CC BY
178
УДК: 616.33-006.6-002+616-003.218-037
РОЛЬ КОМПОНЕНТОВ ЖЕЛУДОЧНОЙ СЛИЗИ И КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ИНФИЛЬТРАТА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ В ОЦЕНКЕ РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА ЖЕЛУДКА
М.Б. Каракешишева1, Н.В. Бочкарева1, В.А. Евтушенко1, Р.И. Плешко2,
И.В. Суходоло2, Н.А. Кривова3
ГУ «НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН»1 ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, кафедра морфологии и общей патологии2 НИИ биологии и биофизики при ТГУ, г. Томск3
Показатели, отражающие состав желудочной слизи и характер клеточного инфильтрата слизистой оболочки желудка, использовались для оценки риска развития рака желудка у больных с дисплазией эпителия II—III степени (85 человек). При построении математической модели для оценки риска развития рака желудка использовался дискриминантный анализ. Чувствительность и специфичность модели составила 89 % и 85 %. Созданная математическая модель позволяет объективно оценить риск развития рака желудка у больных с дисплазией эпителия слизистой оболочки желудка II-III степени, сформировать группу повышенного онкологического риска, что позволяет выявлять рак желудка I стадии в значительном числе случаев.
Ключевые слова: дисплазия, рак желудка, воспалительный инфильтрат, слизь.
ROLE OF GASTRIC MUCUS COMPONENTS AND GASTRIC MUCOSA INFLAMMATORY INFILTRATE CELL COMPOSITION IN THE ASSESSMENT OF RISK FOR GASTRIC CANCER DEVELOPMENT M B. Karakeshisheva1, N.V Bochkareva1, V.A. Yevtushenko1, R.I. Pleshko2,
I.V. Sukhodolo2, N.A. Krivova3 Cancer Research Institute, Tomsk1 Morphology and General Pathology Department, Siberian State Medical University, Tomsk2 Research Institute of Biology and Biophysics, Tomsk3
Parameters of gastric mucus components and the pattern of gastric mucosa cell infiltrate were studied to assess the risk of gastric cancer development for patients with stage II-III epithelial dysplasia (85 patients) using discriminating analysis for creation of mathematical model. Sensitivity and specificity of the model were 89 % and 85 %, respectively. The mathematical model allows to estimate the risk of gastric cancer development for patients with stage II-III epithelial dysplasia and to form the patients’ groups at high risk for cancer.
Key words: dysplasia, gastric cancer, inflammatory infiltrate, mucus.
Прогнозирование течения диспластических процессов слизистой оболочки желудка (СОЖ) и формирование группы риска по раку желудка (РЖ) представляет актуальную медицинскую проблему. Решение этой проблемы невозможно без определения основных факторов риска данного заболевания [2, 10, 12, 14]. В настоящее время доказано, что воздействие H. pylori канцерогенно для человека [7, 14]. По мнению большинства авторов, маловероятно, что H. pylori является единственным фактором, ответственным за развитие РЖ, важно, что он создает среду, способствующую реализации его канцерогенного потенциала [1, 7].
Большое значение в развитии предопухолевых и опухолевых изменений имеет разбалансировка местных и системных защитных факторов. Универсальной, генетически запрограммированной
реакциеи организма на повреждение является воспаление и его проявление - воспалительная инфильтрация [1]. Характеристика воспалительного клеточного инфильтрата позволяет составить представление о состоянии защитных сил организма на различных этапах гастроканцерогенеза.
Известен ряд факторов, которые рассматриваются как ко-канцерогены. В отношении РЖ доказано, что таковыми являются: низкий уровень потребления антиоксидантных витаминов, избыточное потребление соли, потребление копченой и жареной пищи, содержащей нитрозамины и нитрозамиды, курение и избыточное потребление алкоголя [20, 21]. Кроме того, большое значение имеет соотношение проканцерогенных и антиканцерогенных (защитных) факторов. Среди последних значительную роль отводят желудочной слизи [8, 14].
