CC BY
47
УДК 611.65/67
РОЛЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ МАТЕРИ Р-ГАЛАКТОЗАМИНОМ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СТАНОВЛЕНИЕ ЯИЧНИКОВ ПОТОМСТВА В РАЗЛИЧНЫЕ СРОКИ ПОСТНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
И.В. Зубарев, Г.В. Брюхин ЧелГМА, г. Челябинск
Проведено исследование влияния экспериментального поражения ге-патобилиарной системы матери различного генеза на морфофункциональное становление яичников потомства. Результаты исследования позволяют констатировать, что у потомства от самок крыс с патологией гепатобилиар-ной системы имеет место нарушение морфофункционального становления яичников.
Ключевые слова: яичники, фолликулогенез, патология гепатобилиарной системы.
Актуальность. Актуальность настоящего исследования определяется важной ролью материнского организма в решении проблемы воспроизводства полноценного потомства, снижении перинатальной заболеваемости и смертности, которые на сегодняшний день в России остаются достаточно высокими.
Согласно современным представлениям, одной из важнейших причин нарушения внутриутробного развития являются экстрагенитальные заболевания женщины, особое место среди которых занимает патология гепатобилиарной системы. Согласно клиническим наблюдениям и экспериментальным исследованиям, у женщин с патологией гепатобилиарной системы рождается физиологически незрелое потомство с нарушением структурно-функционального становления систем жизнеобеспечения [1,7].
За последние годы появилось множество новых данных о факторах, влияющих на становление эндокринной и генеративной функций яичников. Становление данных функций определяется активностью и корректной работой генов, вовлечённых в процессы фолликулогенеза, формирования пула фолликулов, выбора доминантного фолликула, овуляции и формирования жёлтого тела. Многочисленными исследованиями была показана их решающая роль в нормальном развитии и функционировании женской репродуктивной системы. Так, например, мутации таких генов как Бтагса4, ЯЬр), ОппиЗа приводят к эмбриональной смерти, в то время как мутация гена Р1§а вызывает бесплодие. Кроме того мутации других генов могут несущественно влиять на организм плода, вызывая лишь нарушение процесса фолликулогенеза [5, 8, 10, 13].
Вместе с тем, роль патологии печени матери в нарушении генеративной и эндокринной функций яичников потомства до конца на установлена.
В связи с этим, целью настоящего исследования явился анализ особенностей морфофункционального становления яичников потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза.
Материалы и методы. Работа выполнена на белых лабораторных крысах «Вистар» - самках на 15, 30, 45 и 60-й день постнатального развития. Сроки исследования обусловлены общепризнанным подразделением возрастных периодов данной группы животных [4] подсосный период (6-21-й день), период полового созревания (22-50-й дни) и период половой зрелости (после 60-го дня).
В качестве веществ, модулирующих поражение печени, нами использовался токсин В-галак-тозамин. Хроническое поражение печени у самок крыс верифицировали с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов. Согласно данным литературы [2], развивающиеся при этом морфофункциональные изменения соответствуют таковым при гепатите В. Всего использовано 64 крысы (по 32 крысы в каждой группе). Для гистологического исследования и оценки фолликулогенеза яичники препарировались и подвергались взвешиванию. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, железным гематоксилином по Гейденгайну, галлоцианином по Эйнерсону [9].
Прежде всего, производилось измерение весовых характеристик, морфофункциональный анализ процесса фолликулогенеза.
При оценке фолликулогенеза использована наиболее распространённая классификация фол-
ликулов по Pedersen, Peters [12], позволяющая проводить тщательный анализ фолликулогенеза. Согласно данной классификации, можно выделить несколько типов фолликулов: малые, средние и большие фолликулы. Данная классификация основывается на двух морфометрических показателях -размерах фолликулов и численности фолликулярных эпителиальных клеток на максимальном сечении фолликула. Группа больших фолликулов объединяет как бесполостные (56 тип), так и полостные (начиная с 6-го типа) фолликулы. Полученные результаты обработаны статистически с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты исследований и их обсуждение. Анализ весовых характеристик экспериментальных животных позволил выявить следующую закономерность. У интактных животных в пост-натальном периоде происходит постепенное уве-
ного периода, после чего отмечается некоторое увеличение исследуемого показателя. Так, если у интактных животных в подсосный период, исследуемый показатель составил 0,080 ± 0,0054 %, то к 60-му дню он существенно снизился и составил
0,034 ± 0,0021 %. У животных опытной группы весовой индекс исследуемого органа к началу периода полового созревания практически не изменяется, а затем снижается и достигает минимального значения в период половой зрелости (рис. 1).
