CC BY
48
УДК 616.8-091.81: 577.112.6: 612.357
И.В. Рудин
РОЛЬ ДЕЛЬТА-ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЖЕЛЧЕОТДЕЛИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет
В острых опытах на белых крысах изучено влияние периферического и центрального введения DADLE (агонист дельта-опиоидных рецепторов) на скорость секреции и состав секрети-руемой желчи при интактной и денервированной печени. Показано, что DADLE в значительной степени изменяет состав желчи при обоих способах введения, а также что эффекты периферической и центральной стимуляции опиоидных рецепторов DADLE на желчеотделение носят разнонаправленный характер. Наличие интактной иннервации печени является условием проявления эффекта центральной стимуляции опиоидных рецепторов DADLE на желчеотделение.
Ключевые слова: опиоидные пептиды, DADLE, налоксон, секреция желчи
Введение
Опиоидные пептиды — группа нейропептидов, являющаяся обширным и в последние годы активно изучаемым классом регуляторных пептидов. Участвуя в регуляции функций нервной, иммунной, сердечно-сосудистой, эндокринной, выделительной, дыхательной систем, являясь компонентом антиноцицептивной системы, опиоидные пептиды регулируют все виды обмена, функций и поведения. [3, 10, 12, 16, 22-27]. Широко представленные как в нервной системе, так и непосредственно в желудочно-кишечном тракте [14], опи-оидные пептиды также оказывают протективное действие на слизистую желудка [8], регулируют секреторную функцию поджелудочной железы [19], изменяют интенсивность метаболизма в печени [6] и оказывают гепатопротекторный эффект при острых повреждениях органа [15]. В настоящее время выделяют несколько типов опиатных рецепторов, в частности, мю-, дельта-, каппа- и ор-фаниновые рецепторы. Их распространение в различных органах и тканях и функциональная значимость активно изучаются [17, 26]. Показано, что эффекты опиоидных пептидов зависят не только от типа опиатных рецепторов, с которым они взаимодействуют, но и от локализации рецептора [5]. Ранее нами было продемонстрировано [9], что опиоидные пептиды, в частности даларгин, влияют на секрецию в желчь детерминант желчетока. Поскольку даларгин является неселективным агонистом как дельта-, так и мю-опиоидных рецепторов, нам представлялось необходимым выяснить роль дельта-опиоидных рецепторов в проявлении эффекта опиоидных пептидов на желчеотделительную функцию печени.
Методика
Эксперименты проводились в остром опыте на беспородных белых крысах-самцах массой 180-220 г, после 12-часового голодания в условиях свободного доступа к воде.
Под нембуталовым наркозом желчь для исследования собиралась путем канюлирования общего желчного протока. Сбор желчи осуществлялся с интервалом в 1 час в течение трех часов от начала эксперимента. В экспериментах с периферическим введением агонист дельта-опиоидных рецепторов DADLE и антагонист налоксон вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг и1 мг/кг соответственно.
В экспериментах с центральным введением DADLE использовали стереотаксический метод введения канюли с применением аппарата стерео-таксического собственной конструкции — аналога аппарата СЭЖ-5. Введение канюли из нержавеющей стали осуществляли в правый латеральный желудочек мозга по следующим координатам: от брегмы АР — 1,5 мм, L — +2 мм, V — 3,5 мм [21]. Верификация положения канюли осуществлялась введением раствора метиленовой сини. DADLE применяли в дозе 10 мкг на крысу, налоксон в дозе 200 мкг на крысу. Объем раствора составлял 8 мкл, при совместном применении препаратов объемы для введения оставляли по 4 мкл.
Лиганды опиоидных рецепторов вводились после выполнения всех хирургических манипуляций и канюлирования общего желчного протока. Сбор желчи для исследования начинали через 10 мин после введения лигандов.
Денервацию печени проводили путем аппликации раствора фенола на поверхность печеноч-
ных сосудов, общего желчного протока и печеночных связок [18]. DADLE и налоксон вводили через 30 минут после аппликации фенола.
