CC BY
84
сти от режимов респираторной поддержки в неонатальном периоде. // Российский педиатрический журнал. — 2011. — №6 — С. 23-26.
8. Allen J., Zwerdling R., Ehrenkranz R., et al. American Thoracic Society. Statement on the care of the child with chronic lung disease of infancy and childhood. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2003. — Vol. 168. — P. 356-396.
9. Bancalari E., Claure N., Sosenko I.R.S. Bronchopulmonary dysplasia: changes in pathogenesis, epidemiology and definition. // Semin. Neonatol. — 2003. — Vol. 8. — P. 63-71.
10. Yatzik G.V., Davydova I.V., Basargina М.А., et al. The
effect of postnatal surfactant therapy on lung fibrosis in children with Bronchopulmonary Dysplasia / // 4th Europediatrics. — M., 2009. — P. 110.
11. Northway W.H.Jr., Rosan R.C., Porter D.Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease: bronchopulmonary dysplasia. // N Engl J Med. — 1967. — Vol. 276. — P. 357-368.
12. Sunday M., Shan L., Subramaniam M. Immunomodulatory function of the diffuse neuroendocrine system: implifications for bronchopulmonary dysplasia. // Endocrine Pathology, 2004. — V.
15. — P. 91-106.
Информация об авторах: Панченко Александра Сергеевна — к.м.н., доцент, заведующий кафедрой, 672090, г. Чита, ул. Горького, 39-а, тел. (3022) 354324, факс (3022) 323058, e-mail: [email protected]; Гаймоленко Инесса Никандровна — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой; Игнатьева Анна Владимировна — ассистент кафедры, e-mail:[email protected]; Тихоненко Ольга Александровна — к.м.н., доцент кафедры.
© АГЕЕВА Е.С., САРАНЧИНА Ю.В., ИПТЫШЕВ В.М., ШТЫГАШЕВА О.В. — 2013 УДК 616:612.017.1-092
РОЛЬ IL-2 И IL-4 В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ИНФЕКЦИЕЙ HELICOBACTER PYLORI
Елизавета Сергеевна Агеева, Юлия Владимировна Саранчина,
Виктор Михайлович Иптышев, Ольга Владимировна Штыгашева (Хакасский государственный университет им. Н. Ф. Катанова, г. Абакан, Ректор — д.м.н., проф. О.В. Штыгашева, кафедра фундаментальной медицины и гигиены, зав. — к.м.н. Е.С. Агеева)
Резюме. При хроническом гастрите (ХГ) спонтанный апоптоз лимфоцитов был выше, чем при язвенной болезни (ЯБ) (24,3% (21,8-27,1) и 21,4% (19,4-23,6), соответственно, р<0,05). Интенсивность апоптоза при добавлении неспецифического индуктора — перекиси водорода — различалась. Апоптотический индекс был максимальным в контроле (79,1%) и минимальным при ЯБ (16,7%, р<0,05), при ХГ — 33,3%. Факторами, модулирующим апоптоз могут быть как соотношение, так и концентрация цитокинов. В отличие от IL-2, концентрация IL-4 в сыворотке крови была статистически значимо выше при ХГ и ЯБ, по сравнению с контролем.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, язвенная болезнь, хронический гастрит, лимфоциты, апоптоз, IL-2, IL-4.
THE ROLE OF IL-2 AND IL-4 IN REGULATIONS OF APOPTOSIS OF BLOOD LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH HELICOBACTER PYLORI-INFECTION
E.S.Ageeva, Yu. V Saranchina, V M. Iptyshev, O. V Shtygasheva (State University of Khakasia named after N. F. Katanov, Abakan, Russia)
Summary. The spontaneous apoptosis of lymphocytes was higher in the patients with chronic gastritis (CG) than in the patients with stomach ulcer (SU) (24,3 (21,8-27,1) and 21,4 (19,4-23,6) %, respectively, р<0,05). The intensity of apoptosis with nonspecific inductor — hydrogen peroxide — was different. The apoptotic index was maximum in the control (79,1%) and minimum in SU (16,7%, р<0,05). 33,3 % in the CG. The factors, modulating apoptosis can be ratio and concentration of cytokine. Unlike IL-2, concentration of IL-4 in serum of blood was statistically significantly higher in CG and SU, in comparison with control.
Key words: Helicobacter pylori, gastric ulcer, chronic gastritis, lymphocytes, apoptosis, IL-2, IL-4.
