CC BY
53
Лекипп
© ШЕВЧЕНКО Е.В. - 1998 УДК 577.125
РОЛЬ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ЯВЛЕНИЙ В БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ
ЕВ. Шевченко
(Иркутский государственный медицинский университет, ректор - акад. МТА и АН ВШ А.А. Майбо-рода, кафедра медицинской и биологической физики, зав. - проф. Е.В. Шевченко)
Резюме. Показана связь исследованных автором трансмембранных пор, появляющихся в бислойных липидных мембранах в области фазового перехода жидкий кристалл - гель, с некоторыми направлениями современной науки и техники: явлениями возбудимости и терморегуляции, термоадаптации и биотехнологии, криобиологии, анестезиологии и липосо-мальной терапии.
Жизнь клетки определяется непрерывным обменом химическими веществами с окружающей средой. Главным диффузионным барьером на пути движения этих веществ является клеточная мембрана, построенная в основном из белков и липидов. Преодоление барьера обеспечивается специализированными транспортными системами мембран и наличием в них определенного количества сквозных каналов. Дополнительные транспортные системы могут появиться в мембране при введении некоторых пептидных антибиотиков, получивших название ионофоры и ка-налоформеры. Предполагается, что ионные каналы белковой природы обуславливают все электрические явления живого организма.
До начала наших исследований отсутствовали какие-либо данные о взаимосвязи электрических явлений и ионной проницаемости мембран в физиологических условиях с мембранными липидами, несмотря на то, что предположения о возможности такого механизма в литературе высказывались. Более того, в опытах с липосома-ми было обнаружено увеличение проницаемости для ионов № при фазовом переходе липида [9]. Однако в опытах с липосомами трансмембранные каналы не могут быть обнаружены.
Основываясь на результатах собственных опытов с модельными липидными мембранами [1], мы предположили, что электрические явления в мембранах и ионная проницаемость мембран могуг быть обусловлены конформационны-ми превращениями липидов без участия белков и пептидов. Наиболее известный способ конфор-мационных превращений липидов в мембране связан с фазовыми переходами из жидкокристаллического состояния (ЖКС) в гель и обратно. Такого рода фазовые переходы широко представлены в биологических мембранах.
В последующих исследованиях мы впервые экспериментально обнаружили появление трансмембранных пор при фазовом переходе липидов из ЖКС в гель и обратно, достигаемых изменением температуры. Принципиально важным является обнаружение ионных каналов при фазо-вом переходе мембран из фосфатидной кислоты, индуцированном изменением pH, а также изменением концентрации двухвалентных ионов, в первую очередь ионами кальция. Отсюда следует, что электрическая активность мембран может быть вызвана не только термотропным плавлением липидов, но и структурными изменениями в полярной части, когда формирование меж-молекулярных водородных связей или кальциевых мостиков сопровождается хемотропным фазовым переходом. Было обнаружено, что во всех случаях каналы обладали катион-анионной селективностью, определяемой зарядом полярной группы молекул фосфолипида. Проведенные нами измерения электрической емкости подтверждают транс-гош конформационный переход липидов.
Полученные результаты имеют важное значение для ряда направлений современной науки и техники.
В области биологии:
а) Концепция о химической и биологической
эволюции.
А.И. Опарин в своей теории возникновения жизни на Земле особое значение придавал выделению из вод первичного океана крупных надмолекулярных комплексов(коацерватов). Наиболее простым коацерватом является замкнутая везикула из липидного материала, отделенная от окружающей среды бислойной липидной мембраной. До настоящего времени считалось, что такие существенные функции первичной клетки, как регуляция проницаемости и катион-анионной
селективности, появились лишь после образования белка. Наши опыты позволяют утверждать, что начальный этап эволюции живой материи может быть связан и с липидами, а именно с липидными везикулами, способными регулировать проницаемость и катион-анионную селективность в результате образования сквозных пор (каналов). По-видимому, в ходе дальнейшей эволюции эту функцию взяли на себя белки.
б) Явление возбудимости.