Группам контрольных животных вводили подогретый до 37 °С физиологический раствор натрия хлорида в соответствующих количествах.
Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществлялись в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Определяли количество секретированной желчи в каждом временном промежутке, а также содержание в желчи желчных кислот и холесте-рола [7], билирубина [1], фосфолипидов по липидному фосфору [2, 4].
Результаты исследований обрабатывались с расчетом критерия Манна-Уитни, различия считались достоверными при p<0.05 Результаты исследования В группе контрольных животных отмечается повышение скорости желчетока от 1 к 3 ч эксперимента на 36% (p<0,05). Периферическое введение DADLE приводило к высокодостоверному повышению скорости желчетока по отношению к контролю на протяжении трех часов эксперимента на 33.3% (p< 0,001), 28.2% (p<0,005), 36,8% (p<0,001), в 1, 2 и 3 ч исследования соответственно (Рис. 1). Периферическое введение DADLE на
Время исследования, ч
фоне налоксона не вызывало изменений в скорости желчетока в течение первого часа исследования, однако к 2 и 3 ч скорость желчетока была достоверно выше контрольных величин на 33% (p<0,005) и 42,1% (p<0,001) соответственно. Изолированное применение налоксона не приводило к изменениям скорости желчетока в течение трех часов от момента введения.
Секреция ЖК при периферическом введении DADLE достоверно повышена в течение 1 ч на 18,4% (p<0,05). Введение налоксона приводит к еще более выраженному увеличению секреции ЖК в течение 1 ч эксперимента на 53% (p<0,001), а также к 2 и 3 ч исследования (p<0,001). Приме-ненеие DADLE на фоне предварительного введения налоксона полностью устраняет эффект повышения секреции ЖК и величина становится к 1 ч достоверно ниже контроля (p<0,05).
Периферическое введение DADLE приводит к достоверному увеличению секреции холесте-рола на 44,3% (p<0,001), 37,5% (p<0,001), 84,7% (p<0,001) к 1, 2 и 3 ч исследования соответственно. Предварительное введение налоксона устраняет данный эффект DADLE только в течение первого часа эксперимента, к 2 и 3 ч величины секреции компонента равны величинам при изолированном применении DADLE (Рис. 2).
Секреция фосфолипидов под влиянием периферического введения DADLE увеличивается
Время исследования, ч
- I , С - II , С - III , ■ - IV , О - V, □ - VI, □ - VII, Ü - VIII
Рис. 1. Изменение скорости желчетока мл/100 г/ч у крыс под влиянием периферического и центрального введения DADLE
I — контроль периферическое введение, (физиологический раствор), II — контроль центральное введение (физиологический-раствор), III — DADLE периферическое введение, IV — DADLE + налоксон периферическое введение, V — налоксон периферическое введение, VI — DADLE центральное введение, VII — DADLE + налоксон центральное введение, VIII — налоксон центральное введение (n=15 во всех группах); ** — различия достоверны по отношению к соответствующему часу контроля, **4 — p<0,005, **5 - p<0,001
-I, -II, -III, -IV
Рис. 2. Изменение секреции холестерола мкмоль/100 г/ч в желчь крыс под влиянием периферического введения DADLE
I — контроль, (физиологический раствор), II — DADLE, III — DADLE + налоксон, IV — налоксон;
(n=15 во всех группах); ** — различия достоверны по отношению к соответствующему часу контроля, **3 - p<0,02, **5 — p<0,001
к первому часу исследования на 35,5% (p<0,01). Введение DADLE на фоне налоксона не приводит к изменению секреции в желчь фосфолипидов к 1 ч исследования, но вызывает достоверное повышение к 2 и 3 ч на 28,7% (p<0,005) и 47% (p<0,001) соответственно. Изолированное применение налоксона достоверно не изменяло содержания фосфолипидов в желчи.
Секреция билирубина к 1 ч была недостоверно повышена, и к 2 ч исследования это повышение становилось достоверным на 17,28% (p<0,05), к 3 ч на 23,78% (p<0,05). Предварительное введение налоксона устраняло это повышение секреции под влиянием DADLE. Изолированное введение налоксона вызывало снижение секреции билирубина только к 3 ч эксперимента на 24,7% (p<0,05).
