CC BY
46
РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НОВЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОБИОТИКОВ ИРИЛИС И ПАЦИФЛОР
K.M. Мефёд, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Д.С. Давыдов
Кафедра микробиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Пер. Сивцев Вражек, 41, 119002 Москва, Россия
Проведено сравнительное изучение нового ветеринарного пробиотика Ирилис (составлен из биомасс В. subtilis штамма 07 и В, licheniformis штамма 09) in vitro и in vivo и коммерческого пробиотического препарата Пацифлор (изготовленного на основе биомассы В. cereus штамма IP 5832). В результате установлено, что пробиотик Ирилис обладает выраженным антагонистическим воздействием в отношении патогенных и условно патогенных штаммов энтеробактерий, псевдомонад, кандид, стафилококков, низкой адгезивной активностью и абсолютной безопасностью по сравнению с коммерческим препаратом Пацифлор.
Снижение потерь молодняка неонатального возраста от желудочно-кишечных заболеваний инфекционной этиологии является актуальной задачей современной ветеринарии. Эти болезни распространены повсеместно, развиваются в первые часы жизни животного, сопровождаются тяжелыми токсическими явлениями, характеризуются высокой смертностью и наносят значительный экономический ущерб отрасли. Согласно данным статистической отчетности Департамента ветеринарии РФ, патология желудочно-кишечного тракта, клинически проявляющаяся диарей-ным синдромом, в общей структуре заболеваний молодняка достигает 75% [1].
Реальность перспектив запрета на использование антибиотиков в животноводстве и беспокойство по поводу распространения генов антибиотикорезистентности свидетельствуют о необходимости создания новых средств защиты и лечения молодняка от заболеваний желудочно-кишечного тракта [2].
В этой связи уже длительное время внимание ветеринаров и зоотехников привлекают пробиотические препараты, которые, обладая значительной эффективностью и другими достоинствами, выгодно отличаются от антибиотиков отсутствием побочных реакций и осложнений, свойственных последним. В наибольшей степени вышесказанное относится к пробиотикам, созданным на основе аэробных спорообразующих бактерий.
Препараты на основе бактерий рода Bacillus нашли применение в ветеринарной практике для терапии и профилактики желудочно-кишечных и других инфекций. В странах Евросоюза используются препараты Paciflor (его основу составляет В. cereus штамма IP 5832); Toyocerin (основа — В. cereus var toyoi NCIMB-40112/CNCM-1012); BioPlus 2B (основа — В. subtilis штамма DSM 5750 и В. licheniformis штамма DSM 5749) и пр. В последнее время в РФ разработан новый ветеринарный препарат Ирилис, на основе В. subtilis штамма 07 и В. licheniformis штамма 09.
Использование бациллярных препаратов предусматривает предварительное тщательное изучение безопасности применяемых культур и разработку надежных критериев отбора штаммов пробиотиков. В то же время известно, что вирулентность — штаммовый признак, и это диктует необходимость анализа вирулентных свойств каждого штамма, входящего в состав препарата — пробиотика, рекомендуемого для применения в зоотехнии и ветеринарии.
Целью настоящего исследования являлось сравнительное изучение нового ветеринарного пробиотика Ирилис in vitro и in vivo и коммерческого препарата Paciflor.
Материалы и методы. В исследовании использовались лабораторные серии препарата Ирилис и коммерческая серия ветеринарного пробиотика Paciflor .
Культуры выращивали на среде Гаузе №2 при температуре 37°С в течение 96 ч. По окончании инкубации бактериальные клетки ресуспендировали в физиологическом растворе для получения различных концентраций (МО9, НО10, МО12 КОЕ/мл).
При изучении видовой принадлежности штаммов p. Bacillus использовали “Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий p. Bacillus из организма человека и животных” [3].
Исследование безопасности (безвредности, токсигенности, “острой” и “хронической” токсичности, вирулентности) проводили на белых беспородных мышах (б/п) обоего пола массой 10-12 г в соответствии с указанными выше “Методическими рекомендациями” [3] и РД 42-28-8-89 [4]. В частности, острую токсичность культур изучали на мышах при пероральном и внутрибрюшинном введении в дозах 1-109-Ы012 КОЕ/0,5 мл и 0,5-109, МО9, 5-109, МО КОЕ/0,5 мл соответственно. Животные в контрольной группе получали физиологический раствор. Наблюдение за животными проводили в течение 7 сут. Учитывали поведенческие реакции, состояние шерстяного покрова. Через 1 и 7 сут. пять мышей из каждой группы умерщвляли эфиром и проводили макроскопическое исследование внутренних органов. Одновременно с этим отбирали пробы для гистологических и микробиологических исследований.
При исследовании хронической токсичности животным в течение 30 дней ежедневно перорально вводили бактериальные культуры по 10б КОЕ/0,5 мл. По окончании срока наблюдения животных умерщвляли и их органы также подвергали макроскопическому, бактериологическому и гистологическому исследованию.
