CC BY
24
© Е.С.Завьялова, А.С.Аль-Шукри, И.А.Корнеев, О.Д.Ягмуров, 2009 УДК 616.62-006.6-036.8:616-097
Е.С. Завьялова1, А.С. Алъ-Шукри1, И.А. Корнеев1, О.Д. Ягмуров2
РОЛЬ АНТИГЕНОВ Ki-67, р53 и bcl-2 В ПРОГНОЗИРОВАНИИ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ПЕРЕХОДНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
E.S. Zavialova, A.S. Al-Shukri, I.A. Korneev, O.D. Yagmurov
THE ROLE OF Ki-67, p53 and bcl-2 ANTIGENS IN THE PROGNOSIS OF CLINICAL COURSE OF TRANSITIONAL CELLULAR CANCER OF THE URINARY BLADDER
Кафедры 1урологии и 2патологической анатомии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова, Россия
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии антигенов Ki-67, p53 и bcl-2 и их связи с клинико-морфологическими характеристиками опухоли, а также клиническим течением болезни. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Ретроспективно изучены материалы клинического обследования 16 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря. Были проведены иммуногистохимические реакции с антителами к Ki-67, p53 и bcl-2. Полученные данные обзорного гистологического и иммуногистохимического исследования сопоставлялись с результатами диспансерного наблюдения за пациентами в течение 5 лет. РЕЗУЛЬТАТЫ. Высокой степени пролиферативной активности переходно-клеточных карцином соответствовала меньшая степень дифференцировки опухолевой ткани (r=0,70; p=0,003) и меньшая продолжительность безрецидивного периода (r=0,67; p=0,078). Для карцином с большим числом р53-позитивных ядер была характерна меньшая степень дифференцировки (r=0,47; p=0,067), быстрое наступление рецидива (r=72; p=0,068) и меньшая продолжительность жизни больных (r=0,72; p=0,087). Активность апоптоза увеличивалась с понижением степени дифференцировки опухоли (r=0,67; p=0,04). Выявлена положительная корреляционная связь между пролиферацией опухолевых клеток и нарушением в них апоптоза (r=0,67; p=0,04). ЗАКЛЮЧЕНИЕ. В результате проведенного исследования нами было установлено, что исследуемые антигены обладают прогностической ценностью, так как тесно связаны со степенью дифференцировки переходно-клеточных карцином. Кроме того, гиперэкспрессия белка р53 была взаимосвязана со скоростью рецидивирования опухолей и выживаемостью больных. Ключевые слова: переходно-клеточный рак, прогноз, Ki-67, p53, bcl-2.
ABSTRACT
THE AIM. The goal of present investigation was to study the expression of Ki-67, p53 and bcl-2 antigens and their connection with clinico-morphological characteristics of the tumor, and also the clinical flow of the disease. PATIENTS AND METHODS. The materials of the clinical investigation of 16 patients with transitional cellular carcinoma of the urinary bladder was retrospectively studied. Immunohystochemical reaction with Ki-67, p53 and bcl-2 antibodies took place. The received histological and immunohystochemical data was co-analyzed with the follow-up results after the patients during 5 years. RESULTS. The high level of proliferative activity of the transitional cell carcinoma correlated with the lower differentiation stage of the tumor tissue (r=0,70; p=0,003) and shorter period of recurrence absence (r=0,67; p=0,078). For the carcinomas with the higher number of p-53 positive nucleae was more characteristic the lower stage of the differentiation (r=0,47; p=0,067), faster recurrence (r=72; p=0,068) and lower life duration of the patients (r=0,72; p=0,087). The apoptosis activity increased with the decrease of the differentiation stage of the tumor (r=0,67; p=0,04). Was discorered a positive correlation between tumor cell proliferation and apoptosis failure (r=0,67; p=0,04). CONCLUSION. As a result of the conducted experiment we stated that investigated antigens have a prognostic value, as a result of their close connection with the stage differentiation of the transitional cell carcinoma. Besides that the hyper expression of p53 protein was interconnected with the speed of the tumor recurrence and survival of the patients. Key words: transitional cell tumor, prognosis, Ki-67, p53, bcl-2.