Необходимо отметить, что в последнее время трансмембранные гликопротеины (Гп надэпи-телиального слизистого слоя) или, как их еще иначе называют, гельформирующие секрети-руемые муцины (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6) интенсивно изучаются с использованием иммуногистохимического метода, метода гибридизации in situ и методом Western blotting. Показана взаимосвязь экспрессии кишечного муцина MUC2 c муцинозным типом рака и плохой выживаемостью [22, 24]. Экспрессия MUC13 характерна для кишечного типа рака и фрагментов СОЖ с кишечной метаплазией и не выявляется в нормальной слизистой [25]. Показано, что в нормальной СОЖ экспрессируются следующие муцины: MUC1, MUC5AC и MUC6. При развитии РЖ состав муцинов меняется качественно и количественно. В ранних раках с высокой частотой выявляется экспрессия MUC1, тогда как в запущенных формах и с метастазами - значительно реже. При III-IV стадии процесса и при инвазии в серозную оболочку в большей степени выявляется гиперэкспрессия MUC3 [26].
Данные литературы свидетельствует, что анализ компонентов надэпителиального слизистого слоя (НэСС) и клеточного состава воспалительного инфильтрата используется для фенотипирования опухолей желудка и прогнозирования течения РЖ [18, 22, 24], но ранее не использовался для оценки риска развития РЖ у больных с диспластическими изменениями СОЖ.
Материал и методы
В исследование были включены 85 человек, находившихся на амбулаторном и стационарном лечении в клинике ГУ «НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН», которые в зависимости от нозологической формы заболевания были разделены
на четыре группы (таблица). При формировании групп исследования оценивались возраст, пол, статус по курению, жалобы, данные анамнеза, данные объективного исследования. Из исследования были исключены больные РЖ с IV стадией заболевания, со стенозом выходного отдела желудка, с язвенной болезнью ДПК, с оперативным вмешательством на желудке и ДПК в анамнезе, с полипозом желудка. Эндоскопическое обследование проводили с помощью фиброгастроскопов GIF-XQ-10 и GIF-XQ-40 фирмы «01утрш». Во время эндоскопического исследования производили сбор проб пристеночно-полостной слизи, для морфологической верификации изменений получали биоптаты СОЖ, у пациентов II и III групп биопсия производилась из зоны опухолевого поражения.
Биоптаты СОЖ обрабатывали по стандартной методике, фиксировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Окрашенные препараты изучались под микроскопом при увеличении объектив*90, окуляр*10, *5. Производили подсчет клеток в собственной пластинке СОЖ с использованием сетки Автандилова с пересчетом количества на 1 мм2. При сочетанной окраске гистологических срезов основным коричневым и прочным зеленым гранулы тучных клеток приобретают коричневый цвет, а гранулы активных нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, содержащих катионные белки, окрашиваются в различные оттенки зеленого цвета [4]. Далее проводили подсчет высоко-, умеренно- и низко-гранулированных форм эозинофилов и тучных клеток.
Выделение полимеризованных Гп желудочной слизи проводилось по методу, предложенному Б.В. Питраном (1990) [11]. Для определения концентрации белковой части Гп использовали метод, основанный на осаждении белков ами-до-черным [3]. Для определения углеводного
Таблица
Характеристика групп больных
Группа Диагноз Кол-во больных Средний возраст, лет (M±m)
I Больные с дисплазией эпителия СОЖ П-Ш степени 21 52,2±2,32
II Больные РЖ, гистотип - аденокарцинома 24 55,3±2,68
III Больные РЖ, гистотип-перстневидно-клеточный вариант 19 55,0±2,59
IV Условно здоровые лица 20 48,7±7,00
состава Гп проводили ступенчатый кислотный гидролиз по методу А. Нойберга и Р.Д. Маршалла (1969) с учетом данных Н.А. Кривовой (1994) [5]. Концентрацию галактозы определяли по методу D.U. Handel и W. Kittlak (1963) [19], фукозы - по методу Dishe и Shettles [17], гексозаминов - по методу G.Blix (1948) [16], сиаловой кислоты - с помощью 2-тиобарбитура-товой кислоты [27]. В гомогенате, содержащем внеструктурные компоненты желудочной слизи, определяли концентрацию нуклеиновых кислот по методу Г.А. Критского (1980) [6], активность пепсина [23] и уровень бикарбонатов - титра-ционным методом.
При построении математической модели для оценки риска развития РЖ использовался дискриминантный анализ [15]. Результатом дискриминантного анализа явилась статистическая модель, представленная набором линейных дискриминантных функций, определяющих границы принятия решения в пользу той или иной группы (класса). Линейная дискриминантная функция представляла собой линейную комбинацию переменных (показателей), включенных в модель:
Y=a х Х+b,
где Y - значение линейной дискриминантной функции; X - определяющая переменная; а - коэффициент при определяющей переменной;
b - независимая константа.