Для определения устойчивости бактерий к действию биологических жидкостей (желчь медицинская консервированная, желудочный сок «Эквин») суточную культуру смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и доводили концентрацию до 109 КОЕ/мл. В пробирку с 1,0 мл бактериальной взвеси добавляли 9,0 мл биологической жидкости, в контрольную пробирку вносили 9,0 мл ЗФР; все пробирки выдерживали в термостате при 37°С в течение 2 ч, затем определяли количество жизнеспособных клеток методом серийных разведений с высевом на среду Гаузе №2.
Антагонистическую активность (АА) препаратов изучали в отношении 219 патогенных и условно патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов методом отсроченного антагонизма на агаризованной среде Гаузе №2 [5]. Определяли АА по зоне задержки роста (ЗЗР) тест-штаммов (в мм). При этом АА считали нулевой при зоне задержки роста до 5 мм, низкой — при ЗЗР от 5 до 10 мм, средней — от 10 до 15 мм, высокой — от 15 до 20 мм, очень высокой — свыше 20 мм.
Для определения адгезии микробов рода Bacillus к эпителиальным клеткам кишечника мышей использовали методику Осиповой И. Г. и соавт. [6].
Результаты и обсуждение. Исследованные пробиотические культуры существенно различались своими физиолого-биохимическими характеристиками. В. sub-
tilis штамма 07, в отличие от В. licheniformis штамма 09, не проявил способности к росту в анаэробных условиях, что является одним из показателей различной адаптационной возможности культур в разных отделах ЖКТ. Различаются эти культуры и по таким свойствам, как ферментация углеводов, продукция аргининдегидролазы и пр. Изученные культуры, кроме В. cereus штамма IP5832, характеризуются отсутствием гемолитической активности и ферментов агрессии (лецитиназа, гиалуронидаза).
Изучение безвредности и вирулентности показало, что все животные, которым вводили культуры штаммов В. subtilis и В. licheniformis, остались живы; у них отсутствовали какие-либо признаки заболевания. Однако при введении в/б Bacillus cereus штамма IP 5832 мышам в дозе более 0,5-109 КОЕ/0,5 мл пало пять животных.
При изучении токсичности выявлено, что все животные, которым вводили инактивированные согласно “Методическим рекомендациям” культуры штаммов В. subtilis и В. licheniformis, остались живы; у них отсутствовали какие-либо признаки заболевания. Инактивированная культура В. cereus штамма IP 5832 при введении в/б мышам в дозе 0,5-10 КОЕ/0,5 мл вызывала гибель животных.
При исследовании токсигенности показано, что за период наблюдения (5 суток) все животные, получавшие супернатанты штаммов В. subtilis и В. licheniformis, оставались активными, хорошо поедали пищу, прибавляли в массе, их поведенческие реакции не изменялись. Однако введение супернатанта В. cereus штамма IP 5832 вызывало болезнь и гибель животных. Таким образом, проведенные исследования биологической безопасности пробиотических штаммов показали, что В. subtilis штамма 07 и В. licheniformis штамма 09, в отличие от В. cereus штамма IP 5832 не токсичны, не токсигенны, не вирулентны, что позволяет считать их безвредными.
При изучении «острой» и «хронической» токсичности выявлено, что животные всех групп (кроме мышей, которым вводили В. cereus штамма IP 5832) во время периода наблюдения были здоровы, активны, их поведенческие реакции не нарушались, масса тела не снижалась. Не было отмечено каких-либо патологических изменений при макроскопическом изучении внутренних органов животных. Не отличался селезеночный индекс мышей контрольной и опытной групп. Гистологические исследования подтвердили отсутствие изменений в тканях и внутренних органах лабораторных животных. Поскольку определить LD5o не удалось, можно лишь предположить, что данные показатели, если они существуют для штаммов В. subtilis и В. licheniformis, составляют при в/б введении более 10-Ю10 КОЕ/0,5 мл. В то же время в группе животных, которым вводили в/б культуры В. cereus штамма IP 5832 в дозе МО9 КОЕ/0,5 мл, отмечалась тотальная гибель. Гибель 50% мышей имела место при введении той же культуры в дозе 0,5-109 КОЕ/0,5 мл. У выживших животных объективно отмечались: снижение массы тела, вялость, диарея. При макроскопическом исследовании выявлены признаки шоковых реакций, энтерита, неравномерное полнокровие внутренних органов, эмфизематозные изменения в легких, резкое полнокровие печени, кровоизлияния в селезенке, ишемия коры почек. На 7-е сутки интенсивность указанных изменений значительно снизилась.
При бактериологическом исследовании крови и внутренних органов животных установлено отсутствие диссеминации введенных культур, т. е. изучаемые штаммы являются неинвазивными. Таким образом, длительное пероральное введение изучаемых пробиотических штаммов В. subtilis и В. licheniformis является безопасным, поскольку не приводит к развитию осложнений.
В связи с тем, что бактерии, попадая в ЖКТ, подвергаются воздействию биологических жидкостей, следующим этапом нашей работы было изучение чувствительности штаммов бактерий рода Bacillus к действию желудочного сока и желчи.
Результаты, представленные в табл. 2 свидетельствуют, что более высокая резистентность к желудочному соку отмечена у В. НсЬешАотив штамма 09, а к желчи -у В. виМИв штамма 07. В. сегеив штамма 1Р5832 оказались более чувствительны к желчи и желудочному соку (табл. 2).
