CC BY
5©Коллектив авторов,2014 Вопросы онкологии, 2014. Том 60, № 3
УДК618.12.006.6
В.И. Киселева, Л.И. Крикунова, Л.С. Мкртчян, Л.В. Любина, Г.П. Безяева,
Л.В. Панарина, КА. Замулаева
риск ТРАНСФОРМАЦИИ НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
ШЕЙКИ МАТКИ
ФГБУ МРНЦ Минздрава России, Обнинск
Проведен сравнительный анализ количественной нагрузки и физического статуса вируса папилломы человека (ВПЧ) 16 типа в группах больных цервикальными интра-эпителиальными неоплазиями (CIN) — 25 человек и раком шейки матки (РШМ) — 85 человек. По результатам анализа выбраны критерии, соответствующие неблагоприятному сочетанию факторов, характеризующих ВПЧ-инфекцию и одновременно учитывающих и количественную нагрузку, и физический статус вируса: высокая вирусная нагрузка (>6,5 lg копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при эписомальной форме или низкая нагрузка (<6,5 lg копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при интегрированной форме вируса. Согласно расчетам относительный шанс возникновения РШМ у больных CIN с неблагоприятным сочетанием факторов в 7,5 раз выше, чем у остальных больных (р=0,0002).
Ключевые слова: цервикальные интраэпи-телиальные неоплазии (CIN), прогноз, вирус папилломы человека (ВПЧ), высокий канцерогенный риск (ВКР), интеграция ДНК ВПЧ, рак шейки матки (РШМ).
В настоящее время убедительно доказано, что персистирующая инфекция канцерогенными типами вируса папилломы человека (ВПЧ) может привести к развитию цервикальных ин-траэпителиальных неоплазий (CIN) [3, 4, 5, 6]. При этом, изменения низкой степени тяжести (CIN I) в большинстве своем спонтанно регрессируют, а изменения умеренной и тяжелой степени (CIN II, CIN III) практически у 5% и 12% больных соответственно прогрессируют в инва-зивный рак [13, 17]. На данный момент считается признанным, что анализ вирусных маркеров (генотип, количественная нагрузка, физический статус, экспрессия вирусных онкогенов) может давать существенные преимущества врачу при мониторинге пациентов с ВПЧ инфекцией канцерогенных типов [1, 4, 11, 12, 15]. Однако многочисленные противоречия в результатах исследований различных авторов в этой области не дают возможности рекомендовать эти тесты
для создания конкретных программ цервикаль-ного скрининга [9, 10, 12, 14, 15, 18]. В этой связи изучение возможности использования качественных и количественных характеристик ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) как маркеров оценки течения CIN по-прежнему остается актуальным. Привлекательность этих маркеров в немалой степени определяется относительной простотой, легкой воспроизводимостью и малой затратностью способов их выявления, что делает их доступными для рядовых клинических лабораторий.
Целью настоящего исследования явилось выявление высокоэффективных молекулярно-ге-нетических маркеров прогнозирования течения цервикальной интраэпителиальной неоплазии на основе комплексного подхода, одновременно учитывающего качественные и количественные показатели ВПЧ-инфекции.
Материал и методика
исследуемую группу составили 54 первичных больных CIN различной степени тяжести (I-III) и 138 первичных больных РШМ I-IV стадий. У всех пациенток диагноз был верифицирован морфологически. У больных до начала лечения цитощеткой брали соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала и наружной поверхности шейки матки (ШМ), а при отсутствии противопоказаний к инвазивному вмешательству — соответствующие био-птаты. Полученный биологический материал исследовали на наличие и типовую принадлежность ДНК ВПЧ 12 генотипов высокого канцерогенного риска методом ПЦР в режиме реального времени. Выделение ДНК из полученных образцов и анализ наличия и типовой принадлежности ВПЧ проводили с использованием комплектов реагентов «ДНК-сорб В», «ДНК-сорб С», реагентов «АмплиСенс ВПЧ ВКР-скрин» и «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России). В тех образцах, где был обнаружен ВПЧ 16, анализировали его количественную нагрузку и физический статус (эписомальная или частично/полностью интегрированная форма) с использованием набора реагентов для амплификации участков генов Е2 и Е7 вируса и клеточного гена ß-глобина (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России). Анализ проводили TagMan-методом в формате мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени на "iCycler iQ" ("BioRad", США) и "Rotor Gene" ("Corbett Research", Австралия). Подробно методика представлена в работе [2].