Процедуру отнесения объекта к классу проводили в 2 этапа. Сначала рассчитывали значения Y1 и Y2 c использованием значений признаков у исследуемого объекта, далее относили объект (больного с диспластическими изменениями СОЖ) к одному из классов (если Y1>Y2 , то объект относится к первому классу (РЖ). Если Y1<Y2, то объект относится ко второму классу (диспластические изменения СОЖ). При отнесении объекта к первому классу констатировали наличие высокого риска развития РЖ, при отнесении объекта ко второму классу -отсутствие риска развития РЖ.
Результаты и обсуждение
При создании математической модели были использованы следующие показатели: пол, возраст больных, статус по курению, уровень
гексозаминов в НэСС, галактозы, фукозы, си-аловой кислоты, сумма моносахаров Гп слизи, концентрация белковой части Гп, уровень ну-кленовых кислот, бикарбоната, пепсина; общая клеточность воспалительного инфильтрата СОЖ, количество лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов, сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, общее количество тучных клеток, соотношение низкогранулированных и умеренногранулированных тучных клеток, низкогранулированных и высокогранулирован-ных эозинофилов.
Классификация проводилась для групп: 1 -РЖ (в данную группу были включены пациенты с аденокарциномой и перстневидноклеточным РЖ); 2 - дисплазия СОЖ. Дискриминантный анализ включал следующие этапы: первичный отбор признаков для построения модели; набор обучающей выборки (группы больных, у которых регистрируются отобранные признаки); отбор информативных признаков и формирование на их основе группы дифференциальных функций (критерий Фишера); проверка качества полученной дискриминантной модели. Были получены следующие линейные дискриминантные функции:
Y1=424,4 х В1+434,1 х В2+308,8 х В3-188,4 х В4+196,5 х В5+2020,5 х В6+225,3 х В7-0,1 х В8 +265,2 х В9 -19874,3;
Y2 =150,6 х В1+172,77 х В2+91,61 х В3-27,17 х В4+112,42 х В5+1004,32 х В6+87,66 х В7+0 х В8+115,34 х В9-2872,49, где В1 - сумма моносахаров Гп НэСС,
В2 - уровень гексозаминов слизи,
В3 - уровень галактозы,
В4 - уровень бикарбонатов,
В5 - уровень пепсина,
В6 - уровень сиаловой кислоты,
В7 - концентрация белковой части в Гп,
В8 - общее количество тучных клеток в воспалительном инфильтрате СОЖ,
В9 - уровень фукозы в Гп слизи.
Оценку качества полученных функций проводили на 20 пациентах, не включенных в основную выборку. Чувствительность и специфичность составили 89 % и 85 %.
Приводим пример применения данной модели. Больной М., 51 год, курит в течение 20 лет, в течение 15 лет страдает язвенной болезнью
желудка, последние 10 лет постоянно наблюдается в НИИ онкологии с диагнозом: язвенная болезнь желудка, дисплазия СОЖII-IIIстепени, раз в год проходит профилактическое обследование - гастроскопию с биопсией.
При проведении плановой гастроскопии (12.04.02) у больного выявлены язвы антрального отдела желудка размером 2,5х1,2 см, по результатам морфологического исследования - дисплазия СОЖ II-III степени. При гастроскопии получен желудочный сок. Из желудочного сока получена желудочная слизь и выделены структурные Гп НэСС по вышеописанной методике. Изучен биохимический состав структурных Гп и внеструктурных компонентов слизи. В биопсийном материале оценен клеточный состав инфильтрата и распределение тучных клеток и эозинофилов, инфильтрирующих СОЖ.
Для оценки риска развития РЖ у данного пациента проводили расчет линейных дискриминантных функций Y и Y2 по вышеуказанным формулам.
С учетом, что сумма моносахаров Гп НэСС у данного пациента была 17,25 (B1), уровень гексозаминов слизи - 3,11 (B2), уровень галактозы
- 10,98 (B3), уровень бикарбонатов - 3,43 (B4), уровень пепсина - 5,43 (B5), уровень сиаловой кислоты - 0,43 (B6), концентрация белковой части в Гп - 3,49 (B7), общее количество тучных клеток в воспалительном инфильтрате СОЖ в 1 мм2- 168,43 (B8), уровень фукозы в Гп слизи - 2,43 (B9), при расчете дискриминантных функций оказалось, что Y =-5112,-69, Y =2803,86, следовательно, Y<Y2. Таким образом, данный больной относился в группу «дисплазия СОЖ» и высокого риска развития РЖ у него не было.
