CC BY
108
УДК 577.19:54.06
РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВАРИАНТА ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА MALDI/TOF/MS С ДРУГИМИ МЕТОДАМИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА РЕЗВЕРАТРОЛА
Д.И. ПИСАРЕВ О.О. НОВИКОВ Г.В. ВАСИЛЬЕВ
Белгородский государственный национальный
исследовательский университет e-mail: [email protected]
Рассмотрен вариант внутреннего стандарта MALDI/TOF/MS в сравнении с другими методами количественного анализа на примере субстанции резвератрола. Установлены очевидные методические и аналитические преимущества масс-спектрометрии при ее реализации предложенным способом.
Ключевые слова: масс-спектрометрия, УФ-спектрофото-
метрия, титриметрия, ВЭЖХ, резвератрол.
Преимущество масс-спектрометрии перед другими методами анализа заключается, в первую очередь, в том, что данный метод на сегодняшний день является наиболее чувствительным из спектроскопических методов молекулярного анализа по сравнению с другими ныне существующими, такими как ЯМР-, ИК-, УФ-спектроскопия. Кроме того, масс-спектрометрия дает возможность проведения анализа за минимальное время с простой пробоподготовкой [1, 2].
Для количественного анализа данным методом можно использовать масс-спектр как таковой. Для этого следует выбрать некоторый пик, принадлежащий определяемому веществу, и измерить его интенсивность.
Однако для того чтобы нивелировать погрешности стадии пробоподготовки и погрешности выхода ионизации, по нашему мнению, необходимо использовать внутренний стандарт.
Для сравнения предлагаемого варианта масс-спектрометрии использованы методики количественного определения резвератрола методами УФ-спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и метод ацетилирования с алкалиметрическим завершением.
Экспериментальная часть Определение резвератрола с помощью спектрофотометрии в ультрафиолетовой области
Для анализа резвератрола методом УФ-спектрофотометрии использовали 0,0004% раствор субстанции резвератрола в спирте этиловом 96%. Для этого около 0,01 г (точная навеска) субстанции резвератрола, помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 96%, перемешивали, доводили объем раствора этим же растворителем до метки и перемешивали.
1,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивали.
Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 306 нм, относительно спирта этилового. Параллельно в аналогичных условиях измеряли 0,0004% раствор стандартного образца (СО) резвератрола в спирте этиловом 96%. Количественное содержание резвератрола определяли по формуле 1:
х = Р х х Щ х Щ
Бст х тх ¥а , (1)
где:
Dх — оптическая плотность испытуемого раствора;
Dсm — оптическая плотность раствора СО резвератрола; то — масса навески стандартного образца резвератрола, г.
Приготовление раствора СО резвератрола
0,01 г (точная навеска) СО резвератрола помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли небольшое количество спирта этилового 96%, перемешивали до полного растворения, объем раствора доводили до метки тем же растворителем (исходный раствор).
1 мл исходного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивали.
Полученные спектры представлены на рис. 1.
Длина волны, нм
а
Длина волны, нм б
Рис. 1. Спектр поглощения резвератрола: а — раствор СО резвератрола, б — раствор субстанции резвератрола
Было проведено 7 параллельных измерений. Результаты статистической обработки определения содержания резвератрола в субстанции представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты количественного определения резвератрола в субстанции методом УФ-спектрофотометрии
№ п/п Масса навески, г Содержание резвератрола (Х), % S дх £,%
1. 0,01 102,5
2. 0,0093 97,0
3. 0,0096 96,9
4. 0,0098 98,5 3,08
5. 0,0094 97,5 1,24 3,05
6. 0,0096 96,5
7. 0,0105 105,0
X = 99,1%
Как видно из данных табл. 1, содержание резвератрола в субстанции составило 99,1±3,05%, относительная ошибка единичного определения с 95% вероятностью находилась в пределах ±3,08%, что укладывается в критерий погрешности, регламентируемый ГФ.
Определение субстанции резвератрола методом ВЭЖХ
Хроматографические исследования проводили на хроматографическом приборе фирмы <Agilent Technologies 1200 Infinity» с автоматическим пробоотборником Agilent 1200, вакуумным микродегазатором, градиентным насосом и термостатом той же серии. Регистрацию полученных данных осуществляли с помощью двух систем детекторов: спектрофотометрического и масс-спектрометрического. Электронные спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометрического детектора с диодной матрицей серии Agilent 1200 (диапазон длин волн от 190 до 950 нм, кювета с длиной оптического пути 10 мм; объемом 13 мкл), шаг сканирования —2 нм.