В контрольной группе с центральным введением физиологического раствора количество секретированной желчи повышалось от 1 к 3 часу эксперимента (p<0,001). Внутрижелудочковое введение DADLE снижало скорость желчетока в течение трех часов эксперимента к 1ч в 2 раза (p<0,001), к 2ч в 2,32 раза (p<0,001) и к 3 ч в 1,81 раза (p<0,001) (Рис. 1). Предварительное введение налоксона полностью устраняло этот эффект DADLE. Изолированное введение налоксона в
латеральный желудочек не вызывало изменений в скорости желчетока.
Секреция ЖК при внутрижелудочковом введении DADLE уменьшалась в 2,53 раза (p<0,001), 3,3 раза (p<0,001) и 2,85 раза (p<0,001) к 1, 2 и 3 ч исследования соответственно. Предварительное введение налоксона полностью устраняло эффект DADLE на секрецию ЖК в течение всего времени эксперимента. Изолированное введение на-локсона повышало секрецию ЖК в течение всего времени исследования на 37% (p<0,001), 26,68% (p<0,001) и 14,1% (p<0,05) к 1, 2 и 3 ч соответственно (Рис. 3).
Секреция холестерола при центральном введении DADLE претерпевала сходные изменения. Наблюдалось выраженное снижение секреции холестерола к — 1 ч в 3 раза (p<0,001), к 2 ч в 3,9 раза (p<0,001) и к 3 ч в 3,6 раза (p<0,001). Предварительное введение налоксона устраняло эти изменения. Изолированное введение налоксона приводило к увеличению секреции холестерола на протяжении всего эксперимента к 1 ч на 35% (p<0,001), к 2 ч на 25,8% (p<0,001), к 3 ч на 24,2% (p<0,001) (Рис. 4).
Секреция фосфолипидов под влиянием внут-рижелудочкового введения DADLE снижалась к 1 и 2 ч в 4 раза (p<0,001), к 3 ч в 3,5 раза (p<0,001).
1,5
1
яТ 0,5
Время исследования, ч
С - I , С - I
- IV , □ - V, □ - VI, □ - VII
Рис. 3. Изменение секреции желчнъх кислот мг/100г/ч у крыс под влиянием внутрижелудочко-вого введения DADLE и налоксона при интактной и денервированной печени.
I — контроль, (физиологическийраствор), II — контроль (физиологический-раствор + денервация), III — DADLE центральное введение, IV — DADLE центральное введение + налоксон, V — DADLE центральное введение + денервация, VI — налоксон центральное введение, VII — налоксон центральное введение + денервация; (n=15 во всех группах)
** — различия достоверны по отношению к соответс-
твующему часу контроля,
- р<0,05, **5 — р<0,001 * — различия достоверны по отношению к соответствующему часу без денервации, *1 - р<0,05,
*5 - р<0,001
g0,4
ц
0
1 0,3
2 га
!0,2
§
ц
о
х 0,1
к
S
CL
Ф 0
Время исследования, ч
С - I , Е - I
- IV , ш - V, □ - vi, □ - VII
Рис. 4. Изменение секреции холестерола мкмоль/ 100г/ч у крыс под влиянием внутрижелудочкового введения DADLE и налоксона при интактной и денервированной печени
I — контроль, (физиологическийраствор), II — контроль (физиологический-раствор + денервация), III — DADLE центральное введение, IV — DADLE центральное введение + налоксон, V — DADLE центральное введение + денервация, VI — налоксон центральное введение, VII — налоксон центральное введение + денервация; (n=15 во всех группах); ** — различия достоверны по отношению к соответствующему часу контроля, **5 — p<0,001, * — различия достоверны по отношению к соответствующему часу без денервации, *5 — p<0,001
2
2
0
Предварительное введение налоксона устраняло эти изменения в секреции фосфолипидов. Изолированное применение налоксона не приводило к достоверным изменениям содержания в желчи фосфолипидов.