Helicobacter pylori (НР) — наиболее часто встречающаяся инфекция, уровень ее распространенности в разных регионах России колеблется от 50 до 70-80 % [4]. Среди патогенетических механизмов важным является способность НР воздействовать на лимфоциты, тем самым модифицировать иммунный ответ макроорганизма. Несомненно, что роль цитокинов в развитии НР-ассоциированных заболеваний (язвенной болезни, хронического гастрита) весьма значительна и разнообразна. Это определяется плейотропностью эффектов цитокинов и заключается в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптотической гибели клеток.
При запуске специфического иммунитета в ответ на инфекционный агент продукция IL-2 активно увеличивается, развивается экспансия Т-лимфоцитов в очаг воспаления. Снижение IL-2 может свидетельствовать о развитии вторичной иммунологической недостаточности. Показано, что снижение количества цитотоксиче-ских лимфоцитов в ответ на НР коррелирует с низким уровнем продукции IL-2 лейкоцитами [15].
^-4 является основным фактором в определении дифференцировки стимулированных антигеном наивных СБ4+-Т-клеток в №2 [2,12,14]. Продукция ^-4 №2-клетками ведет к сильной клональной пролиферации и экспансии активированных В-клеток [7]. Показана взаимосвязь между концентрацией ^-4 и уровнем специфических IgG к НР в слизистой оболочке желудка [13]. При этом ^-4 также оказывает модулирующее действие на апоптоз лимфоцитов крови [3].
В связи, с этим определенный интерес представляет изучение закономерностей функционирования иммунной системы в условиях хронической инфекции НР и возможного модулирующего влияния на апоптоз имму-норегуляторных цитокинов.
Целью исследования являлась оценка взаимосвязи между концентрацией ^-2 и ^-4 в сыворотке крови и апоптозом лимфоцитов крови у больных язвенной болезнью и хроническим гастритом, в условиях хронической инфекции НР.
Материалы и методы
Обследовано 125 европеоидов (русских, пришлое население Республики Хакасия). Из них 60 больных с хроническим гастритом (ХГ), 35 — больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБ). Средний возраст — 42,7±11,6 лет, сопоставимых по полу. Контрольную группу составили 30 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту.
Диагноз ЯБ и ХГ был верифицирован при помощи морфологической оценки изменений слизистой оболочки желудка. НР диагностировали с использованием четырех методов: морфологического, быстрого уреаз-ного теста, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и серологического метода — ИФА (уровень специфических IgG к НР в сыворотке крови).
Для оценки апоптотической гибели лимфоциты крови (3х106 клеток/мл) культивировали в среде RPMI-1640 с L-глутамином (SIGMA, UK), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотики. Апоптоз лимфоцитов крови оценивали через 24 ч с использованием микроскопа «MICROS» (Австрия) при увеличении: объектив 100 х окуляр 10 (окрашивание гематоксилин-эозином). Подсчитывали не менее 200 клеток. Критериями, характеризующими апоптоз in vitro, являлись карио- и цитопатологические изменения (конденсация и маргинация хроматина, уменьшение объема клетки, пузырчатость и фрагментация клеточного ядра) [11]. Результаты выражали в %, характеризующих количество клеток с апоптотической морфологией ко всем остальным клеткам.
Для сравнительного анализа степени прироста индуцированного апоптоза в разных группах определяли апоптотический индекс (АИ), результаты выражали в %:
^ индуцированный апоптоз - спонтанный апоптоз jqqo-
Оценку содержания цитокинов (IL-2, IL-4) в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа согласно инструкции, предлагаемой производителем тест-системы («Procon», г. Санкт-Петербург). Учет результатов проводили с применением фотометра для микропланшетов «Immunochem-2100» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пкг/мл.
Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Рассчитывали медиану (Me) и интерквартильный размах в виде 25 и 75 процентилей (Q25 и Q ). Для проверки статистической значимости различий показателей в сравниваемых группах использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05.
Результаты и обсуждение
Установлено, что относительное количество лимфоцитов крови у больных ЯБ и ХГ, соответствовало 36,2% (30,3-40,0) и 39,5% (36,2-43,3), оба показателя были статистически значимо выше, чем у здоровых доноров — 26,2 (20,3-27,9) %, р<0,05. Абсолютное содержание лимфоцитов крови у больных ЯБ [2,3 (1,9-2,7)х10 9/л] и ХГ [2,8 (2,1-3,5)х10 9/л] статистически не отличалось от такового показателя у здоровых доноров [1,9 (1,8-2,2)х10 9/л].