ВВЕДЕНИЕ
Рак мочевого пузыря относится к распространенным злокачественным новообразованиям и составляет 2-5% от всех злокачественных опухолей
Завьялова Е.С. 197022, С.-Петербург, ул. Л.Толстого, 17. Кафедра урологии СПб ГМУ им. акад. И.П.Павлова. E-mail: [email protected]
человека. В структуре онкологической заболеваемости он занимает 11-е место и достигает 10-15 случаев на 100 000 человек в год [1]. Выбор метода лечения больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря в настоящее время базируется на традиционных прогностических факторах: глубине инвазии и степени дифференцировки. Извес-
тно, что результаты лечения больных, принадлежащих к одной и той же классификационной подгруппе, существенно различаются, поэтому очевидно, что эти признаки не могут полноценно предсказать дальнейшее течение болезни. Поэтому исследователями ведется поиск клинико-морфоло-гического критерия, который позволил бы получить дополнительную прогностическую информацию и точнее спрогнозировать биологическое поведение карцином. Несмотря на эти усилия, до сих пор вопрос остается открытым.
В настоящее время развитие рака мочевого пузыря рассматривается учеными с позиции концепции «опухолевого поля», согласно которой злокачественная трансформация эпителия является проявлением нестабильности эпителия. В результате генетической нестабильности возможно появление множественных новообразований и их частое рецидивирование. Типичными для рака мочевого пузыря изменениями генома являются мутации генов, отвечающих за пролиферативную активность, запуск апоптоза, контроль клеточного цикла. Наиболее изученными и часто применяемыми маркерами рака мочевого пузыря являются индекс пролиферации Кл-67, белки р53 и Ьс1-2, однако, до сих пор однозначно сделать вывод об их ценности нельзя.
Роль протеина К1-67 как индикатора пролифе-ративной активности клеток была изучена для различных локализаций рака, в том числе в отношении рака мочевого пузыря. Учеными, исследовавшими активность К1-67 в переходно-клеточных карциномах, установлено, что экспрессия этого белка ассоциирована со степенью дифференциров-ки опухоли, ее инвазией в кровеносные и лимфатические сосуды и глубиной инфильтрации новообразований [2]. Независимая ценность этого маркера для прогнозирования рецидивирования, прогрессии, выживаемости и эффективности иммунотерапии поверхностных переходно-клеточных карцином мочевого пузыря подтверждается многими исследователями [3, 4, 5, 6]. Несмотря на это, некоторые ученые не обнаружили связи К1-67 с прогнозом заболевания [7].
Мутации гена р53 - самые часто встречающиеся в опухолях человека [8]. Ген кодирует ядерный фосфопротеин, участвующий в регуляции клеточного цикла. Функция этого белка состоит в остановке транскрипции в случае повреждения ДНК для ее репарации, либо индуцирует апоптоз при невозможности ее починки [9]. Прогностическую ценность гиперэкспрессии гена р53 изучало значительное количество авторов [10,11]. Ученые обнаружили, что гиперэкспрессия р53 связана с повы-
шенным риском рецидивирования рака мочевого пузыря и низкой выживаемостью больных, что позволило им рекомендовать этот метод для прогнозирования течения рака мочевого пузыря. Более того, в отношении этих показателей показана независимая прогностическая ценность р53. Другие авторы отметили связь с показателями выживаемости, но не обнаружили данные в пользу независимой ценности этого маркера [12, 13]. В связи с этим возникает необходимость проведения исследования, посвященного изучению прогностических возможностей этого метода.
Протеин bcl-2 является антиапоптическим белком. PK Lipponen и соавт. опубликовали данные обследования 158 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря, по результатам которых была выявлена связь между экспрессией bcl-2 и глубиной инвазии и степенью дифференцировки карцином, митотическим индексом, площадью ядер, а также наличием отдаленных метастазов и скоростью наступления рецидива [14]. Другие авторы отмечали связь гиперэкспрессии bcl-2 с неблагоприятным прогнозом заболевания [15, 16]. Тем не менее, до настоящего времени роль bcl-2 в злокачественном потенциале рака мочевого пузыря до конца не изучена и требует продолжения исследований.
Несмотря на большое количество исследований, подтверждающих прогностическую ценность этих биомаркеров, некоторое количество публикаций отрицают возможность определения исхода заболевания с их помощью. Учитывая невозможность точного определения исхода заболевания, используя отдельные показатели, перспективным направлением поисков нам представляется совокупная оценка нескольких, наиболее хорошо изученных характеристик новообразований. Нами было проведено комплексное исследование аспектов, с различных сторон характеризующих опухолевый процесс: пролиферацию клеток карцином, нарушение апоптоза, нарушение контроля клеточного цикла. Подобных работ, посвященных пере-ходно-клеточному раку мочевого пузыря, в отечественной литературе мы не обнаружили.
Целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии антигенов Ki-67, p53 и bcl-2 и их связи с клинико-морфологическими характеристиками опухоли, а также клиническим течением болезни.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Ретроспективно изучены материалы клинического обследования 16 больных переходно-клеточ-ным раком мочевого пузыря, проходивших лечение в урологических клиниках СПбГМУ им. акад.
Рис. 1. Микрофотография. Окраска гематоксилин-эозин и иммуногистохимическая окраска к белку №-67, увеличение х600. Переходно-клеточный рак мочевого пузыря, контрас-тированы ядра клеток.
Рис. 2. Микрофотография. Окраска гематоксилин-эозин и иммуногистохимическая окраска к белку р53, увеличение х400. Переходно-клеточный рак мочевого пузыря, контрас-тированы ядра клеток.
Рис. 3. Микрофотография. Окраска гематоксилин-эозин и иммуногистохимическая окраска к белку ЬЫ-2, увеличение х400. Переходно-клеточный рак мочевого пузыря, контрас-тирована цитоплазма клеток.
И.П. Павлова и BMA им. С.М. Кирова и находившихся на диспансерном наблюдении. 10 (62%) пациентам была произведена трансуретральная резекция, 3 (19%) выполнена радикальная цистэкто-мия, у 3 (19%) больных опухоль мочевого пузыря была неоперабельной. Соотношение мужчин и женщин было 15:1, средний возраст пациентов составил 66±9 лет. Минимальный размер опухоли был 1 см, максимальный - 8 см, средние размеры составили 2,8±2,6 см. У половины больных карциномы были одиночные, другая половина имела множественные опухоли. У 3 (19%) пациентов оперативные вмешательства были выполнены по поводу рецидивных карцином, у 13 (81%) опухоли были первичными.
Из операционного биопсийного материала приготовлялись гистологические срезы толщиной 5 -7 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином. Затем при увеличении х600 проводилось обзорное гистологическое исследование изучаемых структур с выявлением глубины инвазии и степени дифференцировки рака. При обзорном гистологическом исследовании препаратов было выявлено, что глубина инвазии рака Tis, Та, Т1,Т2, Т3 Т4 и ТХ была выявлена в 1 (6%), 2(13%), 1 (6%), 6 (36%), 2 (13%), 2 (13%), 2 (13%) случаях соответственно, а степень дифференцировки G1, G2 и G3 - в 6 (36%), 6 (36%) и 4 (28%) соответственно.
Иммуногистохимические реакции проводились с антителами к Ki-67, p53 и bcl-2 фирмы «Дако», Дания. Подсчет позитивных клеток производился полуколичественным методом при увеличении х600. Положительным результатом считалось интенсивно-коричневое окрашивание ядер в случае Ki-67 и р53 и коричневое окрашивание цитоплазмы и/или ядерной оболочки в случае bcl-2.
Полученные данные обзорного гистологического и иммуногистохимического исследования сопоставлялись с результатами диспансерного наблюдения за пациентами в течение 5 лет. Средний срок наблюдения составил 51±32 месяца. За время наблюдения рецидивы были выявлены у 7 (44%) больных, средний срок безрецидивного промежутка составил 7±6 месяцев, 7 (44%) пациентов умерло вследствие опухолевой прогрессии и рецидивирования.
При статистической обработке результатов учитывались параметры распределения. Анализировались корреляционные связи между признаками с использованием коэффициента корреляции Пирсона, непараметрического rs-теста, H-крите-рия Краскала-Уоллеса и однофакторного дисперсионного анализа, а сравнение средних величин -с помощью t-критерия Стъюдента и непараметрического U-теста Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Зависимость между глубиной инвазии рака и степенью экспрессии К1-67, р53 и Ьс1-2 в исследованных образцах удаленной опухолевой ткани оказалась ниже порога достоверности (р>0,2).
Высокой степени пролиферативной активности переходно-клеточных карцином соответствовала меньшая степень дифференцировки опухолевой ткани (г=0,70; р=0,003; ге=0,69; р=0,003; Б=6,86; р=0,009) и меньшая продолжительность безрецидивного периода (г=0,67; р=0,078; рис. 1). Среди подгрупп с различной степенью дифференцировки экспрессия К1-67 была менее значительной в образцах ткани с в1 при сравнении с в2 и в3 (1=2,53; р=0,030; и=6,0; р=0,050; 1=6,93; р<0,0001; и=6,0; р=0,011 соответственно).
Для карцином с большим числом р53-позитив-ных ядер была характерна меньшая степень дифференцировки (г=0,47; р=0,067; ге=0,51; р=0,042), быстрое наступление рецидива (г=72; р=0,068) и меньшая продолжительность жизни больных (г=0,72; р=0,087; рис. 2). Низкодифференцирован-ные опухоли демонстрировали большее количество клеток с потерей контроля над клеточным циклом по сравнению с высокодифференцированными новообразованиями (и=2,0; р=0,033).