Создание искусственной бислойной липидной мембраны Мюллером и соавт. [8] было связано с надеждой получить простую и адекватную модель возбудимой клеточной мембраны, на которой можно было бы исследовать молекулярные основы возбудимости. Эта цель не была достигнута. Некоторые свойства возбудимости были обнаружены лишь в БАМ, модифицированной белками и нуклеиновыми кислотами. Впервые в наших опытах было показано, что немодифици-рованные бислои в условиях фазового перехода демонстрируют электрические свойства, сходные с первичными процессами в возбудимых мембранах. В частности, в современной электрофизиологии важную задачу представляет расшифровка молекулярного источника емкостного тока, регистрируемого в возбудимой мембране в виде воротного тока. При этом было установлено, что в роли воротной частицы могут выступать ионы кальция. Известно также, что воротный ток предшествует появлению ионного тока, протекающего через трансмембранные возбудимые каналы. Существующие теории возбудимости не дают исчерпывающего объяснения наблюдаемых фактов.
В рамках полученных нами данных последовательность событий при возбуждении отслеживается довольно четко, рели предположить, что в основе возбудимости лежит хемотропный фазовый переход, индуцированный иенами кальция. При постоянной температуре и pH среды в бислоях из фосфатидной кислоты возникает электрический ток, обусловленный изменением проводимости в результате фазового перехода, индуцированного добавкой кальция. Такой переход сопровождается начальным емкостным током с последующим появлением одиночных ионных каналов.
Проведение электрического импульса по не-модифицированной липидной мембране было продемонстрировано недавно группой ученых [10, 11].
Эта концепция уже используется другими авторами при объяснении явления возбудимости постсинаптической мембраны [5].
в) Явление терморецепции.
Организм теплокровных животных и человека содержит термочувствительные элементы -терморецепторы, расположенные в наружных покровах тела. Терморегулятор, как и другие рецепторы, представляет собой специализированную клетку, окруженную полупроницаемой мембраной. Известно, что постоянным значениям
температуры соответствует постоянное значение частоты электрических импульсов, генерируемых термочувствительной мембраной. При изменении температуры частота импульсов .резко изменяется. Известно также, что частота нервных импульсов в рецепторных клетках является линейной функцией мембранного электрического сопротивления.
Еще в 60-х годах известный мембранологЛуз-затти [6] писал: «Очень хотелось бы подумать о возможных биологических функциях перехода липидов из жидкокристаллического состояния в коагель. Можно было бы допустить, что температура плавления углеводородных цепочек липидной части той или иной клеточной мембраны совпадает с температурой тела. Тогда переход от жидкокристаллического состояния липида к ко-агельному вызывал бы резкие изменения проницаемости и, таким образом, мог бы обеспечить обратную связь в механизмах терморегуляции».
Полученные нами результаты позволяют по-новому представить молекулярный механизм терморегуляции. Во-первых, этот механизм связан с липидами, а не белками, поскольку не известны белковые системы, претерпевающие обратимые конформационные превращения в зависимости от температуры в физиологическом диапазоне - 309-315К. В то же время температура фазовых переходов мембранных фосфолипидов находится в диапазоне температур от 333 (дисте-ароилфосфатидилхолин) до 251К (диолеилфосфа-тидилхолин), т.е. перекрывает весь диапазон температур, совместимых с жизнью, причем фазовый переход одного из наиболее распространенных фосфолипидов - дипальмитоилфосфатидил-холина происходит при 314К. Путем сочетания жирнокислотных радикалов в молекулах фосфо липидов, а также других факторов, могут быть достигнуты любые температуры фазовых пре вращений в указанном диапазоне. Во-вторых, в рамках развиваемых представлений можно дать полную картину терморецепции. Фазовые превращения фосфолипидов, вызванные температурой, сопровождаются резким изменением электрического сопротивления мембраны в результате появления сквозных пор. В соответствии с общим механизмом рецепции это приведет к резкому изменению частоты импульсов, идущих от терморецепторной мембраны, и мозг получит соответствующую информацию об изменении температуры тела [33].
г) Термоадаптация животного организма.
Известно, что один из видов термоадаптации -так называемое явление нетонического термогенеза - связано с нарушением проницаемости мембран митохондрий. Общепринято, что вызываемое холодом разобщение окислительного фосфо-рилирования в митохондриях термоадаптированных животных опосредовано свободными жирными кислотами, выполняющими роль протоно-форов. В последнее время обнаружилось, что свободные жирные кислоты не обладают свойствами протонофоров. Таким образом, существую-
щие теории молекулярного механизма нетонического термогенеза плохо согласуются с экспериментальными данными.