Секреция билирубина при внутрижелудочко-вом введении DADLE уменьшалась в 2,48 раза (p<0,001), 2,78 раза (p<0,001) и 2 раза (p<0,001) к 1, 2 и 3 ч соответственно. Предварительное введение налоксона полностью устраняло эти изменения. Изолированное применение налоксона не изменяло секреции билирубина.
Денервация печени сама по себе не приводила к достоверным изменениям в скорости желчето-ка, а также концентрации и секреции компонентов желчи, однако к первому часу исследования полностью (p<0,001), а к 2 и 3ч частично устраняла проявление эффекта центрального введения DADLE на скорость желчетока. При этом значения величин в группе с денервацией имели достоверные отличия как от контроля — к 2 ч (p<0,02), к 3 ч (p<0,05) —, так и по отношению к значениям в группе с центральным введением DADLE без денервации печени — к 2ч (p<0,001), к 3ч (p<0,001). Денервация также достоверно уменьшала величины скорости желчетока при изолированном центральном введении налоксона к 2 и 3 ч (p<0,05).
Секреция ЖК при центральном введении DADLE на фоне денервации частично восстанавливалась и величины секреции были одновременно достоверно отличны как от контроля к 1 ч (p<0,05), 2 ч (p<0,01), к 3 ч (p<0,001), так и от значений в группе с центральным введением (p<0,001) на протяжении всего эксперимента (Рис. 3). Увеличение секреции ЖК, вызываемое на протяжении трех часов налоксоном, денервацией печени полностью устранялось.
Денервация также частично устраняла эффект DADLE на секрецию в желчь холестерола в течение всего времени эксперимента, при этом величины достоверно отличались как от контроля (p<0,001), так и от группы с введением DADLE без денервации (p<0,001). Повышение секреции в желчь холестерола, вызываемое налоксоном, полностью устранялось денервацией печени на протяжении всего времени эксперимента (Рис. 4).
Денервация печени значительно восстанавливала показатели секреции фосфолипидов, сниженные под влиянием центрального введения DADLE. Полученные величины в течение 1 и 2 ч эксперимента отличались достоверно как от контроля, так и от значений в группе с центральным введением DADLE. К третьему часу денервация полностью устраняла эффект DADLE на секрецию фосфолипидов (Рис. 5).
Центральный эффект DADLE на секрецию билирубина, так же, как и в случае с другими изученными показателями, частично устранялся денервацией печени, и величины секреции отличались как от контроля, так и от величин в группе с применением DADLE при сохранении интактной иннервации печени.
Обсуждение результатов Полученные данные позволяют предполагать, что дельта-опиоидные рецепторы играют значительную роль в проявлении регуляторных эффектов опиоидергической системы на желчеотделительную функцию печени. Как периферические, так и центральные дельта-опиоидные рецепторы оказывают влияние на скорость желчетока и состав секретируемой желчи.
В настоящей работе показано, что дельта-опи-оидные рецепторы могут регулировать секрецию детерминант желчетока: желчных кислот, желчных липидов — холестерола и фосфолипидов и пигментов — билирубина, что означает их способность опосредовать эффект эндогенных опиоид-ных пептидов на активность ферментных и транспортных систем гепатоцита.
Однонаправленность эффекта стимуляции периферических опиоидных рецепторов DADLE и блокады опиоидных рецепторов налоксоном
3
Время исследования, ч
С - I , с -
- IV , О - V, ■ - VI, □ - VII
Рис. 5. Изменение секреции лецитина мкмоль/100г/ ч у крыс под влиянием внутрижелудочкового введения DADLE и налоксона при интактной и денервированной печени
I — контроль, (физиологическийраствор), II — контроль (физиологический раствор + денервация), III — DADLE центральное введение, IV — DADLE центральное введение + налоксон, V — DADLE центральное введение + денервация, VI — налоксон центральное введение, VII — налоксон центральное введение + денервация; (n=15 во всех группах);
** — различия достоверны по отношению к соответс-
твующему часу контроля, **1 — p<0,05,
- p<0,001
* — различия достоверны по отношению к соответствующему часу без денервации, *5 — р<0,001
2
при его периферическом и центральном введении на повышение секреции в желчь желчных кислот и холестерола, по нашему мнению, может свидетельствовать о том, что секреция этих компонентов желчи находится под тоническим контролем центрального отдела опиоидергичес-кой регуляции (учитывая, что налоксона гидрохлорид, использованный в работе, легко проникает через гемато-энцефалический барьер при периферическом введении), который снижает секрецию в составе желчи отдельных ее компонентов.
