антигипоксанты -лекарственные вещества нового класса [4]. Применение антиги-поксантов оказалось действенным при многих видах хронических форм кислородной недостаточности [4, 7, 11]. Однако большинство используемых в настоящее время антигипоксантов, не обладают необходимой эффективностью в качестве средств экстренной помощи, преимущественно из-за медленной скорости развития терапевтического действия. Обнадеживающие перспективы открылись в связи с разработкой очередного поколения антиоксидантов - физиологически совместимых антиоксидантов (ФСАО). ФСАО по большей части, представляют собой комплексные соединения переходных металлов с биоантиоксидантами [9].
В опытах на мышах в условиях ОГсГк было показано, что производные ^ацетил^-цистеина и цинка (II) - вещества П)-901, п)-1104, относящиеся к категории ФСАО, имеют отчетливый и быстроразвивающийся ангипоксический эффект [6].
Цель исследования - изучение влияния антигипоксанта бис(^ацетил^-цистеинато)аквоцинк(П)дисемигидрата (вещества п)-901) на биоэлектрическую активность высших отделов ЦНС при развитии ОГсГк в остром эксперименте.
Материалы и методы исследования. Опыты проводили на кошках массой 3,5-4,0 кг. В ходе подготовительного этапа в условиях этаминал-натриевого наркоза (30-35 мг/кг) животным рассекали мягкие ткани, в черепе делали трепанационные отверстия. Края ран инфильтрировали 0,5% раствором новокаина. Затем животных интубировали, обездвиживали миорелаксантами и переводили на управляемое дыхание [12]. В опытах в зоне проекции контралатерального лучевого нерва регистрировали фокальные вызванные потенциалы (ВП) [5] и импульсную активность нейронов соматосенсорной коры больших полушарий [12]. Параметры стимуляции нерва - одиночные прямоугольные толчки тока 5-7 В, 0,2 мс импульсного генератора ЭСУ-1. Усредненные ВП и перистимульные гистограммы нейронов оценивали в режиме on line с помощью лабораторной ЭВМ. Общее состояние кошек контролировали посредством непрерывной регистрации электроэнцефалограммы (ЭЭГ).
Статус ОГсГк моделировали по методике, специально разработанной для решения поставленной задачи [10]. Сущность метода - создаётся замкнутый контур, включающий в себя дыхательную ёмкость объёмом 6 л и обеспечивающий поступление в лёгкие животного воздуха, качество которого непрерывно ухудшается за счёт возврата в ёмкость воздуха, выдыхаемого животным. Качественный состав вдыхаемых кошками газовых смесей определяли электронными анализаторами АНКАТ-7631М (О2) и ГИАМ-301 (СО2) производства «Аналитприбор» (Смоленск). Вещество п)-901 в дозе 50 мг/кг кошкам опытной группы (ОГ -25) вводили внутрибрюшинно в 3 мл раствора натрия хлорида (0,9%). Кошкам контрольной группы (КГ - 19) вводили тот же объём раствора натрия хлорида (0,9%). Инъекции выполняли за 90 мин до сеансов моделирования статуса ОГсГк. Результаты обрабатывали статистически на ПК с использованием t-критерия Стьюдента и стандартных программ Statistica for Windows.
Результаты. На рис. 1А представлен исходный ВП на одиночное раздражение лучевого нерва. Видно (рис. 1Б-1, 2, 3, 4), что по мере перехода животного из исходного состояния в со-
* 14019, г. Смоленск, ул. Крупской 28, Смоленская государственная медицинская академия, кафедра нормальной физиологии