Одной из причин изменения количества лимфоцитов в сыворотке крови и/или их субпопуляций может служить увеличение интенсивности процессов лимфо-пролиферации. Существует несколько причин модуляции пролиферативного ответа лимфоцитов. В качестве возможных рассматривают увеличение продукции ак-
тивирующих цитокинов либо снижение ингибирующих цитокинов.
В результате проведенного исследования показано, что концентрация IX-2 в сыворотке крови у пациентов с ЯБ составила 139,0 (67,0-256,0) пкг/мл, у больных ХГ — 110,0 (29,5-189,5) пкг/мл, однако, данные показатели статистически не отличались от такового у здоровых доноров — 197,0 (120,0-225,0) пкг/мл. У больных с ЯБ выявлена обратно пропорциональная зависимость между относительным содержанием лимфоцитов крови и концентрацией ]Х-2 (г=-0,81; р<0,05). В отношении продукции ¿-4 в сыворотке крови у пациентов с ХГ и ЯБ были обнаружены высокие значения показателя [350,0 (175,0-568,0) и 241,0 (168,0-370,0) пкг/мл, соответственно], что было статистически значимо превышало значение данного показателя в группе здоровых доноров [37,0 (20,5-56,0) пкг/мл, р<0,05].
Изменение числа лимфоцитов крови при воспалении, может реализоваться и через модулирующий эффект цитокинов на программированную гибель клеток.
Анализ апоптотической гибели лимфоцитов показал, что уровень спонтанного апоптоза при ЯБ составил 21,4% (19,4-23,6), при ХГ — 24,3% (21,8-27,1). В группе здоровых доноров данный показатель был равен 17,9% (16,5-19,0). Полученные данные демонстрируют статистически значимое увеличение апоп-тотически измененных лимфоцитов крови у больных ЯБ и ХГ, по сравнению с группой здоровых доноров (р<0,05). Уровень индуцированного перекисью водорода апоптоза лимфоцитов крови у пациентов с ЯБ составил 26,4% (22,0-28,6), у больных ХГ — 29,6% (27,8-33,8). Оба показателя были ниже, чем в контроле — 31,6% (27,1-34,8), хотя различия не были статистически значимыми. АИ был максимальным в группе здоровых доноров (79,1%), минимальным — при ЯБ (16,7%, р<0,05), при ХГ — 33,3 %.
Известно, что ]Х-2 может выступать как проапоп-тотический, так и антиапоптотический цитокин. Под действием ]Х-2 усиливается индукция клеточных рецепторов и образование FasL и ТОТа цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [5]. Действие цитокинов носит дозозависимый характер. В высоких концентрациях ]Х-2 обеспечивает устойчивость лимфоцитов к апоптотической гибели. В случае отсутствия экспрессия ]Х-2 и его клеточного рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. Высокая интенсивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции П,-2, как правило, наблюдается при инфекционной патологии. Эффекты ІХ-4 также могут быть как проапоптотическим, так и антиапоптотическим, взависимости от концентрации цитокина в крови [6,8]. В апоптогенные концентрации цитокина инициируют как митохондриальный, так и р53-зависимый пути реализации программированной клеточной гибели [9].
Определенное значение имеет генотип НР. Показано, что УаеА субтипы НР — этиологический фактор риска развития ЯБ у пришлого населения (европеоидов) Республики Хакасия [1,10], оказывают иммуносупрес-сирующее действие на Т-лимфоциты через ингибирующее влияние на клеточную пролиферацию и ]Х-2 [16].
Таким образом, апоптоз клеток иммунокомпетент-ного звена играет важную роль в поддержании регуляции и исхода воспаления. Повышение апоптоза приводит к дефициту иммунных клеток, изменению субпопу-ляционного состава лимфоцитов и является одним из проявлений нарушений иммунореактивности. Нами было выявлено, что у больных хроническим гастритом и язвенной болезнью, наряду с изменением числа кле-
ток лимфоцитарного звена, отмечались разной степени зации апоптотической гибели иммунных клеток могут
выраженности, изменения апоптотической гибели лим- являться результатом модулирующего влияния ^-2 и фоцитов крови. Обнаруженные закономерности реали- ^-4 и определяются дозой цитокинов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агеева Е.С., Штыгашева О.В. Особенности ассоциации полиморфных маркеров —251 Т>А гена IL-8 и полиморфизм генов Helicobacter pylori у коренных и пришлых жителей Хакасии // Бюллетень ВСНЦ Со РАМН. — 2012. — № 2 (84). Ч. 2. — С. 9-12.
2. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета // Иммунология. — 2002. — № 2. — С. 77-79.
3. Козлов В.А., Борисов А.Г., Смирнова С.В. и др. Практические аспекты и лечения иммунных нарушений: руководство для врачей. — Новосибирск: Наука, 2009. — 274 с.
4. Костюнин К.Ю., Огарков О.Б., Суханов А.В. и др. Исследование хеликобактерного гастрита в Иркутской области: роль и место морфологического метода // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). — 2009. — Т. 85, №2. — С. 78-82.
5. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и еге регуляция цитокинами // Иммунология. 2002. — № 4. — С. 235-242.
6. Рязанцева Н.В., Чечина О.Е., Новицкий В.В. и др. Молекулярные мишени проапоптотического действия ИЛ-2, ИЛ-4 и фНОа при поляризации иммунного ответа по Th1- и Th2 пути // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: материалы IV Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием г. Новосибирск, 27-29 октября 2009 г. — Новосибирск, 2009. — С. 226-227.
7. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты: рук-во для врачей. — СПб., 1998. — 113 с.
8. Чечина О.Е., Биктасова А.К., Сазонова Е.В. и др. Молекулярные механизмы цитокиновой регуляции апоптоза лимфоцитов // Аллергология и иммунология. — 2009. — Т. 10, № 2. — С. 176.
9. Чечина О.Е., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. и др. Белки семейства Bcl-2- молекулярные мишени проапоптотиче-ского действия ИЛ-2 и ИЛ-4 // Иммунология. — 2011. — Т. 32, № 3. — С. 127-130.
10. Штыгашева О.В., Цуканов В.В. Ассоциация саg A и vac A штаммов Helicobacter pylori и язвенной болезни в организованной популяции г. Абакана. // Росс. журнал гастроэн-тер., гепатологии и колопроктол. — 2004. — №2. — С. 84-87.
11. Allen R.T., Hunter W.J., AgrawalD.K. Morphological and Biochemical Characterization and Analysis of Apoptosis // Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. — 1997. — Vol. 37, №4. — P. 215-228.
12. Khaled W.T., Read E.K.C., Nicholson S.E., et al. The IL-4/IL-13/Stat6 signalling pathway promotes luminal mammary epithelial cell development // Development. — 2007. — Vol. 134 (15). — P. 2739-2750.
13. Lucey D.R., Clerici M., Shearer G.M. Type 1 and type 2 cytokine dysregulation in human infectious, neoplastic, and inflammatory diseases // Clinical Microbiology Reviews. — 1996. — Vol. 9 (4). — P. 532-562.
14. Nasta F., Ubaldi V., Pace L., Doria G., et al. Cytotoxic T-lymphocyte antigene-4 inhibits GATA-3 but not T-bet mRNA expression during Th cell differentiation // Immunology. — 2006. — Vol. 117. — P. 358-367.
15. Rudnicka K., Wlodarczyk M., Moran A.P., et al. Helicobacter pylori antigens as potential modulators of lymphocytes cytotoxic activity // Microbiology and Immunology. — 2012. — Vol. 56 (1). — P. 62-75.
16. Sewald X., Jimenez-Soto L., Haas R. PKC-dependent endocytosis of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin in primary T lymphocytes // Cell Microbiology. — 2011. — Vol. 13 (3). — P. 482-496.
Информация об авторах: Агеева Елизавета Сергеевна — к.м.н., заведующий кафедрой,
655004, Республика Хакасия, г. Абакан, ул. Пушкина, 178, тел.: (3902) 342720, e-mail:[email protected]; Саранчина Юлия Владимировна — аспирант кафедры, e-mail: [email protected]; Иптышев Виктор Михайлович — заведующий лабораторией,
655017, Республика Хакасия, г. Абакан, ул. Ленина, 23, тел. (3902)22-42-06, 25-76-77, e-mail: iptysheVictor@mail; Штыгашева Ольга Владимировна — д.м.н., профессор, ректор, заведующий кафедрой, 655017, Республика Хакасия, г. Абакан, пр. Ленина, 90, тел. (3902) 243018; факс: 243573, e-mail: [email protected]