Статистический обработку результатов проводили в соответствии с критериями Фишера и Спирмана (пакет про-
грамм "Statistiea-6"), величину и доверительный интервал OR (относительный шанс возникновения РШМ у больных CIN) рассчитывали по формулам, приведенным в книге О.Ю.Ребровой [3].
Результаты и обсуждение
Вирус 16 типа выявлен у 25 больных CIN, среди которых большую часть составили изменения тяжелой степени, и у 85 больных ин-вазивным РШМ, представленным, в основном, плоскоклеточным раком I-II стадий (табл. 1).
Таблица 1
Клинико-морфологическая характеристика больных ВПЧ16-положительным CIN и РШМ
Заболевание Количество больных
Инвазивный РШМ n = 85 Плоскоклеточный рак 83 (97,6%)
Аденокарцинома 2 (3,4%)
I стадия 17 (20,0%)
II стадия 28 (32,9%)
III стадия 32 (37,6%)
IV стадия 6 (7,1%)
CIN различной степени тяжести n = 25 CIN I 2 (8,0%)
CIN II 6 (24,0%)
CIN III 17 (68,0%)
Сравнение результатов анализа количественных показателей ВПЧ16, выполненных на разном биологическом материале (соскобы из цер-викального канала и биоптаты ШМ), показало их высокую корреляцию между собой: для количественной нагрузки коэффициент корреляции составлял 0,91, а для степени интеграции ДНК вируса — 0,98 при уровне значимости близком к 100% в обоих случаях (р=0,00001). Полученные результаты имеют принципиальное значение. В литературе, как известно, неоднократно поднимался вопрос об адекватности материала, на котором исследуются количественные показатели вируса [5, 16]. Прицельно точно взять только те клетки, которые необходимы в каждом конкретном случае, крайне сложно: в образцы могут попадать клетки разной степени неопластического поражения, а также клетки нормального эпителия и стромы, что может затруднить получение корректных результатов. В этой связи выявленные нами корреляции дают основание считать, что материал для исследования был взят оптимально: и на том, и на другом биологическом материале получены адекватные результаты. на основании полученных данных можно рекомендовать для использования в исследованиях подобного рода щадящую неинва-зивную технику получения материала — соскоб цитощеткой вместо биопсии.
Анализ количественной нагрузки ВПЧ16 и степени интеграции ДнК вируса в клеточный геном у больных CIN выявил широкую вариа-
бельность этих показателей в каждой из представленных групп. Кроме того, ни по одному из этих показателей не обнаружено статистически значимых различий между CIN I, CIN II и CIN III. Скорее всего, это связано с малой выборкой данных. В этой связи в дальнейшем при формировании групп сравнения больные CIN были объединены в одну группу, вторую группу составили больные РШМ.
Значение количественных и качественных показателей ВПЧ16 для прогноза течения заболевания CIN и возможности развития РШМ исследовали ретроспективным методом путем сравнения их в представленных группах (табл. 2). Пограничным уровнем, условно разделяющим показатели количественной нагрузки вируса на высокие и низкие, выбрано 6,5 lg копий Е7 вируса на 100 тыс. клеток. Распределение по уровню вирусной нагрузки среди больных CIN и инвазивным РШМ оказалось практически одинаковым. Следовательно, можно полагать, что согласно полученным данным, вероятность возникновения РШМ у больных CIN не зависит от количественной нагрузки вируса.
Таблица 2
Распределение больных CIN и инвазивным РШМ на группы в зависимости от количественных и качественных характеристик ВПЧ
Количественные и качественные характеристики ВПЧ16-инфекции Число больных Уровень значимости по 2х критерию Фишера
CIN РШМ
Количественная нагрузка <6,5 ^ Е7/100 тыс. клеток >6,5 ^ Е7/100 тыс. клеток 18 (72,0%) 7 (28,0%) 62 (72,1%) 23 (27,9%) 1,0
Физический статус ДНК вируса Эписомальная форма Интегрированная форма 18 (72,0%) 7(28,0%) 52 (61,2%) 33 (38,8%) 0,35
При изучении физического статуса вируса было показано, что доля интегрированной формы (полностью или частично) несколько выше при РШМ, чем при CIN. Согласно расчетам, интеграция вирусной ДнК в клеточный геном повышает относительный шанс возникновения РШМ у тех же больных CIN чуть более, чем в 1,5 раза, но эти результаты статистически незначимы (Р=0,35). Можно полагать, что изучаемые показатели — количественная нагрузка и физический статус вируса, взятые в отдельности, не дают возможности дифференцировать заболевания CIN и инвазивный рак шейки матки.
