CC BY
26
УДК 591.421:577.15:613.84
Э01: 10.17238/РшД609-1175.2016.3.18-21
Роль матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора металлопротеиназ-2 в ремоделировании тканей слизистой оболочки носа при хронической интоксикации табачным дымом у крыс
Ю.Б. Лепейко1, И.В. Дюйзен1, 2, В.А. Невзорова1, Е.А. Гилифанов1
1 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),
2 Институт биологии моря Дальневосточного отделения РАН (690022, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17)
Выполнен анализ активности ряда параметров структурного ремоделирования слизистой оболочки носа у крыс, подвергавшихся длительной интоксикации табачным дымом. У 25 крыс-самцов линии Вистар формировали модель хронического табакокурения путем дозированной подачи табачного дыма в специализированные камеры в течение 9 мес. Контролем служили 20 интактных животных. С помощью иммунопероксидазной реакции на парафиновых срезах выявляли матриксную металлопротеиназу-9 (MMP-9) и ее тканевой ингибитор (TIMP-2). В опыте происходило значительное увеличение активности ММР-9 и площади, занимаемой межклеточным ферментом. Наиболее выраженные изменения наблюдались в собственной пластинке слизистой оболочки. Изменение активности TIMP-2 демонстрировали противоположную динамику. Базируясь на данных о молекулярных механизмах регулирования активности матриксных металло-протеиназ, можно считать, что фармакологическое воздействие на данную ферментную систему позволит обеспечить профилактику и лечение грубых морфо-функциональных расстройств слизистой оболочки носа, встречающихся у курильщиков.
Ключевые слова: дыхательные пути, табакокурение, активность ферментов, иммуногистохимия.
В патогенезе структурного ремоделирования тканей дыхательных путей при различных патологических процессах большое значение придается активности ферментов межклеточного матрикса, обеспечивающих деградацию интерстициальных белков. Современные достижения протеомики показали, что в нормальном развитии, физиологическом обновлении и восстановлении тканей, а также в формировании патологических изменений ведущими являются две группы белков: матриксные металлопротеиназы (matrix metalloproteinases, MMP) и их тканевые ингибиторы (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMP) [1, 3, 6]. Семейство MMP, представленное цинк- и кальций-зависимыми эндопептидазами, состоит из 20 энзимов, способных расщеплять почти все компоненты внеклеточного матрикса соединительных тканей [3]. Уровень их синтеза и секреции регулируется факторами транскрипции, а протеолитическая активность зависит от химических преобразований молекул в ин-терстициальном пространстве. В результате может наблюдаться либо активация проферментов, либо ингибирование их активных форм. В зависимости от типа метаболизируемого белка ММР можно разделить на коллагеназы (ММР 1, 8 и 13), желатиназы (ММР 2 и 9), стромализины (ММР 3 и 10) и др. [5, 8, 11, 13]. У млекопитающих описаны четыре TIMP, которые ингибируют все ММР в соотношении 1:1, посредством сильной ковалентной связи [9].
Принято считать, что поддерживаемый в тканях и органах баланс протеолитических и антипротеоли-тических механизмов осуществляется специфическим
Лепейко Юлия Борисовна - лаборант Центральной научно-исследовательской лаборатории ТГМУ; e-mail: [email protected]
набором ферментов межклеточного матрикса и их ингибиторов [2, 4]. С другой стороны, каждому патологическому процессу присущ определенный набор экспрессируемых и депрессируемых энзимов межклеточного матрикса. В этой связи большие перспективы в создании таргетной терапии многих заболеваний связывают с определением тканевой специфичности ферментов межклеточного матрикса и выявлением закономерностей изменения их активности при развитии патологии.
Табачный дым, как весьма агрессивный фактор внешней среды, способен приводить к патологическому ремоделированию органов дыхательной системы, в том числе - за счет изменения функций ММР [6, 10]. В ряде работ показана роль отдельных типов ММР при развитии никотин-ассоциированной патологии легких и бронхов [1, 6, 8, 12]. Однако значение данных ферментов в структурных и функциональных перестройках слизистой оболочки верхних дыхательных путей при хроническом табакокурении изучена лишь фрагментарно.