Через 2 года этот же больной обратился в НИИ онкологии с жалобами на боли в эпигастральной области. При проведении гастроскопии выявлена язва в антральном отделе, по результатам морфологического исследования
- язва желудка, воспаление, дисплазия СОЖ II-III степени. При гастроскопии получен желудочный сок. Из желудочного сока получена желудочная слизь и выделены структурные Гп НэСС, изучен биохимический состав структурных Гп и внеструктурных компонентов слизи.
В биопсийном материале изучено количество тучных клеток.
Для оценки риска развития РЖ у данного пациента проводили расчет линейных дискриминантных функций Y и Y2.
С учетом, что сумма моносахаров Гп НэСС у данного пациента была 48,92 (В1), уровень гексозаминов слизи - 4,77 (В2), уровень галактозы -
7,43 (В3), уровень бикарбонатов - 6,05 (В4), уровень пепсина - 10,48 (В5), уровень сиаловой кислоты - 0,39 (В6), концентрация белковой части в Гп - 8,67 (В7), общее количество тучных клеток в воспалительном инфильтрате СОЖ в 1 мм2- 254,91 (В8), уровень фукозы в Гп слизи -6,19 (В9), при расчете оказалось, что Y =19783, Y2=11627, следовательно, Y> Y2.Таким образом, данный больной отнесен к группе «рак желудка» и на данный момент времени имел высокий риск развития РЖ.
Через 1 год больной обратился в НИИ онкологии на плановое обследование. При гастроскопии выявлена язва антрального отдела желудка размером до 3 см с конвергенцией складок к язвенному дефекту. По результатам морфологического исследования - перстневидно-клеточный рак. Больному выполнена суб-тотальная резекция желудка, по результатам морфологического исследования послеоперационного материала - перстневидно-клеточный
рак Т^Ма.
Таким образом, использование разработанной математической модели позволило оценить риск развития РЖ у больного с дисплазией СОЖ и своевременно выявить РЖ в ранней стадии. Необходимо отметить, что в модель не вошли традиционные факторы риска развития РЖ: возраст, пол, статус по курению. Однако факторы, отражающие биохимический состав внутри-полостной слизи, а также количество тучных клеток в воспалительном инфильтрате СОЖ, оказались информативными признаками.
Оценка риска развития РЖ у больных с дис-пластическими изменениями СОЖ особенно актуальна, поскольку ранее было показано, что у части больных диспластические изменения могут быть обратимы вплоть до полной регрессии диспластического процесса [9]. Использование данных параметров для формирования группы
повышенного онкологического риска среди больных с выраженными диспластическими изменениями СОЖ достаточно актуально и привлекательно, поскольку в настоящее время до 80-90 % РЖ, в том числе и ранних РЖ, являются эндофитными опухолями, с внутристеночной опухолевой инфильтрацией, мизерными проявлениями на поверхности слизистой. Эндоскопическая диагностика такого рака затруднена [13]. Использование показателей воспалительного инфильтрата СОЖ и биохимического состава слизи позволяет объективно оценить риск развития РЖ у больных с дисплазией СОЖ и при высоком риске проводить адекватный динамический контроль этих пациентов.
Созданная математическая модель позволяет объективно оценить риск развития рака желудка у больных с дисплазией эпителия слизистой оболочки желудка II-III степени, сформировать группу повышенного онкологического риска, что, в конечном счете, позволяет выявлять рак желудка в I стадии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аруин Л.И., Исаков В.А. Оценка обсемененности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori и активности хронического гастрита // Архив патологии. 1995. № 3. С. 75-76.
2. Бочкарева Н.В. Антиоксидантные характеристики биологических жидкостей при диспластических и опухолевых процессах желудка: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Томск, 1998. 16 с.
3. Бузун Г.А., Джемухадзе КМ., Милешко Л. Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиология растений. 1982. T. 2, № 1. C. 198-204.
4. КононовА.В. Местный иммунитет и регенерация слизистых оболочек при хроническом воспалении: биопсийное исследование. Омск, 1993. 320 с.