Для регистрации и обработки спектральных данных и хроматограмм использовали программное обеспечение «Agilent ChemStation».
Испытания проводили с использованием стальных хроматографических колонок, наиболее подходящей из которых оказалась: Reprosil-Pur C18-AQ 150 ммх2 мм, с размером частиц 3 цм.
Для приготовления подвижных фаз использовали растворители: воду сверхчистую (HPLC), спирт этиловый (ч.д.а.), ацетонитрил (HPLC), уксусную кислоту (х.ч.), ортофосфорную кислоту (х.ч.).
Количественное определение субстанции резвератрола осуществляли в градиентном режиме элюирования. В качестве подвижной фазы (А) — 4% водный раствор кислоты фосфорной, (Б) — ацетонитрил. Элюирование проводили в следующих условиях:
Скорость потока: 0,25 мл/мин.
Температура колонки: 35°С.
Давление: 168 bar.
Детекция: 306 нм.
Объем вводимой пробы: 5 цл.
Состав подвижной фазы программировали (табл. 2).
Таблица2
Условия градиентного элюирования резвератрола
Время, мин А,% В,%
0 90 10
2 50 50
7 30 70
Продолжительность анализа составила 15 минут.
Расчет количественного содержания резвератрола проводили по площади полученного пика, которая должна соответствовать площади пика его стандарта по формуле 2:
х = х С„ х Щ х Щ х 100
^ х тх Уа , (2)
где Sх — площадь пика исследуемого вещества;
Sсm — площадь пика стандарта;
Ш, Ш2 — разведения, мл; m — масса навески, г;
Va — объем аликвоты, мл.
Приготовление раствора испытуемого и СО резвератрола Около 0,03 г (точная навеска) СО резвератрола помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, прибавляли 80,0 мл спирта этилового 96%, перемешивали, доводили объем раствора этим же растворителем до метки и снова перемешивали.
5.0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50,0 мл, доводили объем раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивали.
Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографической системы
2.0 мл раствора СО резвератрола выдерживали в течение 5,0 мин на расстоянии 10 см от УФ-ртутной лампы мощностью 250 Вт.
Проверка пригодности хроматографической системы Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
— эффективность хроматографической системы, рассчитанная по пикам резвератрола на хроматограммах раствора СО резвератрола, должна быть не менее 5000 теоретических тарелок;
— относительное стандартное отклонение площадей пиков резвератрола на хроматограммах испытуемого раствора и раствора СО резвератрола должно быть:
для двух параллельных хроматограмм — 0,51%; для трех — не более 1,34%; для четырех — не более 1,92%; для пяти — 2,37%;
— коэффициент разделения пиков цис- и транс-резвератрола на хроматограммах раствора для проверки пригодности хроматографической системы должен быть не менее 1,8.
Хроматограммы субстанции и СО резвератрола представлены на рис. 2.
Было проведено 7 параллельных измерений. Параллельно в аналогичных условиях измеряли 0,0004% раствор СО резвератрола в спирте этиловом 96%. Полученные данные обрабатывали статистически. Результаты исследования количественного определения резвератрола в субстанции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии представлены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты количественного определения резвератрола в субстанции методом ВЭЖХ
№ п/п Масса навески, г Содержание резвератрола (Х), % S дх £,%
1. 0,030 101,0
2. 0,033 98,6
3- 0,036 103,3
4. 0,038 106,4 3,18
5- 0,034 97,3 1,29 3,17
6. 0,036 98,7
7. 0,035 97,2
X = 100,35%
Как видно из данных табл. 3, содержание резвератрола в субстанции составило 100,35±3Д8%/ ошибка единичного определения ВЭЖХ — методики определения субстанции резвератрола с 95% вероятностью находилась в пределах 3,17%, что не превышает установленного в ГФ Х издания критерия погрешности.
Определение резвератрола методом ацетилирования
Для ацетилирования различных фенолов применяют ангидриды уксусной, про-пионовой, стеариновой кислот, 3,5-динитробензольной и некоторые другие. Из этих ацетилирующих реагентов наибольшие распространение получил уксусный ангидрид.