Частичное устранение эффекта центральной стимуляции дельта-опиоидных рецепторов на скорость секреции и состав желчи при денервации печени, с одной стороны, свидетельствует о значимой роли центральной респираторной депрессии в механизмах развития эффекта, а с другой — о значимости сохранения интактной иннервации печени для проявления эффекта опиоидов при центральном их введении. По данным Bergasa N.V. [11], существуют нервные опио-идергические пути, которые могут опосредовать эффекты центрального введения опиоидов на желчеотделение. В нашей работе показано, что сохранение указанных путей является важным условием для проявления эффекта центральной стимуляции дельта-опиоидных рецепторов на скорость желчетока и состав секретируемой желчи. Разнонаправленность эффектов стимуляции центральных и периферических дельта-опиоидных рецепторов по отношению к жел-чеоотделительной функции печени, по нашему мнению, является подтверждением гипотезы об антагонистических взаимоотношениях периферических и центральных опиоидных рецепторов в реализации опиоидергической регуляции функций, выдвинутой по отношению к секреторной функции желудка [5]. По-видимому, этот механизм является общим для регуляции функций желудочно-кишечного тракта опиоидными пептидами.
DELTA OPIOID RECEPTORS AND THEIR ROLE IN REGULATION OF LIVER SECRETORY FUNCTION
I.V. Rudin
Influence of intraperitoneal and intracerebroventric-ular DADLE (delta-opioid agonist) on bile secretion and composition was studied in white rats with intact and denervated liver. DADLE was demonstrated to alter bile composition significantly both intraperito-neally and intracerebroventricularly and effects were opposite. Intact liver innervation is a condition for intracerebroventricular DADLE to have its effect on bile secretion.
Литература
1. Акинчиц М.А. Модификация метода определения билирубина в сыворотке крови / М.А. Акинчиц, Н.А. Павловская Н.А. // Лаб. дело. — 1988. — №12. — С. 727730.
2. Ганиткевич Я.В. Исследование желчи: биохимические и биофизические методы / Я.В. Ганиткевич, Я.И. Карбач. — Киев, 1985. — 174 c.
3. Мартынова Е.Р. Влияние опиоидных пептидов на регионарную гемодинамику у бодрствующих крыс / Е.Р. Мартынова, О.С. Медведев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1988. — Т. 106. — № 8. — С. 136-139.
4. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков. — М., 1987. — 325 с.
5. Место приложения (центральное или периферическое) противоязвенного действия синтетического аналога эндогенных опиоидов даларгина в экспериментальной модели цистеаминовых дуоденальных язв у крыс / В.М. Полонский, К.Н. Ярыгин, О.Г. Кривошеев и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1987.
— Т. 103. — №4. — С. 433-434.
6. Некоторые механизмы участия опиоидных пептидов в регуляции углеводного обмена / Г.К. Золоев, И.В. Боброва, Н.И. Хабарова, Н.А. Абиссова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1992. — Т. 113. — №3. — С. 257-259.
7. Определение содержания желчных кислот и холестерина в желчи / В.П. Мирошниченко, Л.Л. Грома-шевская, М.И. Касаткина, Г.А. Козачек // Лаб. дело.
— 1978. — №3. — С. 149-153.
8. Полонский В.М. Противоязвенное действие и периферическая опиоидная активность продуктов деградации даларгина / В.М. Полонский, Н.В. Коробов // Бюл. ВКНЦ АМН СССР. — 1986. — Т. 9. — №2. — С. 83-86.
9. Рудин И.В. Опиоидные пептиды модулируют секрецию основных детерминант желчетока / И.В. Рудин, М.А. Медведев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1997. — Т. 123. — №5. — С. 498-500.