При этом обращает на себя внимание то, что в период завершения полового созревания и в период половой зрелости исследуемый показатель у подопытных крысят несколько превышает таковой в контроле, что обусловлено, на наш взгляд, увеличением массы органа.
Таким образом, анализ результатов данной серии исследований позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с хроническим экспери-
-♦— Контроль
D-галактозами н
15 дней
30 дней
45 дней
60 дней
Рис. 1. Весовой индекс экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития: * - результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05)
личение массы яичника. Так у 15-дневных интактных крысят абсолютная масса яичника составляет 11,75 ± 1,36 мг, в то время как в период половой зрелости (60 дней) этот показатель достигает максимальной величины 45,50 ± 3,03 мг.
У подопытных животных в постнатальный период также отмечается постепенное увеличение массы яичников с 7,20 ± 0,93 мг в подсосный период, до 54,18 ± 2,61 мг в период половой зрелости соответственно.
При этом обращает на себя внимание то, что на ранних сроках постнатального развития абсолютная масса яичников у подопытных крысят снижена по сравнению с контролем. В то же время к периоду половой зрелости отмечается увеличение абсолютной массы яичников до уровня, превышающего таковой в контроле.
Наиболее важным показателем морфофункционального состояния органа является его весовой индекс, который представляет собой отношение массы органа к массе тела. Динамика изменения весового индекса яичника экспериментальных животных отражена на рис. 1. Как видно из рис. 1, у интактных крысят весовой индекс яичника после рождения постепенно уменьшается и достигает минимального значения на 45-й день постнаталь-
ментальным поражением печени имеет место изменение относительной и абсолютной массы яичников.
В следующей серии настоящего исследования нами производился анализ морфологических особенностей яичников экспериментальных животных, а также оценён характер фолликулогенеза в них.
Анализ площадей коркового и мозгового вещества яичников позволил выявить следующую закономерность. Нами показано увеличение после рождения площади коркового и мозгового вещества (рис. 2). Как видно из рис. 2а, на ранних сроках исследования весовой индекс яичников крысят подопытной группы снижен по сравнению с таковыми в контроле, а на более поздних, - наоборот, несколько повышен. При этом обращает на себя внимание факт, что на 30-й день у подопытных крысят несколько увеличено мозговое вещество, а на 45-й день снижена площадь коркового вещества по отношению к контролю.
Важным критерием, позволяющим показать уровень развития коркового и мозгового вещества, является коэффициент, отражающий отношение площади коркового вещества к мозговому веществу (рис. 3).
ВКонтроль КВ В Контроль МВ
□ О-галактозамин КВ
□ О-галактозамин МВ
Рис. 2. Площади коркового и мозгового вещества экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (р < 0,05)
15,00п
12,00
9.00
6.00 3,00
0,00
15 дней
30 дней
45 дней
60 дней
ВКонтроль □ О-галактозамин
Рис. 3. Динамика изменения коэффициента, отражающего отношение коркового вещества к мозговому веществу экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (р < 0,05)
1200,00
900.00
600.00 300,00
0,00
15 дней 30 дней 45 дней 60 дней
В Контроль О О-галактозамин
Рис. 4. Суммарное содержание фолликулов яичников экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития
Как видно из рисунка, у интактных крыс к периоду полового созревания исследуемый показатель несколько снижается, а к концу данного периода существенно увеличивается до максимального значения. В период половой зрелости исследуемый коэффициент вновь заметно снижается. Аналогичная закономерность выявлена и у крысят обеих опытных групп. Обращает на себя внимание, что в период полового созревания на 30-й и 45-й дни коэффициент, отражающий отношение коркового и мозгового вещества яичников у подопытных крысят снижен по сравнению с контролем, что свидетельствует об уменьшении массы коркового вещества, ответственного за осуществление генеративной и эндокринной функции женских половых желёз.
