CC BY
20
Таким образом, исходно высокий уровень показателя абсолютного числа CD4+ Т-клеток за счет субпопуляций наивных CD3+ CD4+ Т-клеток и центральных хелперных Т-клеток памяти в периферической крови реципиента является прогностическим маркером риска развития иммунологических осложнений при трансплантации почки. Тем не менее подтверждение информативности иммунологического мониторинга с определением указанных субпопуляций иммунокомпетентных клеток для прогнозирования, диагностики и контроля лечения острого отторжения при трансплантации почки требует дальнейшего изучения. ЕЗ
Статья поступила в редакцию 01.06.2016 г.
С.В. Коротков1, А.В. Носик2, В.В. Смольникова1, В.Ю. Гриневич1, Д.Ю. Ефимов1, А.А. Сыантович3, М.В. Дмитриева3, А.М. Федорук1, 2, А.Е. Щерба1, О.В. Калачик1, 2, С.И. Кривенко1, О.О. Руммо1
1РНПЦ трансплантации органов и тканей на базе 9-й городской клинической больницы, Минск белорусская медицинская академия последипломного образования, кафедра трансплантологии
3Городское клиническое патолого-анатомическое бюро, Минск
Summary
Kidney transplantation is the most suitable method of treatment of patients with and stage kidney disease. However, considering genotypic distinctions between the donor and the recipient can lead to rejection and dysfunction of a transplant. Immunomonitoring of CD4+ T-lymphocytes and their subpopulation number is a potential signature in prediction and diagnostic of acute transplant rejection.
ff See: http://mnosfera.by/2016/08/Mymphocytes
Литература
1. Sola E. et al. Long-Term Improvement of Deceased Donor Renal Allograft Survival Since 1996: A Single Transplant Center Study // Transplantation. 2010. Vol. 89, N6. С. 714-720.
2. Zhang R. Clinical Management of Kidney Allograft Dysfunction // Open J. Organ Transpl. Surg. 2014. Vol. 4. P. 7-14.
3. Chaumont M. et al. Delayed Graft Function in Kidney Transplants: Time Evolution, Role of Acute Rejection, Risk Factors, and Impact on Patient and Graft Outcome // J. Transplant. 2015. Vol. 2015, N5. P. 1-9.
4. Ganji M. R., Broumand B. Acute cellular rejection // Iran J. Kidney Dis.2007. Vol. 1, N2. P. 54-56.
5. Wood K. J., Goto R. Mechanisms of Rejection: Current Perspectives // Transplantation. 2012. Vol. 93, N1. P. 1-10.
6. Su C. A., Fairchild R. L. Memory T-Cells in Transplantation // Curr. Transplant. Reports. 2014. Vol. 1, N3. P. 137-146.
7. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central Memory and Effector Memory T— Cell Subsets: Function, Generation, and Maintenance // Ann. Rev. Immunol. 2004. Vol. 22, N1. P. 745-763.
8. Bingaman A. W., Farber D. L. Memory T cells in transplantation: Generation, Function, and Potential Role in Rejection // Am. J. Transplant. 2004. Vol. 4, N6. P. 846-852.
9. Mueller S. N. et al. Memory T—Cell Subsets, Migration Patterns, and Tissue Residence // Ann. Rev. Immunol. 2013. Vol. 31, N1. P. 137-161.
10. Chang J. T., Wherry E. J., Goldrath A. W. Molecular regulation of effector and memory T—Cell differentiation // Nat. Immunol. 2015. Т. 15, N12. P. 1104-1115.
Риск ранней дисфункции трансплантата печени
ассоциирован с полиморфизмом гена TLR-4
Резюме. Цель исследования - оценка ассоциации генотипов клинически значимых последовательностей нуклеотидов п11536865, №13930 и г$5030717 гена ПР:-4 с риском возникновения и выраженностью ранней дисфункции трансплантатов печени. Ранняя дисфункция трансплантата имеет генетические предпосылки, обусловленные полиморфизмом гена Т1Н-4, которые реализуются через активацию ИМСВ1, клеток Купфера и И-23.
Ключевые слова: ранняя дисфункция трансплантатов печени, генетические предпосылки, ассоциации генотипов последовательностей нуклеотидов, полиморфизм гена Т1Н-4.
