CC BY
50
УДК 636.1:612.126
РОЛЬ МИКРОФИЛАМЕНТОВ И ПРОТЕИНКИНАЗЫ А В СТИМУЛИРОВАНИИ КАПАЦИТАЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ
В. Ю. ДЕНИСЕНКО, Е. Н. БОЙЦЕВА, Т. И. КУЗЬМИНА
ФГБНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, г. Пушкин, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 196600
(Поступила в редакцию 29.01.2015)
Введение. Капацитация представляет собой сложный комплекс биохимических изменений, ведущий к приобретению сперматозоидом способности к оплодотворению. На сегодняшний день разными группами ученых проведено множество исследований, касающихся этого процесса, однако точный механизм капацитации до сих пор до конца не ясен. Детальное изучение механизма постэякуляционного созревания сперматозоидов будет способствовать интенсификации методов искусственного осеменения и криоконсервации мужских гамет, а также в перспективе и решению проблем мужского бесплодия.
Анализ источников. В процессе капацитации в сперматозоидах происходят физиологические, биохимические и биофизические изменения, такие как изменение текучести мембран [1], гиперполяризации мембран [2], внутриклеточного рН [3] и концентрации циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) [4]. Было показано, что капацитация зависит от количества внеклеточного кальция и связана с подъемом уровня внутриклеточного Са2+ [5]. Гепарин-индуцированная капацита-ция сперматозоидов быков также связана с увеличением концентрации внутриклеточного цАМФ [6], а соединения, способные повысить концентрацию цАМФ внутри клетки, например, биологически активный аналог цАМФ дибутирил-цАМФ (дбцАМФ) и ингибитор фосфодиэс-теразы 3-изобутил-1-метилксантин (1ВМХ), стимулируют капацита-цию в сперматозоидах быков [7]. Висконти и соавторами в 1999 году продемонстрировали, что изменения в плазматической мембране спе-рмия, такие как снижение количества холестерола, стимулируют пути сигнальной трансдукции, детерминирующих капацитацию [7]. Предполагается, что удаление холестерина с поверхности мембраны способствует увеличению проницаемости ее для ионов Са2+ и НС03-, которые поступают в цитоплазму и стимулируют аденилатциклазу,
вследствие чего образуется цАМФ. Повышение концентрации цАМФ внутри клетки приводит к стимуляции протеинкиназы А (ПКА), и в конечном счете к фосфорилированию определенных белков по тирозину [9], что является непременным атрибутом капацитации [7]. Показано, что увеличение концентрации внутриклеточного цАМФ зависит от присутствия внеклеточного Ca2+ [4], но дбцАМФ совместно с IBMX может заменить внеклеточный Ca2+ в поддержке фосфорилирования тирозина и капацитации в сперматозоидах грызунов [10].
Цель работы - выяснить, какое значение для капацитации имеет система микрофиламентов сперматозоида, а также протеинкиназа А, и установить наиболее эффективно действующие концентрации индукторов капацитации in vitro (теофиллина и дбцАМФ).
Материал и методика исследований. В экспериментах использовался эякулят, получаемый у быков непосредственно перед началом работы. Все использованные реактивы являются продуктами фирмы «Sigma». Манипуляции проводились с использованием термостолика во избежание холодового шока спермиев. Для отмывания и капацитации сперматозоидов быков применялась среда TALP, состоящая из: 100 мМ NaCl, 3.1 мМ KCl, 25 мМ NaHCO3, 0.3 мМ NaH2PO4, 21.6 мМ Lactate (sodium salt), 2 мМ CaCl2, 0.4 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия. Для отмывки спермиев от семенной плазмы использовали данную среду с добавлением поливинилалкоголя (молекулярной массой 30000-70000 Да) в концентрации 1 мг/мл. В такой среде сперму два раза центрифугировали при 300 g в течение 10 мин. При проведении капацитации к среде TALP вместо поливинилалкоголя добавляли бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 6 мг/мл. Капацитацию клеток проводили в течение 4 часов при 38.5 0С, 95 % влажности и 5 % СО2.
Заранее на основе среды Sp-TALP для капацитации готовили концентрированные растворы: теофиллина в концентрации 1 мМ, 2 мМ и 5 мМ, дбцАМФ в концентрации 10 мМ, глюкозы в концентрации 50 мМ. Конечная концентрация этих реагентов составляла: теофиллин -100 мкМ, 200 мкМ и 500 мкМ, дбцАМФ в концентрации 1 мМ, глюкозу в концентрации 5 мМ. Ингибиторы также готовили в 10-кратной концентрации (цитохалазин Д и Н-89 в концентрации 100 мкМ) и добавляли их к соответствующим опытным образцам перед началом четырехчасового инкубирования. Поступление реагентов внутрь сперматозоидов обеспечивал хлортетрациклин (ХТЦ), который способен образовывать поры на поверхности клеток, не нанося им критического вреда [11].