Одним из важнейших показателей структур-но-функциональной зрелости яичника является общее количество фолликулов и их популяционный состав [3]. Исследование суммарного содержания фолликулов в единице условной площади (103 мкм2) яичников позволило выявить следующую закономерность (рис. 4). У подопытных животных суммарное содержание фолликулов яичников подопытных крысят в единице условной площади на большинстве сроков исследования снижено по сравнению с контролем.
Как известно, у грызунов становление пула примордиальных фолликулов происходит в пост-натальный период. Исследованиями С..!. Зо^ег и соавт. [6] было показано, что мутация гена Ре! приводит к уменьшению содержания фолликулов
500,00
250,00
0,00
* ъ
...ЛІ' * гП ,
1 2-За 36 4 5а 56 6 7-8
В Контроль □ Р-галактозамин
Рис. 5. Популяционный состав фолликулов яичников 15-дневных экспериментальных животных:* - результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05)
ВКонтроль □ 0-галактозамин
Рис. 6. Популяционный состав фолликулов яичников 30-дневных экспериментальных животных: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (р < 0,05)
В Контроль □ Р-галактозамин
Рис. 7. Популяционный состав фолликулов яичников 45-дневных экспериментальных животных: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (р < 0,05)
в яичнике. Можно предположить, что уменьшение у подопытных животных суммарного содержания фолликулов в единице условной площади яичника может быть обусловлено именно мутацией гена Рз1:.
Наибольший интерес представляют данные популяционного состава фолликулов яичников экспериментальных животных. Анализ популяционного состава фолликулов позволил выявить следующую закономерность (рис. 5-8). Как видно из рисунков, у интактных крысят на 15-й день в яичниках преобладают фолликулы с 1 по 4 типы. У подопытных животных в яичниках также преобладали незрелые фолликулы (1-5а типы).
Обращает на себя внимание снижение содержания фолликулов 1-го типа у крысят подопытной
группы. Изменение количества малых фолликулов отражает, на наш взгляд, нарушение становления пула примордиальных фолликулов.
На 30-й и 45-й дни в яичниках интактных животных также преобладают фолликулы с 1 по 5а типы, в то же время количество более зрелых фолликулов (56-8 типов) снижено. У подопытных животных, в яичниках также преобладали незрелые фолликулы (1-5а типы). При этом обращает на себя внимание, что содержание малых и средних фолликулов снижено, а содержание больших фолликулов у них повышено.
На 60-й день у подопытных животных наблюдается снижение малых и средних фолликулов на фоне незначительного повышения содержания больших фолликулов.
■ Контроль □ О-галактозамин
Рис. 8. Популяционный состав фолликулов яичников 60-дневных экспериментальных животных: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (р < 0,05)
30
20
10
0 ------------------1----------------1----------------г—1-------------1
15 день 30 день 45 день 60 день
В Контроль □ О-галактозамин
Рис. 9. Содержание атретических фолликулов яичников экспериментальных животных
- Контроль О-галактозамин
Рис. 10. Количество жёлтых тел яичников экспериментальных животных
К45
ГВ45
К60
ГВ60
11 Площадь ЖТ
Рис. 11. Площадь жёлтых тел яичников экспериментальных животных (в 1 мм2)
Таким образом, анализ результатов данной серии исследований позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени на большинстве сроков исследования имеет место снижение со-
держания малых и средних фолликулов. В то же время содержание больших фолликулов оказалось повышенным. Результаты анализа субпопуляци-онного состава фолликулов яичников, позволяют предположить, что нарушение условий внутриут-
робного развития при хроническом поражении печени обусловливает преждевременную активацию пула примордиальных фолликулов и ускоренное созревание большого количества фолликулов. Полученные данные согласуются с данными литературы. Так, исследованиями P. Reddy и соавт. [11] было показано, что мутация гена Pten вызывает преждевременную активацию пула примордиальных фолликулов, а исследованиями S.A. Williams и соавт. [14] было показано, что мутация гена Cigaltl вызывает ускоренное созревание и овуляцию большого количества фолликулов. На основе результатов этих авторов, возможно предположить, что наблюдаемая нами закономерность может быть связана с нарушением экспрессии этих генов.
Одним из показателей интенсивности фолли-кулогенеза в яичниках экспериментальных животных является содержание атретических фолликулов (рис. 9). Установлено, что у подопытных крысят число атретических фолликулов в яичнике изменено относительно контроля. У интактных крысят число атретических фолликулов в яичнике после рождения постепенно увеличивается и достигает максимального значения к концу периода полового созревания, после чего к периоду половой зрелости исследуемый показатель несколько снижается. Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных крысят. У подопытных животных в период полового созревания (30-й и 45-й дни) выявлено повышение числа атретических фолликулов, что может быть связанно с чрезмерной активацией процесса фолликулогенеза.