Использование доноров как со стандартными, так и с расширенными критериями сопряжено с развитием ранней дисфункции трансплантата (РДТ)печени, в основе которого лежит ишемически-реперфузионное повреждение (ИРП) [1]. При этом не существует надежного объективного метода оценки донорского печеночного трансплантата, по которому можно было бы судить о риске возникновения дисфункции органа, других осложнений и летальности.
Известен ряд фенотипиче-ских и технических факторов риска дисфункции трансплантата га стороны донора (возраст, уровень натрие-мии, степень жирового гепато-за, гипотензия, продолжительный период холодовой и тепловой ишемии, длительность искусственной вентиляции легких (ИВЛ) более 7 суток, небьющееся сердце и расщепленный или редуцированный трансплантат) и реципиента (MELD и ургентность трансплантации) [2, 3]. Однако из клинического наблюдения известно, что РДТ имеет широкую вариабельность степени выраженности и различный прогноз при прочих равных
3I
фенотипических и технических факторах риска. Возможно, ИРП генетически детерминировано и ему соответствует генетический профайл, характерный как для холодовой консервации, так и для реперфу-зионного повреждения [4].
Патология печени, развивающаяся вследствие ИРП - типичный пример воздействия DAMP. Современная модель DAMP-опосредованного повреждения включает взаимодействие ядерного белка HMGB1 (в результате некроза гепатоцитов) с рецепторами TLR2, TLR4, TLR9 и активацию клеток Купфера, что ведет к секреции IL-23 и других цитокинов активированными макрофагами и эндотели-альными клетками, стимуляции yS-T клеток на продукцию IL-17 и хемотаксису нейтрофи-лов в печень [5].
Одну из ключевых позиций в возникновении и акселерации системного воспалительного ответа и ИРП, по современным представлениям, занимает ген TLR-4 [6]. В экспериментальном исследовании [7] описано, что блокада его активации у мышей способствовала ослаблению воспаления и ИРП после трансплантации печени. Кроме того, TLR-4 провоцирует гиперактивацию эндотелио-цитов при ИРП даже в отсутствие клеток Купфера и является медиатором дисфункции трансплантата органа со стеа-тозом [8, 9].
В одной из работ было показано, что в северо-амери-канской популяции минорные аллели последовательностей rs11536865, rs913930 и rs5030717 гена TLR-4 ассоциированы с потерей трансплантата печени [10]. На основании этих данных мы выдвигаем гипотезу, что помимо фенотипических
и технических факторов риска ранняя дисфункция трансплантата имеет генетические предпосылки, обусловленные полиморфизмом гена TLR-4, которые реализуются в результате специфических патологических процессов, характерных для трансплантации (системный воспалительный ответ у умершего донора и ишемиче-ски-реперфузионное повреждение у реципиента).
Цель исследования - оценка ассоциаций генотипов клинически значимых последовательностей нуклеотидов ге11536865, ге913930 и ге5030717 гена TLR-4 с риском возникновения ранней дисфункции трансплантатов печени.
Мы выполнили исследование случай-контроль по выявлению ассоциации РДТ с различными генотипами гена TLR в последовательности ге11536865, ге913930 и ге5030717. Исследование проводилось с ноября 2013 г. по апрель 2015 г. и включало 71 пациента, перенесшего трансплантацию печени от умершего донора со стандартными критериями. Критериями исключения являлись трансплантация от родственного донора, редуцированный графт, возраст реципиента менее 18 лет.
Через один час после портальной реперфузии образцы крови левой печеночной вены, полученные путем пункции, были взяты для определения уровня ^-6, -8, -17, -23, ТОТ-а, М1Р-1а и Р-селектина. Биопсия печени выполнялась через два часа после портальной репер-фузии с целью иммуно-гисто-химической окраски на СБ68 и ЫМОБ1.
Для амплификации 3 ло-кусов гена TLR4, в которых расположены полиморфизмы (БОТ) 1536865 (О/С),
rs5030717(A/G), rs913930 (T/C), были подобраны олигонуклео-тидные праймеры [10, 11].