10. Antinociceptive and nociceptive actions of opioids / M.H. Ossipov, J. Lai, T. King et al. // J. Neurobiol. — 2004. — Vol. 61. — №1. — P. 126-148.
11. Bergasa N.V. The opioid peptide analog D-Ala2-Met-enkephalinamide decreases bile flow by a central mechanism / N.V. Bergasa, J. Zhou, J. Ravi, Q. Shi // Peptides. — 1999. — Vol. 20. — №8. — P. 979-986.
12. Borlongan C.V. Delta opioid peptide (D-Ala 2, D-Leu 5) enkephalin: linking hibernation and neuroprotection / C.V. Borlongan, Y. Wang, T.P. Su // Front. Biosci.
— 2004. — № 9. — P. 3392-3398.
13. Central opiate mu-receptor-mediated suppression of tissue protein synthesis / Y. Hashiguchi, P.E. Molina, S. Dorton et al. // Am. J. Physiol. — 1997. — Vol. 273. — №3.
— Pt. 2. — P. R920-R927.
14. ChaturvediK. Opioid peptides, opioid receptors and mechanism of down regulation / K. Chaturvedi // Indian. J. Exp. Biol. — 2003. — Vol. 41. — №1. — P. 5-13.
15. [D-Ala2, D-Leu5] enkephalin (DADLE) protects liver against ischemia-reperfusion injury in the rat / K. Ya-manouchi, K. Yanaga, S. Okudaira et al. // J. Surg. Res.
— 2003. — Vol. — 114. — №1. — P. 72-77.
16. Endogenous opioid modulation of hypercapnic-stimulated respiration in the rat / K.R. Eager, B.J. Robinson, D.C. Galletly, J.H. Miller // Respir. Physiol. — 1994.
— Vol. 96. — №1. — P. 13-24.
17. Janecka A. Opioid receptors and their ligands / A. Janecka, J. Fichna, T. Janecki // Curr. Top. Med. Chem.
— 2004. — №1. — P. 1-17.
18. Lautt W.W. Evaluation of topical phenol as a means of producing autonomic denervation of the liver / W.W. Lautt, A.M. Carroll // Can. J Physiol. Pharmacol. — 1984.
— Vol. 62. — №7. — P. 849-853.
19. MEK inhibits secretin release and pancreatic secretion: roles of secretin-releasing peptide and somatostatin / James P. Li, Kae Yol Lee, Ta-Min Chang, William Y. Chey. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2001. — Vol. — 280. — № 5. — P. G890-G896.
20. Pasternak G.W. Review: pharmacological mechanisms of opioid analgesics / G.W. Pasternak // Clin. Neu-ropharmacol. — 1993. — Vol. 16. — P. 1-18.
21. Paxinos G. The rat brain in stereotaxic coordinates
/ G. Paxinos, C. Watson — N.Y., 1982.
22. Sacerdote P. Experimental evidence for immunomodulatory effects of opioids / P. Sacerdote, E. Limiroli, L. Gaspani // Adv. Exp. Med. — Biol. — 2003. — Vol. 521.
— P. 106-116.
23. Smith E.M. Opioid peptides in immune cells / E.M. Smith // Adv. Exp. Med. — Biol. — 2003. — Vol. 521. — P. 51-68.
24. Snyder S.H. Opiate receptors and beyond: 30 years of neural signaling research / S.H. Snyder // Neuropharmacology. — 2004. — Vol. 47. — Suppl. 1. — P. 274-285.
25. Stein C. Opioid receptors on peripheral sensory neurons / C. Stein // Adv. Exp. Med. Biol. — 2003. — Vol. 521. — P. 69-76.
26. von Zastrow M. Opioid receptor regulation / von M. Zastrow // Neuromolecular Med. — 2004. — Vol. 5. — №1.
— P. 51-58.
27. Wood J.D. Function of opioids in the enteric nervous system / J.D. Wood, J.J. Galligan // Neurogastroen-terol. Motil. — 2004. — Vol. 16. — №2. — P.17-28.