Таблица 2
Устойчивость бацилл к воздействию желудочного сока и желчи
Штамм Количество жизнеспособных клеток, lg КОЕ/мл
исходное после 2 ч экспозиции
в желудочном соке в желчи контроль (ЗФР)
В. subtilis 07 9,0 5,0-6,0 8,0 9,0
В. licheniformis 09 9,0 8,0 5,0-6,0 9,0
В. cereus IP 5832 9,0 5,0 5,0-6,0 9,0
Антагонистическая активность является очень важной характеристикой пробиотических штаммов. В связи с этим проведено сравнительное изучение АА Ирилиса и Пацифлора. При этом особое внимание было уделено изучению воздействия этих биопрепаратов на тест-культуры, полирезистентные к антибиотикам, а также на те виды условно-патогенных микроорганизмов, в отношении которых неэффективны другие известные пробиотики.
Полученные данные свидетельствуют о том, что Ирилис характеризуется высокой АА в отношении стафилококков, энтерококков, эшерихий, клебсиел и кандид, выделенных от животных. Следует отметить, что Пацифлор не оказывал антагонистического воздействия на тест-штаммы (табл. 3).
Таблица 3
Антагонистическая активность пробиотиков из бацилл
Тест-культура Количество тест-штаммов Количество штаммов, чувствительных к пробиотикам
Ирилис Пацифлор
Escherichia coli 20 20 0
Klebsiella pneumoniae 29 10 0
Serratia marcescens 11 И 0
Proteus vulgaris 18 18 0
Proteus mirabilis 19 19 0
Staphylococcus aureus 25 25 0
Pseudomonas aeruginosa 8 3 0
Candida albicans ЗО 30 0
Entherococcus spp. 22 22 0
Следующим этапом исследований было сравнительное изучение адгезивной активности штаммов из рода Bacillus к эпителиальным клеткам кишечника мышей (энте-роцитам и колоноцитам). В результате было обнаружено, что В. subtilis штамма 07 обладает низкой адгезивностью, хотя имеют больше адгезинов к рецепторам энтероци-тов. В. licheniformis штамма 09 проявляют средний уровень адгезивной активности как к энтероцитам, так и к колоноцитам, однако лучше адгезируют к колоноцитам. В. сег-eus штамма IP5832 проявляет высокий уровень адгезивности к энтероцитам и слабый к
колоноцитам. В связи с этим уместно отметить, что в отличие от В. subtilis штамма 07 и В. licheniformis штамма 09, В. cereus штамма IP5832 характеризуется гемолитической активностью. К изложенному следует добавить, что проведенные научным комитетом по питанию животных при европейской комиссии исследования, выявили у В. cereus штамма ГР 5832 способность к продукции энтеротоксинов НЫ и Nhe. Таким образом, В. cereus штамма IP 5832, входящий в коммерческий препарат Пацифлор обладает выраженными вирулентными свойствами.
Подводя итог результатам исследований можно отметить, что пробиотик Ири-лис обладает рядом преимуществ перед препаратом Пацифлор, таких как выраженное антагонистическое воздействие на патогенные и условно патогенные штаммы, равно как и абсолютная безопасность препарата.
ЛИТЕРАТУРА
1 .Малик Н.И Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения: Автореф. дисс... док. биол. наук. — М., 2002.
2. Huynh A. Hong, Le Hong Due, Simon M. Cutting. The use of bacterial spore formers as probiotics.//FEMS Microbiology Review. — 2005. — № 29. — P. 813-835.
3. Смирнов В. В., Резник С. Р., Сорокулова И. Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных. — Киев: АН УССР, 1983.
4. РД 42-28-8-89. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. — М.: Минздрав СССР, 1989. — Введ. 10.04.89.
5. ФСП 42-0370327802 на Биоспорин.
6. Осипова И.Г., Сорокулова КБ., Терешкина Н.В. и др. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков //Журнал микробиологии. — 1998. — № 6. — С. 68-70.
THE RESULTS OF THE COMPARATIVE STUDY OF NEW VET PROBIOTICS IRILIS AND PACIFLOR
K.M. Mefoyd, I.G. Osipova, E.A. Vasilyeva, D.S. Davidov
Department of Microbiology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya St., 8, 117198 Moscow, Russia
Tarasevich Institute.
Sivcev Vragekst., 41, 119002 Moscow, Russia
The aim of the study was to evaluate the comparative research of the new vet probiotic Irilis (consists of biomass B. subtilis 07 and B. licheniformis 09) in vitro and in vivo and commercial probiotic Paciflor (prepared on the base of strain B. cereus IP 5832). The study demonstrated that the strains B. subtilis 07 and B. licheniformis 09, ingredients of Irilis unlike B. cereus IP 5832 (Paciflor) were not toxic, toxigenic, or virulent. It is also demonstrated high antagonistic activity of Irilis against many bacteria of different taxonomic groups, and Candida, as compared with Paciflor. Besides this, the study showed that unlike Paciflor, Irilis characterized by relatively low adhesive ability and absence of virulence factors.