Для получения специфичных ПЦР-продуктов трех исследуемых локусов гена TLR4 ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 х ПЦР буфер, 0,2 мМ dNTPs, 0,2 мкл Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo scientific, Финляндия), по 0,25 мкМ прямого и обратного праймера (Праймтех, Беларусь) и 5 мкл геномной ДНК.
Для проведения ПЦР геномную ДНК выделяли из образцов крови доноров с использованием набора «Нуклеосорб».
Наличие ранней послеоперационной дисфункции трансплантата оценивалось по уровню АСТ, АЛТ, билирубина и МНО, а первые 7 дней после операции - в соответствии с критериями K. M. Olthoff и соавт. [12]. Тяжелая РДТ была определена по критериям P. R. Salvalaggio и соавт. [13].
В пределах rs5030717 были выявлены три генотипа: AA (гомозигота) и два генотипа с минорной аллелью -G-AG (гетерозигота) и GG (гомозигота).
В пределах rs913930 были выявлены 3 генотипа: TT (гомозигота) и два генотипа с минорной аллелью - C-TC, CC (гетеро- и гомозиготный соответственно).
Изучение rs11536865 не выявило полиморфизма (все образцы имели генотип GG). Клинически значимый вариант полиморфизма - аллель С (минорная аллель) в исследованных образцах не обнаружен.
В пределах SNP rs913930 выявлен генотип ТТ в 59,1% случаев (42 из 71), в 29,5% (21 из 71) - CT и в 11,2% (8 из 71) -СС. В SNP rs5030717 81,6%
Рис. 1.
Экспрессия ИМСВ1
в донорских
биоптатах печени,
трансплантация
которых
не осложнилась
РДТ
Рис. 2.
Экспрессия ИМСВ1 в донорских биоптатах печени, трансплантация которых
осложнилась РДТ
(58 из 71) доноров имели генотип АА, 12,6% (9 из 71) были гетерозиготами AG с минорной аллелью A и 5,6% (4 из 71) были гомозиготами с минорной аллелью GG.
В целом ранняя дисфункция трансплантата печени развилась у 14 из 71 пациентов (19,7%), тяжелая РДТ - у 8 (11,2%), септические осложнения - у 10 (14%), острое клеточное отторжение - у 17 (23,9%). При анализе влияния на риск развития РДТ генотипа С/T по сравнению с генотипами СС+TT было выявлено, что частота умеренно тяжелой и тяжелой РДТ была достоверно значительно больше у пациентов с генотипом донорской печени С/T (23,8%) в последовательности rs913930 по сравнению с гомозиготными генотипами СС+TT (6%; Fisher exact test, p=0,04). Частота РДТ по критериям Olthoff и септических осложнений достоверно не отличалась в группах генотипов С/T и СС+TT.
Регрессионный анализ показал, что генотип C/T гена TLR-4 в последовательности SNP rs913930 имеет сильную связь с развитием ранней дисфункции трансплантата (отношение шансов 4,8: 1; p=0,047; 95% ДИ 1-23,4).
Анализ ассоциаций полиморфизма гена TLR-4 в последовательности SNP rs913930 с иммуногистохимическими (CD68, HMGB1) и серологическими маркерами (VEGF, АСТ, АЛТ, прокальцитонин) показал, что пациенты с генотипом донорской печени С/T имели достоверно большую пропорцию HMGB1 (%) положительных ге-патоцитов в донорском биоптате (21 (17-29)%) по сравнению с генотипами СС+TT (16 (10-19)%) (Манн - Уитни, p=0,01).
При анализе влияния на риск развития РДТ генотипов СС+С/T по сравнению с генотипом TT было установлено, что частота умеренно тяжелой и тяжелой РДТ была достоверно значительно больше у пациентов с генотипами донорской печени СС+С/T (20,6%) в последовательности rs913930 по сравнению с гомозиготными генотипами TT (4,7%; Fisher exact test, p=0,04). Частота РДТ по критериям Olthoff и септических осложнений достоверно не отличалась в группах генотипов CC+G/T и TT.