130
Для работы на микроскопе Zeiss AXIO imager A1 готовили препараты, окрашенные раствором хлортетрациклина (ХТЦ) в концентрации 750 мкМ.
Раствор ХТЦ приготовляли в буфере, который содержит 130 мМ NaCl, 5 мМ L-цистеина, 20 мМ Трис (рН=7,8). Раствор ХТЦ готовили непосредственно перед экспериментом и хранили в темноте, при 4° С. 20 мкл суспензии сперматозоидов и 20 мкл раствора ХТЦ смешивали и инкубировали при 39° С в течение 10 минут. Затем к этой смеси добавляли 10 мкл глутаральдегида в концентрации 0,1 % для фиксации. При такой концентрации глутаральдегида флуоресценция остается стабильной в течение 2 часов и не оказывает влияния на клетки [12]. После этого при комнатной температуре 10 мкл суспензии сперматозоидов размещали на предметном стекле и смешивали с 10 мкл 0,22 М 1,4-диазобициклооктана, растворенного в глицерол/PBS (9:1, v/v). Образцы накрывали покровным стеклом, которое закрепляли с помощью бесцветного лака. Препараты до момента наблюдения хранили в темноте при 4 0С. Сперматозоиды (по 200 штук на стекло в дупликатах) анализировали с помощью микроскопа Zeiss AXIO imager.A1. Сперму оценивали в соответствии с одним из трех типов окрашивания [13]: равномерная флуоресценция во всей головке (некапацитированные клетки), свободная от флуоресценции полоса в постакрососмальном районе (капацитированные клетки), и низкая флуоресценция во всей головке, за исключением тонкой яркой полосы флуоресценции в экваториальном сегменте (акросома-реактивные клетки).
В каждом эксперименте оценивалось 800-1000 клеток.
Достоверность различия сравниваемых средних значений для 4-5 независимых экспериментов оценивали с помощью /-критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение. Известно, что повышение концентрации цАМФ внутри клетки ведет к капацитации спер-миев [6]. В своей работе мы стимулировали капацитацию посредством инкубации сперматозоидов в присутствии биологически активного аналога цАМФ - дбцАМФ и ингибитора фосфодиэстеразы - теофил-лина, также повышающего внутриклеточный уровень цАМФ. В серии экспериментов, результаты которых отражены на рис. 1, была подобрана оптимальная концентрация теофиллина, как ингибитора фосфо-диэстеразы, при совместном действии с 1 мМ дбцАМФ, ведущая к индукции капацитации у наибольшего числа сперматозоидов. Для этого к трем образцам добавляли дбцАМФ (конечная концентрация 1 мМ) и теофиллин в концентрации 100, 200 или 500 мкМ.
Контролем служили клетки, проинкубированные в тех же условиях без добавления индукторов капацитации. Выявлено, что добавление теофиллина и дбцАМФ в концентрации 200 мкМ и 1 мМ соответственно, ведет к индукции капацитации у наибольшего числа сперматозоидов быков. Дальнейшее увеличение концентрации теофиллина не привело к росту доли капацитированных клеток, что говорит об отсутствии значимой активности фосфодиэстеразы спермиев (концентрация клеток - 50 млн./мл) уже при 200 мкМ теофиллина в растворе.
1 2 3 4 5
Рис. 1. Влияние различных концентраций теофиллина и дбцАМФ на капацитацию в сперматозоидах быков. По горизонтали: 1 - контрольные клетки (0 часов инкубации); 2 - контрольные клетки (4 часа инкубации); 3 - совместное действие теофиллина и дбцАМФ в концентрации 100 мкМ и 1 мМ, соответственно; 4 - совместное действие теофиллина и дбцАМФ в концентрации 200 мкМ и 1 мМ, соответственно; 5 - совместное действие теофиллина и дбцАМФ в концентрации 500 мкМ и 1 мМ, соответственно.
По вертикали - процент капацитированных сперматозоидов.
Различия достоверны при: P<0,01 (2 и 4), P<0,05 (2 и 5)
Еще в 1989 году Пэриш и соавторами было продемонстрировано, что глюкоза способна ингибировать гепарин-индуцированную капацитацию сперматозоидов быков [14]. Висконти и соавторы показали, что при этом происходит подавление фосфорилирования белков по тирозину, однако влияние глюкозы на стимулированную дбцАМФ и IBMX (еще одного ингибитора фосфодиэстеразы) капацитацию изучено не было [7]. На рис. 2 отражены данные серии экспериментов, где мы проверили способность глюкозы ингибировать капацитацию, стимулированную совместным действием дбцАМФ и теофиллина в концентрации 100 мкМ и 200 мкМ, соответственно. Для этого спермии
(50 млн. клеток/мл) были проинкубированы в среде, содержащей помимо дбцАМФ и теофиллина глюкозу в концентрации 5 мМ. Контролем служили клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но без данной гексозы. В экспериментах оценивали 2 контрольные группы: образцы, окрашенные на 0 часов, и клетки, окрашенные после четырехчасового инкубирования в среде без глюкозы, дбцАМФ и теофиллина.