Активность апоптоза увеличивалась с понижением степени дифференцировки опухоли (г=0,67; р=0,04; ге=0,70; р=0,003; Б=9,69; р=0,03), по сравнению с высоко- и умереннодифференцированными карциномами опухоли со степенью дифференциров-ки в3 имели более высокую степень экспрессии Ьс1-2 (1=2,96; р=0,018; и=2,00; р=0,033; 1=2,94; р=0,019; и=0,00; р=0,011 соответственно; рис. 3, 4).
При анализе результатов исследования обнаружена взаимосвязь некоторых опухолевых антигенов. Так, выявлена положительная корреляционная связь между пролиферацией опухолевых клеток и нарушением в них апоптоза: экспрессия К1-67
Рис. 4. Изменение индекса пролиферации Ю-67, экспрессии белков р53 и Ь^-2 в зависимости от степени дифференцировки новообразований.
и Ьс1-2 была взаимосвязана (г=0,67; р=0,04; ге=0,68; р=0,003). Также наблюдалась положительная тенденция во взаимоотношениях антигенов К1-67 и р53 (г=0,44; р=0,086).
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время благодаря успехам молекулярной биологии, генетики и иммунологии стали возможны исследования биологических свойств опухолей и механизмов канцерогенеза. За последние два десятилетия было предложено большое количество молекулярных маркеров, потенциально обладающих прогностической ценностью в отношении выживаемости больных, вероятности рецидива опухоли, развития метастазов и т. д. Однако ни один из них широко не применяется на практике для прогнозирования течения рака мочевого пузыря вне рамок научных исследований. Многие ученые предлагают комбинировать несколько биомаркеров для более точного предсказания биологического поведения опухоли. В частности, в качестве эффективного сочетания было предложено подсчитывать комбинацию р53 и Кь 67, что позволило повысить точность прогноза заболевания [17]. По результатам проведенного исследования нами была выявлена связь между экспрессией антигенов К1-67 и Ьс1-2, а также между белками К1-67 и р53. Эти данные отражают многогранность происходящих в опухолевой ткани анапластических изменений.
В нашем исследовании было установлено, что экспрессия маркеров К1-67 и Ьс1-2 тесно связана со степенью дифференцировки опухоли, тогда как антиген р53 оказался менее чувствительным в этом отношении. Также при сравнении между подгруппами по степени дифференцировки наблюдались достоверные различия в значениях К1-67 между в1 и в2, Ьс1-2 - между в2 и в3, и все три показателя были эффективны при определении различий между высокодифференцированными и низкодиф-ференцированными опухолями. При анализе прогностических возможностей К1-67, р53 и Ьс1-2 была выявлена связь этих показателей с выживаемостью больных, а также скоростью рецидивирова-ния карцином.
Таким образом, хотя самостоятельной прогностической ценности для исследуемых маркеров установлено не было, они дополнительно характеризуют злокачественный потенциал карцином мочевого пузыря, так как тесно связаны со степенью дифференцировки новообразований. Кроме того, гиперэкспрессия изученных биомаркеров позволяет количественно оценить степень злокачественности опухоли, а комбинация нескольких ан-
тигенов может повысить степень надежности результатов.