Регрессионный анализ показал, что аллель С гена TLR-4 в последовательности SNP rs913930 (генотипы СС+C/T) ассоциирована, хотя и погранично недостоверно, с развитием ранней дисфункции трансплантата (отношение шансов 5,2: 1; p=0,05; 95% ДИ 0,9-28).
Анализ ассоциаций полиморфизма гена TLR-4 в последовательности SNP rs913930 с иммуно-гистохи-мическими (CD68, HMGB1)
и серологическими маркерами (VEGF, АСТ, АЛТ, прокаль-цитонин) показал, что пациенты с генотипом донорской печени СС+С/T имели достоверно большую пропорцию HMGB1 положительных гепатоцитов в донорском биоптате (19,5 (14-29)%) по сравнению с генотипами TT (16 (10-19)%) (Манн - Уитни, p=0,02; а также тенденцию к большей пропорции HMGB1 положительных гепатоцитов в постреперфузионном биоптате (Манн - Уитни, p=0,06).
Анализ влияния на риск развития РДТ полиморфизма гена TLR-4 в последовательности rs5030717 показал, что частота (пропорции пациентов,%) РДТ, тяжелой РДТ, септических осложнений и острого клеточного отторжения достоверно не отличалась между генотипами A/G+GG в сравнении с АА и A/G (p=0,7; 0,8; 0,6; 0,9 соответственно) и в сравнении с AA+GG (p=0,8; 0,3; 0,3; 0,9 соответственно).
Анализ роли экспрессии CD68 и HMGB1 показал достоверную корреляцию между экспрессией CD68 в биоптатах печени доноров и уровнем IL-23 в печеночных венах трансплантата через 1 час после репер-фузии (р=0,62; p=0,04) и между экспрессией HMGB1 в биопта-тах печени доноров и уровнем АСТ через 24 часа после репер-фузии (r=0,4; p=0,02).
Дальнейший анализ связи ИГХ-маркеров активации гепатоцитов и клеток Купфе-ра показал, что экспрессия HMGB1 в биоптатах печени доноров достоверно отличается (Манн - Уитни, p=0,0036) в группах пациентов с РДТ и без нее после трансплантации печени и была больше у пациентов с РДТ (21 (20;29) кл/мм2), по сравнению с пациентами без РДТ (16 (12; 18)).
Микрофотографии срезов донорских биоптатов печени с различной экспрессией HMGB1, трансплантация которых сопровождалась не-осложненным течением или осложнилась РДТ, представлены на рис. 1, 2.
Данное исследование показало клиническую значимость полиморфизмов гена TLR-4 в возникновении ранней дисфункции трансплантата печени у восточноевропейских пациентов. Из трех изученных последовательностей нуклеотидов ге913930 ассоциирована с развитием ранней дисфункции трансплантата.
На основании полученных данных можно утверждать, что генетические предпосылки реализуются только при возникновении тяжелой формы РДТ с уровнем АСТ и АЛТ более 3000 МЕ в первые сутки после реперфузии. Оба генотипа гена TLR-4 в последовательности ге913930, содержащие минорную аллель С, ассоциированы с риском развития тяжелой РДТ. Нами установлено, что генетическая детерминированность дисфункции включает активацию ядерного белка HMGB1, экспрессию клеток Купфера (CD68) в печени доноров и внутрипеченочную секрецию ^-23 уже через час после портальной реперфузии. Причем все эти процессы предшествуют клинической картине именно тяжелой РДТ.
Полученные данные подтверждают научную гипотезу о том, что ранняя дисфункция трансплантата может быть обусловлена повреждением печени в результате системного воспалительного ответа на смерть мозга и бактериальную транслокацию у умершего донора. Кроме того, помимо фенотипических
и технических РДТ имеет и генетические предпосылки, которые реализуются в результате специфических патологических процессов, характерных для трансплантации.
Критикой данного исследования может выступить небольшое количество наблюдений. Однако дизайн нашего исследования (Fisher exact test с последующим регрессионным анализом) позволяет нам делать обоснованные выводы о том, что генотип гена TLR-4 в последовательности rs913930 ассоциирован с риском ранней дисфункции трансплантата печени и реализуется
через активацию ядерного белка HMGB1, клеток Купфера и ^-23.