Наши данные позволяют существенным образом изменить представления о молекулярном механизме нетонического термогенеза, трактуя его как разобщение окислительного фосфорили-рования в митохондриях адаптированных животных, вызванйое нарушением проницаемости внутренней мембраны митохондрий в результате появления сквозных пор при фазовом переходе липидов, вызванное изменением температуры. Этот механизм наиболее важен для животных, впадающих в спячку. Такая трактовка представляется вполне совместимой с существующими экспериментальными данными [7].
д) Биотехнология.
Использование микроорганизмов для получения пищевого белка, пептидов, различных лекарственных веществ сопряжено с необходимостью регуляции проницаемости клеточных мембран. Во многих случаях скорость биосинтеза веществ в клетке значительно превышает скорость выдачи веществ из клетки в окружающий раствор. В этом случае для получения продукта клетки разрушают. Поэтому для получения особо чистых препаратов для медицинских нужд необходимо проводить многократную экстракцию и очистку препарата от сопутствующих веществ, появляющихся в результате разрушения клетки-продуцента.
В совместных исследованиях с ВНИИ «Биотехника» было предложено изменить тепловой режим ферментов с тем, чтобы на заключительной стадии синтеза продуктов провести клетки-продуценты через точку фазового перехода мембранных липидов. При этом предполагается, что появление трансмембранных пор в мембране клетки-продуцента будет способствовать дополнительному выходу продукта в водную среду без разрушения клеток.
Кроме того, клетки можно было бы использовать для продолжения синтеза. По сути дела предполагается производить «доение» клеток-проду-центов за счет изменения теплового режима в ферменте. Второе предложение сводилось к тому, чтобы как можно чаще использовать для получения продукта клетки-термофилы. Эти клетки будут сочетать высокую скорость синтеза продукта с высокой скоростью выведения его, поскольку температура фазового перехода мембранных липидов находится в области положительных температур.
В области медицины:
а) Криобиология.
До настоящего времени нет приемлемых объяснений молекулярных механизмов действия низких температур на живые объекты, а также защитного действия веществ-протекторов. Между тем при широком применении криометодов в биологии, медицине и сельском хозяйстве при замораживании эритроцитов и сперматозоидов, целых органов и тканей, при проведении хирур-
гических операций при гипотермии тела имеется насущная потребность в объяснении этих эффектов.
Установлено, что основную опасность для клеток и тканей при замораживании-оттаивании представляет осмотический дисбаланс, наступающий при вымораживании воды и концентрации солей. При этом возрастание проницаемости клеточных мембран для ионов и воды по мере снижения температуры играет наиболее важную роль. Столь же высокой должна быть проницаемость мембран для веществ-протекторов, в частности глицерина. Следует подчеркнуть, что явление замораживания-оттаивания полностью обратимо.
Наши данные позволяют объединить этот разнородный экспериментальный материал в рамках единой концепции. Во-первых, можно утверждать, что изменение проницаемости клеточных мембран для ионов и воды в ходе замораживания-оттаивания связано с липидами, а не белками мембран. В настоящее время не известна ни одна белковая транспортная система, которая увеличивала бы перенос ионов и воды с понижением температуры. Наоборот, скорость переноса веществ транспортными мембранными белками с понижением температуры снижается. Только фазовые превращения мембранных липидов по мере замораживания могут объяснить возрастание проницаемости в результате появления сквозных пор, поскольку увеличение проницаемости может происходить уже при температуре 251 К,.соответствующей температуре фазового перехода диолеиллецитина. Кроме того, ни одна из существующих теорий не в состоянии объяснить факт полной обратимости эффекта замораживания-оттаивания. В рамках нашей концепции это легко объясняется тем, что появление ионных каналов при фазовых превращениях мембранных липидов полностью обратимо.
б) Анестезиология и общая реаниматология.