Совершенно иная картина наблюдается, если анализ проводить с одновременным учетом физического статуса и количественной нагрузки вируса. В табл. 3 представлено распределение больных CIN и РШМ именно с таким одновре-
менным учетом характеристик вирусной инфекции. В качестве критериев, соответствующих неблагоприятному сочетанию факторов, характеризующих ВПЧ-инфекцию, условно выбраны: высокая вирусная нагрузка при эписомальной форме или низкая нагрузка при частично/полностью интегрированной форме вируса.
Таблица 3
Распределение больных CIN и инвазивным РШМ на группы с одновременным учетом количественной нагрузки и физического статуса ВПЧ 16
Таблица 4
Относительные шансы возникновения РШМ в группах больных CIN с неблагоприятным прогнозом
Статистический анализ полученных результатов свидетельствуют о том, что неблагоприятное сочетание факторов, характеризующих вирусную инфекцию, встречается чаще у больных ин-вазивным РШМ, чем у больных CIN: при этом уровень значимости р по двустороннему критерию Фишера для всех представленных групп сравнения составляет не выше 0,01. Относительный шанс возникновения рака у больных CIN с таким неблагоприятным сочетанием факторов в 6-9 раз выше, чем у остальных больных неопластическими процессами (табл. 4). Больные с не-
благоприятным прогнозом течения заболевания в соответствии с данными критериями составляют 16% среди всех представленных ВПЧ16-позитивных случаев CIN.
Таким образом, выявленные в настоящем исследовании закономерности составили основу для разработки наиболее эффективных и пригодных для практического применения маркеров, позволяющих проводить раннее прогнозирование неблагоприятного течения CIN, ассоциированных с ВПЧ16, и возможного перехода их в РШМ. Такими маркерами оказались количественная нагрузка и физический статус вируса, учитываемые одновременно. Следует отметить, что в настоящее время в клинических лабораториях довольно активно используется критерий только вирусной нагрузки высокой и низкой для оценки тяжести CIN. Полученные нами данные дают основание полагать, что такой критерий без одновременного учета физического статуса вируса, может привести к некорректным выводам, поскольку, например, располагая информацией о низкой вирусной нагрузке в отрыве от сведений о физическом статусе вируса, можно составить ложный относительно благоприятный прогноз заболевания.
Высокие шансы прогрессирования CIN в РШМ при неблагоприятном сочетании означенных факторов позволяют формировать группу высокого канцерогенного риска, и, соответственно, управлять тактикой лечения и профилактикой во времени, в результате предотвращая развитие онкологического процесса, что является одной из приоритетных задач здравоохранения.
В заключении следует отметить, что, несмотря на статистическую значимость полученных результатов, последние следует считать предварительными, поскольку анализируемые выборки немногочисленны.
настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 — 2020 годы».
ЛИТЕРАТУРА
1. Киселева В.И., Крикунова Л.И. и др. Способ оценки состояния гиперпролиферативных заболеваний шейки матки//Патент на изобретение №2503960. — 2012.
2. Киселева В.И., Крикунова Л.И., Мкртчян Л.С. и др. // Вопр. онкол.- 2013. — Т.6. — С.756-760.
3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — Москва., изд. «Медиа-Сфера». — 2006.
4. Трушина О.И., Новикова Е.Г., Шипулина О.Ю. и др. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ как прогностический фактор злокачественной прогрессии папилломавирусной инфекции. // Сб.трудов VIII-ой Всеросс. научно-практ.
Сочетание факторов, характеризующих ВПЧ-инфекцию Показатели количественной нагрузки и физического статуса вируса Количество больных
РШМ CIN
Неблагоприятное сочетание Высокая нагрузка (>6,5 к] копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при эписо-мальной форме 50 4
Низкая нагрузка (<6,5 1д копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при частично и полностью интегрированной форме
Благоприятное сочетание Низкая нагрузка (<6,5 1д копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при эписо-мальной форме; 35 21
Высокая нагрузка (>6,5 1д копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при частично интегрированной форме.
Сочетание факторов, ха-растеризующих ВПЧ-инфекцию Относительный шанс возникновения РШМ в группе больных CIN OR Уровень значимости по 2х критерию Фишера Доверительный интервал
Сумма неблагоприятных факторов, в том числе: 7,5 0,0002 2,3; 24,2
Высокая нагрузка (>6,5 1д копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при эписомаль-ной форме 6,0 0,01 1,3; 28,8
Низкая нагрузка (<6,5 1д копий ДНК ВПЧ на 100 тысяч клеток) при интегрированной форме 9,0 0,001 1,9; 42,3
конф. с международным участием Москва.- 2014.-Т.1.- С.207.