Одним из наиболее дискуссионных вопросов, касающихся рака мочевого пузыря, остается проблема определения степени дифференцировки пе-реходно-клеточных опухолей мочевого пузыря. За последние 10 лет Европейская Ассоциация Урологов трижды меняла свои рекомендации по определению принадлежности карцином к той или иной гистологической группе. В настоящий момент принято деление переходно-клеточных опухолей мочевого пузыря на папиллярные новообразования с низким злокачественным потенциалом, высокодиф-ференцированные и низкодифференцированные папиллярные карциномы уротелия. Однако, несмотря на это, единого мнения относительно используемой классификации у урологов нет. Причиной, по которой происходят изменения классификационных групп переходно-клеточных карцином, является вариабельность результатов вследствие субъективной оценки гистологом степени дифференциров-ки карцином. Разрешение этой проблемы - в количественных методах оценки степени анаплазии опухолевой ткани и стандартизации методик, реактивов и подходов к интерпретации результатов. Учитывая тесную взаимосвязь степени дифферен-цировки и гиперэкспрессии Ki-67, bcl-2 и менее выраженную зависимость с р53, можно сделать вывод, что эти показатели могли бы стать одним из критериев, которые позволили бы точнее определить гистологическую градацию новообразований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного исследования нами было установлено, что антигены обладают прогностической ценностью, так как тесно связаны со степенью дифференцировки переходно-клеточных карцином. Кроме того, гиперэкспрессия белка р53 была взаимосвязана со скоростью рецидивирова-ния опухолей и выживаемостью больных.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of major cancers in 1985. Int J Cancer 1993;54:594-606
2. Margulis V, Shariat SF, Ashfaq R, Sagalowsky AI, Lotan Y Ki-67 is an independent predictor of bladder cancer outcome
in patients treated with radical cystectomy for organ-confined disease. Clin Cancer Res 2006;12:7369-7373
3. Lebret T, Becette V, Herve JM. Prognostic value of MIB-1 antibody labeling index to predict response to Bacillus Calmette-Guerin therapy in a high-risk selected population of patients with stage T1 grade G3 bladder cancer. Eur Urol 2000; 37:654-659
4. Pich A, Chiusa L, Formiconi A. Proliferative activity is the most significant predictor of recurrence in noninvasive papillary urothelial neoplasms of low malignant potential and grade 1 papillary carcinomas of the bladder. Cancer 2002;95:784-790
5. Santos L, Costa C, Pereira S, Koch M, Amaro T, Cardoso F, Guimaraes T, Bento MJ, Lobo F, Pinto S, Lopez C. Neovascularisation is a prognostic factor of early recurrence in T1/G2 urothelial bladder tumor. Ann Oncol 2003;14(9):1419-1424
6. Quintero A, Alvarez-Kindelan J, Luque RJ. Ki-67 MIB1 labeling index and the prognosis of primary TaT1 urothelial cell carcinoma of the bladder. J Clin Pathol 2006;59:83-88
7. Zlotta AR, Noel JC, Fayt I, Drowart, Van Vooren JP, Huygen K, Simon J, Schulman CC. Correlation and prognostic significance of p53, p21WAF1/CIP1 and Ki-67 expression in patients with superficial bladder tumors treated with bacillus Calmette-Guerin intravesical therapy. J Urol 1999;161(3):792-798
8. Hollstein M, Sidransky D, Volgelstein B, Harris CC. P53 mutations in human cancers. Science 1991;253:49
9. Lane DP. Cancer. P53, guardian of the genome. Nature 1992;358:15
10. Kuczyk MA, Bokemeyer C, Serth J, Hervatin C, Oelke M, Hofner K, Tan HK, Jonas U. P53 overexpression as a prognostic factor for advanced stage bladder cancer. Eur J Cancer 1995;31A(13-14):2243-2247
11. Rodriguez-Alonso A, Pita-Fernandez S, Gonzalez-Carrero J, Nogueira-March JL. P53 and Ki-67 expression as prognostic factors for cancer-related survival in stage T1 transitional cell bladder carcinoma. Eur Urol 2002;41(2):182-8; discussion 188-189
12. Lipponen PK. Overexpression of p53 nuclear oncoprotein in transitional cell bladder cancer and its prognostic value. Int J Cancer 1993;53(3):365-370
13. Shiina H, Igawa M, Nagami H, Yagi H, Urakami S, Yoneda T, Shirakawa H, Ishibe T, Kawanishi M. Immunohistochemical analysis of proliferating cell nuclear antigen, p53 protein and nm23 protein, and nuclear DNA content in transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer 1996; 78(8):1762-1774
14. Lipponen PK, Aaltomaa S, Eskelinen M. Expression of the apoptosis suppressing bcl-2 protein in transitional cell bladder tumors. Histopathology 1996;28920:135-140
15. Ong F, Moonen LM, Gallee MP, ten Bosch C, Zerp SF, Hart AA, Barterlink H, Verheij M. Prognostic factors in transitional cell cancer of the bladder: an emerging role for bcl-2 and p53. Radiother Oncol 2001;61(2):169-175
16. Atug F, Turkeri L, Ozyurek M, Akdas A. Bcl-2 and p53 overexpression as risk factors in transitional cell carcinoma of the bladder. Int Urol Nephrol 1998; 30(4):455-461
17. Bol MGW, Baak JPA, van Diermen B, Buhr-Wildhagen S, Janssen EAM, Kjellevold KH, Kruse AJ, Mestad O, Ogreid P. Proliferation markers and DNA content analysis in urinary bladder TaT1 urothelial cell carcinomas: identification of subgroups with low and high stage progression risks. J Clin Pathol 2003; 56(6):447-452
Поступила в редакцию 12.11.2008 г.
Принята в печать 10.02.2009 г.