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
" I
1
-
1
2
3
4
5
Рис. 2. Влияние глюкозы на стимулированную совместным действием теофиллина и дбцАМФ капацитацию в сперматозоидах быков. По горизонтали: 1 - контрольные клетки (0 часов инкубации); 2 - контрольные клетки (4 часа инкубации); 3 - глюкоза в концентрации 5 мМ; 4 - совместное действие теофиллина в концентрации 200 мкМ и дбцАМФ в концентрации 100 мкМ; 5 - совместное действие глюкозы, теофиллина и дбцАМФ. По вертикали - процент капацитированных сперматозоидов. Различия достоверны при: Р<0,001 (2 и 3; 4 и 5), P<0,05 (2 и 4)
Согласно полученным нами данным, дбцАМФ и теофиллин в концентрации 100 мкМ и 200 мкМ соответственно также способны стимулировать капацитацию сперматозоидов быков, но их действие подавляется глюкозой: доля капацатированных клеток в опытном образце достоверно меньше, чем в контрольном (дбцАМФ + теофиллин без глюкозы). Такой результат свидетельствует о том, что механизм, посредством которого данная гексоза ингибирует капацитацию, включает не только влияние на фосфорилирование белков по тирозину [7], но также затрагивает другой ключевой момент процесса постэякуляцион-ного созревания сперматозоидов. Какой именно, еще предстоит выяснить. В планах дальнейших исследований более детальное изучение механизма ингибирующего действия глюкозы на капацитацию.
Ранее было показано, что в процессе капацитации спермиев быков происходит фосфорилирование белков по тирозину протеинкиназой А, регулируемое цАМФ [7], однако не ясно до конца, является ли этот механизм ключевым или же побочным звеном постэякуляционного созревания сперматозоидов. Микрофиламенты - клеточные компарт-менты, вовлеченные в процесс созревания ооцитов свиней, - они являются важной частью кальцийзависимой сигнальной системы, запускающей реинициацию мейоза, как было выявлено Денисенко и Кузьминой в 2013 году [15].
60 50
40 30 20 10 0
2
3
4
5
Рис. 3. Влияние ингибиторов полимеризации микрофиламентов цитохалазина Д и ингибитора протеинкиназы А соединения Н-89 на стимулированную совместным действием теофиллина и дбцАМФ капацитацию в сперматозоидах быков. По горизонтали: 1 - контрольные клетки (0 часов инкубации); 2 - контрольные клетки (4 часа инкубации) К4; 3 - совместное действие теофиллина и дбцАМФ в концентрации 100 мкМ и 1 мМ, соответственно; 4 - совместное действие цитохалазина Д, теофиллина и дбцАМФ; 5 - совместное действие Н-89, теофиллина и дбцАМФ. По вертикали - процент капацитированных сперматозоидов. Различия достоверны при: Р<0,001 (3 и 4; 3 и 5), P<0,01 (2 и 3)
В следующей серии экспериментов идентифицировали роль акти-новых филоментов и протеинкиназы А в процессе капацитации мужских гамет быков. Для этого инкубировали сперматозоиды, помимо аго-нистов цАМФ, в присутствии ингибитора полимеризации микрофила-ментов цитохалазина Д (столбец 4 на рис. 2) и ингибитора ПКА соединения ^89 (столбец 5 на рис. 2). Контролем также, как и в предыдущей серии экспериментов, служили клетки, которые инкубировали в присутствии дбцАМФ и теофиллина, но без ингибиторов, также было 2 допол-
нительных контроля: на 0 часов и 4 часа. В образцах, обработанных дбцАМФ, теофиллином и вышеуказанными ингибиторами, доля капа-цитированных клеток достоверно снижалась относительно контроля, в котором спермии были инкубированы в присутствии только агонистов цАМФ. Полученные данные позволяют говорить о ключевом значении для капацитации, стимулированной совместным действием дбцАМФ и теофиллина, как микрофиламентов, так и ПКА.
Заключение. Результаты исследований позволяют утверждать, что капацитация сперматозоидов быков, стимулированная совместным действием дбцАМФ и теофиллина, ингибируется глюкозой, и ключевую роль в таком механизме индукции капацитации играют микрофи-ламенты и ПКА. Полученные данные еще на шаг приближают нас к пониманию механизмов постэякуляционного созревания сперматозоидов, что будет способствовать развитию технологии отбора, криокон-сервации мужских гамет и искусственного осеменения как у сельскохозяйственных животных, так и человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. Д е н и с е н к о, В. Ю. Эффект витрификации на функционирование структурных элементов цитоскелета в ооцитах свиней / В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина // Физиология. - 2013. - Т. 99. - № 11. - С. 1313-1321.