Цель работы - анализ активности ММР-9 и ее тканевого ингибитора (Т1МР-2) в слизистой оболочке носа у крыс, подвергавшихся длительной интоксикацией табачным дымом.
Материалы и методы
Содержание животных и экспериментальные процедуры осуществлялись в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и были согласованы с этическим комитетом. У 25 крыс-самцов линии Вистар массой около 320 г
PMJ 2016 No. 3
Original Researches
19
формировали модель хронического табакокурения путем дозированной подачи табачного дыма в специализированные камеры в течение 9 мес. (по одной пачке сигарет ежедневно). Контролем служили 20 интактных животных. Локализацию и уровень активности ММР-9 и TIMP-2 в тканях слизистой оболочки полости носа осуществляли с помощью общеморфологических и им-муногистохимических методов.
Для иммунопероксидазной реакции использованы первичные антитела anti-MMP9 (rabbit polyclonal, ThermoScientific, rb-9234-p, 1:200), anti TIMP2 (rabbit polyclonal, Abcam, ab61224, 1:100), биотинилированные вторичные антитела (ThermoScientific), стрептавидин-пероксидаза (ThermoScientific) и хромоген (Peroxidase Substrate Kit, Vector NovaRED, SK-4800). Реакция проводилось на парафиновых срезах толщиной 10 мкм согласно стандартной методике. Инкубация с первичными антителами осуществлялась при температуре 4 °С, обработка вторичными антителами и хромогеном выполнялась в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. Для анализа морфологических изменений тканей и подсчета числа иммунопозитивных элементов некоторые параллельные препараты после окраски хромогеном докрашивались гематоксилином и эозином.
Для оценки тканевого распределения и активности иммунопероксидазной реакции использовали методы количественного и полуколичественного анализа. Об уровне активности судили по количеству ММР-9-позитивных клеток, их процентному содержанию, а также доли площади, занимаемой продуктом реакции в отдельных слоях слизистой оболочки. Удельную плотность иммунопозитивных клеток (количество клеток в 1 000 000 мкм3 ткани) оценивали на каждом срезе в 10 неперекрывающихся полях зрения микроскопа (объектив 40х и окуляр 10х). Измерения делали с использованием программы ImageJ 4.0 после получения изображения на камере AxioCam ICc3 Rev. 3 (Carl Zeiss). Морфометрия выполнялась на срезах, не докрашенных гематоксилином и эозином.
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение и его среднее квадратичное отклонение. Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Распределение активности ММР-9 в слизистой оболочке полости носа у животных контрольной группы соответствовало местам расположения рыхлой волокнистой соединительной ткани (рис., а). Фермент локализовался в собственной пластинке слизистой и в подслизистой основе. При малом увеличении локализация иммуногистохимической метки определялась в виде тонкой полоски преципитата непосредственно под эпителиальными слоями - под базальной
Таблица
MMP-9 и TIMP-2 в слизистой оболочке носа при хронической интоксикации табачным дымом у крыс
Площадь иммунопозитивной зоны, %
Группа Фермент в эпителии в собственной пластинке в подслизис-той основе
Контроль MMP-9 14,9±3,2 11,6±1,4 3,4±0,9
Опыт 29,4±4,3 35,5±3,5 9,7±2,9
Контроль TIMP-2 26,0±3,9 28,6±7,7 17,9±1,9
Опыт 20,7±8,9 5,8±2,4 14,9±7,2
Примечание. Разница с контролем по всем показателям статистически значима.
мембраной мерцательного эпителия и под базаль-ной мембраной секреторных эпителиоцитов желез в подслизистой основе. При сильном увеличении становилось очевидным, что продукт реакции большей частью располагался на мембране фибробластов и других клеточных элементов стромы (рис., г). В некоторых случаях в собственной пластинке слизистой выявлялись одиночные тучные клетки с характерной зернистостью, содержавшие продукт иммуногисто-химической реакции. Кровеносные сосуды соединительнотканных слоев слизистой оболочки также были окружены тонкой прослойкой ММР-9-содержащей ткани.