5. Boulet GA, Horvath CA, Berghmans S et al. Human papillomavirus in cervical cancer screening: important role as biomarker// Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. —
2008. — V.17. — P.810-817.
6. Castle PE, Dckter J, Giachetti C et al. A cross-sectional study of a prototype carcinogenic human papillomavirus E6/E7 messenger RNA assay for the detection of cervical precancer and cancer // Clin.Cancer Res. — 2007. — Vol.13. — P.2599-2605.
7. Castle PE. The potential utility of HPV genotyping in screening and clinical management. // J Natl Compr Canc Netw. — 2008. — Vol.6. — P.83-95.
8. Castle PE, Fetterman B, Poitras N et al. Variable risk of cervical precancer and cancer after a human papillomavi-rus-positive test// Obstet Gynecol. — 2011. — V. 117. — P650-656.
9. Cattani P, Siddu A, D'Onghia S et al. RNA (E6 and E7) Assay versus DNA (E6 and E7) Assay for risk evaluation for Women Infected with Human Papillomavirus//J Clin Microbiol. — 2009. — V.47. — P.2136-2141.
10. Cheung JL, Cheung TH, Ng CW et al. Analysis of human papillomavirus type 18 load and integration status from low-grade cervical lesion to invasive cervical cancer. —
2009. — V.47. — P.287-293.
11. Cricca M, Morselli-Labate AM, Venturoli S et al. Viral DNA load, physical ststus and E2/E6 ratio as markers to grade HPV 16 positive women for high-grade cervical lesions // Gynecol Oncol. — 2007. — V. 106. — P.549-557.
12. Hudelist G, Manavi M, Pichinger KI et al. Physical state and expression of HPV DNA in bening and dysplastic cervical tissues: different levels of viral integration are correlated with lesion grade // Gynecol Oncol. — 2004. — V.92. — P.873-880.
13. Louvanto K, Syrjanen KJ, Rintala MA et al. Human papillomavirus and predictors of cervical intraepithelial neoplasia among young mothers in prospective follow-up study// Acta Obstet Gynecol Scand. — 2011. — V.90. — P. 167-173.
14. Matovina M, Sabol I, Grubisic G et al. Identification of human papillomavirus type 16 integration sites in highgrade precancerous cervical lesions//Gynecol Oncol.-2009. — V.113. — P.120-127.
15. Saunier M, Monnier-Benoit S, Mauny F et al. Analysis of Human Papillomavirus Type 16 (HPV 16) DNA Load
and Physical State for Identification of HPV 16-Infected Women with High-Grade Lesions or Cervical Carcinoma// J. Clin Microbiol.- 2008.- V. 46. - P.3678-3685.
16. Sherman ME, Wang SS, Weeler Cm et al. Determinants of human papillomavirus load among women with histological cervical epithelial neoplasia 3: dominant impact of surrounding low-grade lesions// Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. — 2003. — V.12. — P.1038-1144.
17. Schiffman M, Wentzensen N, Wacholder S et al. Human Papillomavirus Testing in the Prevention of Cervical Cancer // J Natl Cancer Inst. — 2011. — V.103. — P.368-383.
18. Yoshida T, Sano T, Kamuna T et al. Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of type distribution, viral load, and physical status of human papillomavirus in liquid-based cytology samples from cervical lesions// Int J Cancer.- 2008. — V.18. — P.121-127.
Поступила в редакцию 15.04.2014 г.
VI.Kiseleva, L.I.Krikunova, L.S.Mkrtchyan, L.VLyubina, G.P.Bezyaeva, L.VPanarina, I.A.Zamulaeva
The risk of neoplastic processes transformation in cervix uteri
Medical Radiological Research Center, Moscow
There was performed a comparative analysis of quantitative load and physical status of human papillomavirus (HPV) type 16 in groups of patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) — 25 people and cervical cancer (CC) — 85 people. According to the analysis there were selected criteria appropriate to a combination of adverse factors that characterized HPV- infection and at the same time estimated both quantitative load and physical status of the virus: high viral load (> 6,5 lg copies of HPV DNA per 100000 cells) in episomal form or low load (<6,5 lg copies of HPV DNA per 100000 cells) in integrated form of the virus. According to calculations a relative chance of appearing of CC in CIN patients with unfavorable combination of factors was 7,5 times higher than in other patients.
Key words: cervical intraepithelial neoplasia (CIN), prognosis, human papillomavirus (HPV), high carcinogenic risk, integration of HPV DNA, cervical cancer (CC)