Одним из показателей полноценного процесса фолликулогенеза является число жёлтых тел. Нами установлено (рис. 10), что содержание жёлтых тел в яичниках у подопытных животных на 45-й день равно таковому в контроле, а на 60-й день оказалось достоверно выше по сравнению с контролем. Так в единице условной площади яичника интактных крысят содержание жёлтых тел составило 1,86 ± 0,13, в то время как у подопытных животных данный показатель оказался сниженным и составил соответственно 1,23 ± 0,04. К 60-му дню в условной единице площади яичника интактных крысят содержание жёлтых тел составило 9,61 ± ± 0,92, в то время как у подопытных животных, данный показатель оказался сниженным и составил соответственно 15,43 ± 1,80. Однако нами было показано, что площадь жёлтых тел у подопытных животных достоверно снижена на всех сроках исследования (рис. 11).
Таким образом, анализ результатов данной серии исследований позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени имеет место увеличение числа атретических фолликулов и увеличение количества жёлтых тел яичников экспериментальных животных.
Заключение. Таким образом, результаты исследования позволяют констатировать, что у по-
томства от самок крыс с патологией гепатобилиар-ной системы имеет место нарушение морфофункционального становления генеративной функции яичников.
Литература
1. Брюхин, Г.В. Особенности становления фолликулогенеза в яичниках у потомства матерей с хроническим поражением гепатобилиарной системы в условиях эксперимента /Г.В. Брюхин, Е.В. Вто-ругиина // Проблемы репродукции. — 2004. — № 3. -С. 54-57.
2. Венгеровский, A.C. Метаболизм липидов и функционального состояния печени при интоксикации D-галактозамином у крыс / A.C. Венгеровский // Патол. физиол. и эксперим. терапия. — 1988. -№ 3. - С. 52-54.
3. Волкова, О.В. Морфогенетические основы развития и функции яичников / О.В. Волкова, Т.Г. Боровая. - М., 1999 - 245 с.
4. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. За-паднюк, В.И. Западнюк, И.А. Захария, Б.В. Запад-нюк. - Киев: Вища школа, 1983. - С. 1-383.
5. Essential role for de novo DNA methyltrans-ferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting / M. Kaneda, M. Okano, K. Hata et al. //Nature. — 2004 -№429. -P. 900-903.
6. Granulosa cell-specific inactivation of follies-tatin causes female fertility defects / C.J. Jorgez, M. Klysik, S.P. Jamin et al. //Mol Endocrinol. —2004 -№ 18. - P. 953-967.
7. Hay, J. Eileen. Liver Disease in Pregnancy / J. Hay// J. Hepatology. - March 2008. — P. 1067—1076.
8. Infertility in female mice with an oocyte-specific knockout of GPIanchored proteins / J.A. Alfieri, A.D. Martin, J. Takeda et al. // J Cell Sei. — 2003. — №116.-P. 2149-2155.
9. Kiernan, J.A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice / J.A. Kiernan. —4ed.— Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008. - 606 p.
10. Maternal BRG1 regulates zygotic genome activation in the mouse / S.J. Bultman, T.C. Gebühr, H. Pan et al. // Genes Dev 2006. —№20. — P. 1744—1754.
11. Oocytespecific deletion of Pten causes premature activation of the primordial follicle pool / P. Reddy, L. Liu, D. Adhikari et al. // Science 2008. -V. 319.-P. 611-613.
12. Pedersen, T. Propousal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary / T. Pedersen, H. Peters//J. Reprod. Fert. -1968. -V. 17.-P. 555-557.
13. RBPJkappa-dependent notch signaling is dispensable for mouse early embryonic development / C. Souilhol, S. Cormier, K. Tanigaki et al. // Mol Cell Biol. - 2006. - У. 26. - P. 4769-4774.
14. Williams, S.A. Mouse fertility is enhanced by oocyte-specific loss of core 1-derived O-glycans / S.A. Williams, P. Stanley // FASEB J. -2008. -№22.-P. 2273-2284.
Поступила e редакцию 19 июня 2010 г.