Полученные результаты могут лечь в основу объективного метода оценки печеночного трансплантата для установления величины риска возникновения его дисфункции, других осложнений и летальности после операции печени и тем самым способствовать (путем начала ранней специфической терапии) снижению вероятности возникновения и степени тяжести осложнений, сопровождающих трансплантацию. СИ
Статья поступила в редакцию 01.06.2016 г.
А.Е. Щерба1, Д.Ю. Ефимов1, А. М. Кустанович2, А. И. Киреева3, С.В. Коротков1, А.Ф. Минов1, О.А. Лебедь1, А.А. Коритко1, В.В. Шамрук1, А.М. Дзядзько1, О.О. Руммо1
1РНПЦ трансплантации органов и тканей на базе 9-й городской клинической больницы , Минск
2РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии
3Институт генетики и цитологии НАН Беларуси
Summary
The aim of the study - to estimate the associations of genotypes of the clinically essential nucleotide sequences rs11536865, rs913930 and rs5030717 of gene TLR-4 with the risk of emergence of early-stage disfunction of the liver grafts. Early-stage disfunction of graft has genetic background due to polymorphism of gene TLR-4 and it is realised through the activation of HMGB1, Kupffer cells and IL-23.
ff See: http://innosfera.by/2016/08/TLR-4
Литература
1. Deschenes M. Early allograft dysfunction: Causes, recognition, and management. Special Issue // Liver Transplantation. 2013. Vol.19, Issue S2. P. S6-S8.
2. Bezinover D., Kadry Z., McCullough P. et al. Release of cytokines and hemodynamic instability during the reperfusion of a liver graft // Liver Transplantation. 2011. Vol.17, Issue 3. P. 324-330.
3. Deschenes M. Early allograft dysfunction: Causes, recognition, and management. Special Issue // Liver Transplantation. 2013. Vol.19, Issue S2. P. S6-S8.
4. Conti A., Scala S., D'Agostino P. et al. Wide Gene Expression Profiling of Ischemia-Reperfusion Injury in Human Liver Transplantation // Liver Transplantation. 2007. N13. P. 99-113.
5. Wang X., Sun R., Wei H., Tian Z. High-Mobility Group Box 1 (HMGB1)-Toll-Like Receptor (TLR)4-Interleukin (IL)-23-IL-17A Axis in Drug-Induced Damage-Associated Lethal Hepatitis: Interaction of yó-T Cells with Macrophages // Hepatology. 2013. N57. P. 373-384.
6. Howell J., Gow P., Angus P., Visvanathan K. Role of toll-like receptors in liver transplantation // Liver Transplantation. 2014. N20 (3). P. 270-80.
7. Shen X. D., Ke B., Z ha i Y., et al. Absence of toll-like receptor 4 (TLR4) signaling in the donor organ reduces ischemia and reperfusion injury in a murine liver transplantation model // Liver Transplantation. 2007. N13 (10). P. 1435-43.
8. Ellett J. D.,Atkinson C., Evans Z. P. et al. Toll-like receptor 4 knockout mice are protected from endothelial overactivation in the absence of Kupffer cells after total hepatic ischemia/reperfusion // Liver Transplantation. 2011. N17 (9). P. 1089-98.
9. Ellett J. D., Evans Z. P., Atkinson C. Toll-Like Receptor 4 is a Key Mediator of Murine SteatoticLiver Warm Ischemia/Reperfusion Injury // Liver Transplantation. 2009. N15 (9). P. 1101-1109.
10. Oetting W. S., Guan W., Schladt D. P. et al. Donor Polymorphisms of Toll-Like Receptor 4 Associated With Graft Failure in Liver Transplant Recipients // Liver transplantation. 2012. N18. P. 1399-1405.
11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp.
12. Olthoff K. M., Kulik L., Samstein B. Validation of a current definition of early allograft dysfunction in liver transplant recipients and analysis of risk factors // Liver Transplantation. 2010. N16. P. 943-949.
13. Salvalaggio P. R., Felga G. E., Afonso R. C., Ferraz-Neto B. H. Early Allograft Dysfunction and Liver Transplant Outcomes: A Single Center Retrospective Study // Transplantation Proceedings. 2012. N44. P. 2449-2451.