2. Д е н и с е н к о, В. Ю. Эффект гуаниновых нуклеотидов и протеинкиназы С на стимулированное пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина // Онтогенез. - 2005. - Т. 36. - С. 1-6.
3. F r a s e r, L. R. Ca2+-regulating mechanisms that modulate bull sperm capacitation and acrosomal exocytosis as determined by chlortetracycline analysis / L. R. Fraser, L. R. Abey-deera, K. R. Niwa // Mol. Reprod. Dev. - 1995. - 40. 233-241.
4. H a n d r o w, R. R. Calcium requirement and increased association with bovine sperm during capacitation by heparin / R. R. Handrow, N. L. First, J. J. Parrish // J. Exp. Zool. - 1989. -25:174-182.
5. G a l a n t i n o-H o m e r, H. L. Regulation of protein tyrosine phosphorylation during bovine sperm capacitation by a cyclic adenosine 39,59-monophosphate-dependent pathway. H. L. Galantino-Homer, P. E. Visconti, G. S. Kopf // Biol Reprod. - 1997; 56:707-719.
6. H a r r i s o n, R. A. CAMP-dependent protein kinase control of plasma membrane lipid architecture in boar sperm / R. A. Harrison, N. G. Miller // Mol. Reprod. Devel. - 55:220-228. - 2000.
7. P a r r i s h, J. J. Capacitation of bovine sperm by heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH / J. J. Parrish, J. L. Susko-Parrish, N. L. First // Biol Reprod. -1989; 41:683-699.
8. P a r r i s h, J. J. Differences in the role of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate during capacitation of bovine sperm by heparin or oviduct fluid / J. J. Parrish, J. L. Susko-Parrish, C. L. Uguz // Biol. Reprod. - 1994. 51 :1099-1108.
9. Soluble adenylyl cyclase as an evolutionarily conserved bicarbonate sensor. Y. Chen [et. al.] // Science. - 2000. - 289:625-628.
10. V i s c o n t i, P. E. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway / P. E. Visconti, G. D. Moore, J. L. Bailey // Devel. - 1995. 121 : 1139-1150.
11. V i s c o n t i, P. E. Cholesterol efflux-mediated signal transduction in mammalian sperm / P. E. Visconti, H. Galantino-Homer, X. P. Ning // J. Biol. Chem. - 1999. - 274: 235-3242.
12. W a r d, C. R. Determination of the time course of capacitation in mouse spermatozoa using a chlortetracycline fluorescence assay / C. R. Ward, B. T. // Storey Dev. Biol. 1984. 104. 287-296.
13. W h i t e, D. R. Relationship between calcium, cyclic AMP, ATP, and intracellular pH and the capacity of hamster spermatozoa to express hyperactivated motility / D. R. White, R. J. Aitken // Gamete Res. 1989. 22:166-177.
14. Z e n g, Y. Sperm membrane potential: hyperpolarization during capacitation regulates zona pellucidadependent acrosomal secretion / Y. Zeng, E. N. Clark, H. M. Florman // Devel. Biol. 171:554-563. 1995.
15. Z e n g, Y. Ph regulation in mouse sperm: identification of na(+)-, cl(-)-, and hco3(-)-dependent and arylaminobenzoate-dependent regulatory mechanisms and characterization of their roles in sperm capacitation / Y. Zeng, J. A. Oberdorf, H. M. Florman // Devel. Biol. 173: 510-520. 1996.
УДК 636.22/.28.082
ПЕРЕДАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ (метод СРВ): КОРРЕЛЯЦИЯ ПРИЗНАКОВ И ПОВТОРЯЕМОСТЬ ОЦЕНКИ БЫКОВ
В. Б. ДМИТРИЕВ, Ю. Г. ТУРЛОВА
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных», г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, Российская Федерация, 196625
(Поступила в редакцию 28.01.2015)
Введение. Современные методы селекции, направленные на более полную оценку генотипа животных, нуждаются в расширенном изучении селекционно-генетических процессов, протекающих в популяции как сложной биологической системе. Одним из биологических свойств организма является передающая способность, генетическая природа которого практически не исследована и, следовательно, не включена в оценку генотипа. Разработка данной проблемы одинаково важна для теории и практики животноводства.
Анализ источников. Основным методом оценки племенной ценности быков до настоящего времени остается сравнение продуктивности дочерей со сверстницами в стаде (регионе) [1]. Для повышения точности оценки быков рекомендуются методы BLUP и Animal Model
136