Химическая структура резвератрола близка структуре диэтилстильбестрола, для которого в ГФ X издания предложена методика ацетилирования уксусным ангидридом. Взяв ее за основу и модифицировав, мы разработали и апробировали методику для количественного анализа резвератрола.
Около 0,4 г препарата (точная навеска) помещали в колбу для ацетилирования емкостью 250 мл, прибавляли пипеткой 5 мл раствора уксусного ангидрида в пиридине (3 части безводного пиридина: 1 часть уксусного ангидрида), соединяли колбу с обратным холодильником и нагревали на водяной бане при температуре 70°С в течение 45 минут. Раствор охлаждали, прибавляли через холодильник 25 мл воды очищенной и через 15 минут титровали 0,5Н раствором №ОН, точку эквивалентности фиксировали по изменению окраски индикатора фенолфталеина. Параллельно проводили контрольный опыт. Разность между количеством миллилитров 0,5Н раствора натра едкого, израсходованного на титрование контрольного опыта, и исследуемого раствора пересчитывали на резвератрол. 1 мл 0,5Н раствора NaOH соответствовал 0,038 г резвератрола.
Титр 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена в анализируемом растворе составил:
С.хМ 0,5x228,25x1
Количество З^Д'-тригидрокси-шранс-стильбена в анализируемом растворе рассчитывали согласно формуле 4:
(Уі — У2) х т
—-----—----х 100% , ч
- , (4)
где VI — объем титранта, пошедшего на титрование контрольного опыта, мл; V2
— объем титранта, пошедшего на титрование анализируемого раствора, мл; Т
— титр вещества в анализируемом растворе, г/мл; а — масса навески, взятой на титрование, г.
Результаты количественного определения резвератрола в субстанции методом ацетилирования с последующим алкалиметрическим завершением представлены в табл. 4.
Таблица 4
Результаты количественного определения резвератрола методом ацетилирования
№ п/п Масса навески, г Содержание резвератрола (Х), % S АХ £,%
1. 0,4013 96,26
2. 0,4057 98,84
3. 0,3944 95,68
4. 0,4025 99,11 0,81
5. 0,4007 98,39 2,0 2,04
6. 0,4017 97,04
7. 0,4007 102,12
X = 98,2%
Как видно из данных табл. 4, содержание резвератрола в субстанции, с использованием метода ацетилирования с алкалиметрическим завершением, составило 98,2±2%, ошибка единичного определения при вероятности 95% — 2,04%, что не превышает предела погрешности, регламентируемого ГФ Х издания.
Определение резвератрола методом масс-спектрометрии В качестве аналита использована субстанция природного биологически активного вещества стильбеновой структуры — резвератрола. В качестве внутреннего стандарта использовано производное бензо-у-пирона — кверцетин. Данные вещества друг с
другом не взаимодействуют, имеют четко различающиеся молекулярные массы. Пик резвератрола (т/^ =
228,342) не накладывается на пик квер-цетина (т^ =
303,248), что видно на рис. 2, пики матрицы не мешают определению.
Рис. 2. Масс-спектр резвератрола и кверце-тина при совместном присутствии
В результате количественного определения получены объединенные спектры, на которых наблюдаются интенсивные пики ионов аналита — резвератрола с зарядом иона m/z = 228,3 и пики внутреннего стандарта — кверцетина с зарядом иона m/z = 303,2 (рис. 3).
На приведенном рис. 3 видно, что интенсивность пика иона аналита резверат-рола плавно уменьшается, а внутреннего стандарта кверцетина увеличивается по мере нарастания его концентрации.
Каждую пробу регистрировали 3-кратно и вычисляли среднее значение их интенсивности (I), а также отношения интенсивностей внутреннего стандарта и аналита.
Проба 1 Проба 2
Проба 3
»192
“[Ґ
ulii
Jiádj
il
Проба 4
Рис. 3. Масс-спектры анализируемой смеси
При проведении калибровки также проводили вычисление фактора отклика К по формуле 5:
где Ist—интенсивность пика иона стандарта кверцетина;
Ian — интенсивность пика иона аналита резвератрола;
Cst —количество внутреннего стандарта, нанесённого на мишень;
Can —количество аналита, нанесенного на мишень.
Интенсивности (I) пиков ионов аналита (Ian) и внутреннего стандарта (Ist), а также их отношения приведены в табл. 4.