В слизистой оболочке носа крыс опытной группы заметно увеличивались активность ММР-9 и площадь, занимаемая ферментом (рис., б; д). Наиболее выраженные изменения наблюдались в собственной пластинке слизистой оболочки (табл.). В эндотелии кровеносных сосудов подслизистой основы (преимущественно в артериях среднего диаметра) также регистрировалась экспрессия фермента (рис., в). Возрастало и количество тучных клеток, демонстрировавших активность ММР-9, которые чаще располагались неравномерно, в виде очаговых скоплений (рис., е). Их число в подслизистой основе доходило здесь до 11,0±3,1 в 10 п.з. (контроль - 6,1±1,0 в 10 п.з.).
У животных контрольной группы активность Т1МР-2 определялась в соединительнотканных пластах и клетках мерцательного эпителия (преимущественно в апикальных зонах). В собственной пластинке слизистой оболочки активность фермента была невысокая. В соединительной ткани подслизистой основы Т1МР-2-позитивная зона имела наименьшую протяженность. Эпителиоциты желез подслизистой основы фермента не содержали (табл.).
Активность Т1МР-2 в опыте демонстрировала противоположную динамику - снижалась в эпителии и собственной пластинке и увеличивалась в подсли-зистой основе. Во всех слоях слизистой оболочки заметно уменьшалась площадь Т1МР-2-позитивной зоны, однако в собственной пластинке слизистой обнаруживались сгруппированные в небольшие кластеры
Рис. Распределение активности ММР-9 в слизистой оболочке носа крыс: а - слизистая оболочка, контроль; б - слизистая оболочка, опыт; в - фибробласты и железы подслизистой основы (стрелки) у интактных животных; г - распределение продукта реакции (стрелки) в сосуде подслизистой основы животного контрольной группы; д - покровный эпителий животного опытной группы; е - скопления тучных клеток в подслизистой основе животного опытной группы. ЭП - эпителий, СП - собственная пластинка, ПО - подслизистая основа; Ж - железы. Масштаб: а, б - 100 мкм; в - 20 мкм; г, д - 10 мкм; е - 50 мкм. Иммунопероксидазнаяреакция.
макрофаги, демонстрировавшие невысокий уровень экспрессии фермента (табл.).
Обсуждение полученных данных
Длительная экспозиция табачного дыма обусловливала значительное изменение активности ферментов, участвующих в регуляции структурных и функциональных свойств межклеточного вещества. Выраженная активация ММР-9 во всех слоях слизистой оболочки и экспрессия этого фермента эндотелиальными клетками сосудов происходила на фоне значительного снижения активности ее эндогенного ингибитора - Т1МР-2. Данный метаболический дисбаланс может лежать в основе структурного ремоделирования стенки дыхательных путей, приводя к глубоким функциональным расстройствам. К настоящему времени известны данные о сходной динамике активности ММР в респираторном отделе дыхательной системы при длительном табакокурении [1, 5]. Активация ММР-9 ведет к усилению протеолитической активности в отношении белков
межклеточного матрикса, а снижение уровня Т1МР-2 служит важнейшим фактором патогенеза хронической обструктивной болезни легких [1, 4, 7, 10]. В нашем исследовании впервые показано, что слизистая оболочка верхних дыхательных путей, подвергаясь хронической интоксикации табачным дымом, претерпевает сходные метаболические перестройки. Кроме того, мы обнаружили, что наряду с усилением ферментативной активности ММР-9 в местах ее естественного синтеза (соединительнотканных прослойках) при курении происходит индукция фермента в эндотелиоцитах сосудистого русла. Это может обуславливать нарушения микроциркуляции за счет изменения вазомоторного тонуса.
В целом дальнейшее и более детальное исследование функции ММР и их ингибиторов при заболеваниях органов дыхания позволит взглянуть под другим углом на патологические процессы в слизистой оболочке дыхательных путей, оценить результативность и безопасность проводимого медикаментозного лечения, выработать эффективные профилактические мероприятия.