5. Кривова Н.А. Механизмы образования и деградации надэпителиального слизистого слоя: Дис. ... д-ра биол. наук. Томск, 1994. 254 с.
6. Критский Г.А., Александров С.В. Диагностика радиационного поражения по анализу нуклеиновых кислот крови // Биохимические методы. М., 1980. С. 118-121.
7. Мерабишвили В.М. Рак желудка: эпидемиология, профилактика, оценка эффективности лечения на популяционном уровне // Практическая онкология. 2001. № 3. C. 3-8.
8. Павлова Н.Н. Изменение биохимических характеристик желудочной слизи и системы антиоксидантной защиты организма при предопухолевых заболеваниях и раке желудка: Дис. . канд. мед. наук. Томск, 2004. 152 с.
9. Панкова О.В. Комплексная морфометрическая оценка дисплазии слизистой оболочки при предопухолевых заболеваниях и раке желудка: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Томск, 1997. 23 с.
10. Писарева Л.Ф., Коломиец Л.А. Рак желудка в регионе Сибири и Дальнего Востока. Факторы риска. Томск: STT, 2001. 276 c.
11. Питран Б.В. // Усвоение органических и неорганических соединений в организме животных. Рига, 1990. С. 219-241.
12. Портной Л.М., Сташук Г.А., Денисов Л.Б. и др. Современные возможности лучевой диагностики рака желудка (традиционное рентгенологическое, ультразвуковое, компьютернотомографическое и магнитно-резонанснотомографическое) // Медицинская визуализация. 2000. № 2. C. 3-15.
13. Сиппонен П., Сеппала К. Гастрит - атрофический гастрит - кишечная метаплазия - рак желудка: обратима ли эта последовательность? // Рос. журн. гастр. и гепатологии. 1999. № 2. C. 30-34.
14. Щепотин И., Эванс С.Р. Рак желудка: Практическое руководство по профилактике, диагностике и лечению. Киев: Книга Плюс, 2000. 227 с.
15. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.
16. Blix G. The determination of hexoamines according to Elson and Morgan // Acta Chemia Scand. 1948. Vol. 2, № 5. P 467-473.
17. Dische Z., ShettlesL.B. A Specific colorreaction of methylpen-toses and a spectrophotometric micromethod for their determination // J. Biol. Chemistry. 1948. Vol. 175, № 2. P. 595-603.
18. Grogg K.L., Lohse C.L., Pankratz V Lymphocyte-rich gastric cancer: association with Epstein-Barr virus, microsatellite instability, histology, and survival // Modern Pathol. 2003. Vol. 16, № 7. P 641-651.
19. HandelD. U., Kittlak W. Vergleichende Untersuchung Metodik der Bestimmung des eiwei gebundenen Zuckers // Z. Med. Labor. Techn. 1963. № 4. P. 163-169.
20. Hirayama T. Life-style and cancer: from epidemiological evodence to public behavior change to mortality reduction of target cancer // Monogr. Natl. Cancer Inst. 1992. Vol. 12. P 65-74.
21. La Vecchia S., Avanzo B., Negri E. Attributable risk for stomach cancer in Nothern Italy // Cancer Int. J. 1995. Vol. 60, № 6. P. 748-752.
22. LeteurtreE., Zerimech F., Piessen G. Relationships between mucinous gastric carcinoma, MUC2 expression and survival // World J. Gastroenterol. 2006. Vol. 12, № 21. P 3324-3331.
23. Lowry O.H., RosenbroughN.J., FarrA.L. Protein measured with the Folin phenil reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P 265-275.
24. Reis C.A., DavidL., CarvalhoF. Immunohistochemical study of the expression of MUC6 mucin and co-expression of other secreted mucins (MUC5AC and MUC2) in human gastric cancinomas // J. Histochem. Cytochem. 2000. Vol. 48, № 3. P 377-388.
25. Shimamura T., ItoH., Shibahara J. Overexpression of MUC13 is associated with intestinal-type gastric cancer // Cancer Sci. 2005. Vol. 96, № 5. P. 265-273.
26. Wang R.Q., Fang D.C. Alteration of MUC1 and MUC3 expression in gastric carcinoma: relevance to patient clinicopathological features // J. Clin. Pathol. 2003. Vol. 56, № 5. P 378-384.
27. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acid // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234, № 8. P. 1971-1975.
Поступила 30.04.07