Таблица 4
Интенсивности пиков ионов аналита и внутреннего стандарта и их отношения в субстанции
ССтандарта, мкг/мл № пробы
1 2 3 4 5 6
0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24
Ist, интенсивность пика стандарта кверцетина, m/z 303,2 896 14586 22819 24163 6848 8381
Ian, интенсивность пика аналита резвератрола, m/z 228,3 3109 20732 23359 21776 4387 4571
Ist/Ian 0,288 0,7035 0,977 1,2 1,56 1,833
Kx, фактор отклика 0,864 1,055 0,976 0,832 0,936 0,916
Для оценки прямолинейности зависимости концентрации внутреннего стандарта от аналитического сигнала (отношение интенсивностей внутреннего стандарта и аналита) построен калибровочный график в координатах Сстандарта, мкг/мл — ЬлДвп. (рис. 4).
Рис. 4. Калибровочный график зависимости концентрации внутреннего стандарта кверцетина от отношения интенсивностей внутреннего стандарта и аналита (резвератрола)
Из приведенного графика следует, что отношение Lt/Ln к концентрации стандартного раствора имеет прямолинейную зависимость. Это указывает на то, что отношение площадей пиков ионов аналита и внутреннего стандарта остается постоянным.
Когда отношение Ist/Ian приближается к единице, это является свидетельством совпадения концентраций внутреннего стандарта и исследуемого вещества. Тогда содержание исследуемого вещества можно найти по приведённому калибровочному графику.
Конечная формула расчета для аналита выглядит следующим образом:
■ , <м
СХ = КХ X
где Кх — фактор отклика;
Cst —количество внутреннего стандарта, нанесенного на мишень;
Ist—интенсивность пика иона стандарта кверцетина;
Ian — интенсивность пика иона аналита резвератрола.
Относительную ошибку определяли в ходе 7 параллельных измерений разных образцов анализируемой смеси. Полученные данные обрабатывали статистически. Результаты статистической обработки определения содержания резвератрола в субстанции методом масс-спектрометрии представлены в табл. 5.
Результаты количественного определения резвератрола в субстанции методом масс-спектрометрии
Таблица 5
_____________________________________________________дЕ____________
№ п/п Масса навески, г Содержание резвератрола (Х),% S є, %
1. 0,102 99,6
2. 0,103 105,6
З. 0,103 105,5
4. 0,102 98,86
5. 0,101 96,8 1,49 3,6 3,66
6. 0,101 96,43
7. 0,102 97,2
X = 100,0%
Как следует из данных табл. 5, относительная ошибка единичного определения методом масс-спектрометрии с вероятностью 95% не превышает 5%, что укладывается в пределы, регламентируемые государственной фармакопеей, и для резвератрола составила ±3,65% (найдено 1,2х10-4±0/0045 мг/мл), что более чем в 30 раз превышает чувствительность методики УФ-спектрофотометрического определения.
Резюме
Таким образом, рассмотрен вариант внутреннего стандарта MALDI/TOF/MS в сравнении с другими методами количественного анализа на примере субстанции резвератрола. Установлены очевидные методические и аналитические преимущества масс-спектрометрии при ее реализации предложенным способом.
Литература
1. Аналитическая химия. Проблемы и подходы : в 2 т : пер. с англ. / под ред. Р. Кельнера, Ж.-М. Мериме, М. Отто, М. Видмера. — М.: Мир; Издательство АСТ, 2004. —Т. 2. — 728 с.
2. Отто, М. Современные методы аналитической химии. 2-е изд., испр. / М. Отто. — М. : Техносфера, 2006. — 416 с.
RESULTS OF COMPARATIVE STUDIES OF MALDI / TOF / MS USING INTERNAL STANDARD WITH OTHER TECHNIQUES OF QUANTITATIVEANALYSIS OF RESVERATROL
D.I. PISAREV O.O. NOVIKOV G.V. VASILIEV
BelgorodNational Research University e-mail: [email protected]
A variant of the internal standard MALDI / TOF / MS in comparison with other methods of quantitative analysis on the example of the substance resveratrol is viewed. Obvious methodological and analytical advantages of mass spectrometry in its implementation by the proposed method are identified.
Key words: mass spectrometry, UV spectrophotometry, titrimetry, HPLC, resveratrol.