В настоящее время в анестезиологии и общей реаниматологии широко применяется холод. Известно, что субнулевые температуры вызывают обратимый блок проведения нервного импульса. До настоящего времени считалась общепринятой точка зрения, что блокирование проводимости связано с термоинактивацией возбудимых каналов, образованных мембранными белками. В рамках настоящих представлений предлагается альтернативный механизм, связанный с шунтированием мембранного потенциала возбудимой мембраны за счет резкого увеличения ионной проницаемости мембран при охлаждении в результате фазового перехода мембранных липидов.
в) Липосомная теория.
В медицине начинает применяться новый способ направленного введения лекарственных веществ с помощью липосом. Для точного адресования липосом с лекарствами обычно используются липосомы с иммунным «адресом», приготовление которого технически сложно и до настоящего времени не вышло за рамки эксперимен-
та. Недавно был предложен новый способ освобождения липосом от содержащихся в них лекарства с помощью локального нагрева органа с помощью тока ультравысокой частоты. Приемлемого объяснения молекулярного механизма этого явления нет. Наши данные позволяют легко объяснить наблюдаемый эффект и значительно расширить применимость эффекта в целяхлипо-сомной терапии, подбирая для приготовления липосом фосфолипиды с различными температурами фазового перехода и производя не только нагрев, но и охлаждение органа. Объяснение эффекта заключается в том, что при локальном изменении температуры происходит фазовое превращение фосфолипидов в мембране липосом, появление сквозных пор и выход содержимого в раствор в непосредственной близости от клеток-мишеней [2, 4].
Литература
1. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембр’аны при фазовых превращениях.-М.: Наука, 1992,- 136 с.
2. Антонов В.Ф., Шевченко Е.В. Термоуправляемые липосомы: перспективы использования// Фармация,- 1993,- №4,- С. 32-34.
3. Шевченко Е.В., Смирнова Е.Ю., Антонов В.Ф. Бислойные липидные мембраны как сенсоры температуры, двухвалентных ионов и электрического поля// Сенсорные системы,- 1992.-Т. 6, №4.-С. ЮЗ-106.
4. Шевченко Е.В., Смирнова Е.Ю., Какушкина М.Л. и др. Фазовый переход липидов как способ регулирования проницаемости липосом// Фармация.-1993,-№3,-С. 7-13.
5. Kaufmann К., Silman I. The induction by protons of ion channels through lipid bilayer membranes// Biophys. Chem.- 1983,- Vol. 18,- P. 89-99.
6. Luzzati U. X-ray diffraction studies of lipid - water systems// Biological membranes. Physical fact and function/ Ed.D.Chapman.- N.-Y. J. Acad. Press, 1968.-P. 71-123.
Таким обраьим, эффект появления сквозных пор при фазовых переходах мембранных липидов, запускаемых изменением температуры, кислотности среды, электрического напряжения или концентрации двухвалентных ионов позволяет дать новое объяснение многим фактам из биологии и медицины.
THE ROLE OF ELECTRIC EFFECT IN BILAYER LIPID MEMBRANES
E.U. Sheuchenko (Irkutsk State Medical University)
The role of transmembrane pores appear during the gel-liquid crystalline state phase transition in the bilayer lipid membranes is shown. The dates about pores may be use for a consideration the problems of thermoreceptions, thermoadaptation, biotechnology, frozen-biology, liposom's theory etc.
7. MelchiorD.L., BruggemaE.P., SteinJ.H. Physical state of quite- frozen membrane and lipids// Biochim. Biophys. Acta.- 1982,-Vol. 690, № l.-P. 81-88.
8. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott H.C. Reconstruction of cell membranes structure in vitro and its transformation into an exitable system// Nature.-1962,- Vol. 194,- P. 979-980.
9. Papahadjopoulos D. Effect of bivalent cations and proteins of termotropic properties of phospholipid membranes//J. Colloid. Interface Sci.- 1977,-Vol. 58.- P. 459-470.
10. Prats M., Tocanne J.F., TeissieJ. Lateral proton conduction along a lipid - water interface'layer: a molecular mechanism for the role of hidration water molecules/ / Biochimie.- 1989.- Vol. 71.- P. 33-36.’
11. Tocanne J.F., Teisie J. Ionization of phospholipids and phospholipidsupported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems// Biochim. Biophys. Acta.- 1990,-Vol. 1031,-P. N 1-142.
