CC BY
55
УДК 159.9.07 ББК 55.5
РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗРАБОТКИ ПРОТОКОЛА ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЗАДНЕГО ЭПИТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ ЧЕЛОВЕКА
КАЗАНЦЕВ АД12, ОСТРОВСКИЙ Д.С.13, БОРЗЕНОК С.А.14 1 ФГАУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова"Минздрава России, Москва,
Россия
2 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет),
Москва, Россия
3 ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия 4 ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: antonkaz0404@gmail. com
Аннотация
В статье описана методика изоляции клеток эндотелия роговицы человека, выделенных из корнеосклеральных дисков доноров, и методика их культивирования. Культивирование клеток осуществляли в течение 48 суток. Подсчет и оценку фенотипа осуществляли с использованием инвертированного микроскопа.
Ключевые слова: эндотелий роговицы, культивирование, популяция клеток, выделение, культура клеток, исследования in vitro.
Актуальность. Эндотелиальный слой является самым внутренним из всех слоев роговицы и представлен однослойным плоским эпителием. Клетки данного вида своей базальной поверхностью прикреплены к десцеметовой мембране с помощью цитоплазматических выростов, а их апикальная часть омывается водянистой влагой. Характер межклеточных взаимодействий и
внутриклеточной организации обуславливают роль эндотелиального слоя в поддержании гидробаланса роговицы и, как следствие, ее прозрачности [1]. Данный монослой характеризуется ограниченным регенераторным потенциалом, и закрытие деффектов монослоя, возникших в результате запрограммированной или травматической гибели клеток, осуществляется главным образом за счет растяжения клеток и их миграции [3, 5]. В норме in vitro клеточный цикл клеток эндотелия роговицы человека заблокирован в фазе G1, однако существуют экспериментальные данные о возможности перевода клеток данного фенотипа в фазу S клеточного цикла ex vivo [6, 7, 8]. На протяжении последних трех десятилетий ученые всего мира ставили перед собой задачу получить популяцию клеток эндотелия роговицы человека in vitro. В ряде работ исследователям удалось получить первичную культуру клеток, близких по
морфологии к клеткам эндотелия роговицы, и подтвердить их фенотип. Однако в этих же работах наряду с клетками эндотелиального фенотипа в других опытных группах при идентичной методике изоляции и условиях культивирования были получены клетки с измененным фенотипом, при этом разницу в результатах в опытных группах исследователи объяснить не смогли [9]. Изоляция клеток и их культивирование являются первыми и наиболее важными этапами клеточно-инженерной стратегии. Этап изоляции клеток несет в себе задачи не только выделить клетки, но и простимулировать их деление, не индуцируя при этом эпителиально-мезенхимальную трансформацию и апоптоз. Использование исследователями различных методик изоляции клеток и составов питательных сред обосновывает необходимость
усовершенствования методов получения первичных культур роговичного эндотелия и формирование стандартного протокола выделения и культивирования клеток. Кроме того, актуальность данной работы обусловлена перспективой возможного улучшения понимания механизмов стимуляции деления и эпителиально-мезенхимальной пластичности при получениии клеток эндотелия роговицы кадаверных глаз человека. В работе использовалась методика изоляции и
культивирования, подобранная авторами ранее в качестве наиболее эффективной [2].
Цель работы. Разработка протокола получения культуры клеток заднего эпителия роговицы кадаверных глаз человека, способной к длительному пассированию.
Материалы и методы. В исследовании использовались корнеосклеральные диски непригодные для использования при трансплантации роговицы. Корнеосклеральные диски были выделены из глаз трупов доноров и предоставлены глазным тканевым банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России с соблюдением этических правил и норм. Изоляция и культивирование клеток производили по протоколу, описанному ранее [2]. Комплекс клеток эндотелия роговицы человека с десцеметовой мембраной был выделен из склерально-роговичных фрагментов при помощи скальпеля и пинцета под микроскопом с отступом 2 мм от линии Швальбе. Полученный комплекс помещали в чашки Петри 35 мм (SPL). Культивирование проводилось в среде с добавлением DMEM F12/199 = 1:1, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% раствора антибиотиков, L-глютамина - 6 ммоль/мл, фактора роста фибробластов - 10 нг/мл, гепарина, фактора роста эндотелия - 5 нг/мл, при стандартных условиях. Смену среды проводили каждые 2 суток. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлюэнтности осуществляли пассирование культуры c использованием раствора трипсина. Плотность клеток при рассеве составляла не менее 300000 кл/мл. Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием стандартного метода окраски на трипановый синий и камеры Горяева. Фазово-контрастный контроль и подсчет количества клеток в ходе культивирования осуществлялся на
инвертированном микроскопе «ix81 Olympus». Изучались процессы поведения клеток эндотелия на сроках культивирования до 2 месяцев, а также их эпителиально-мезенхимальная пластичность.
Результаты исследования. Была получена популяция клеток. Поведение клеток отличалось высокой скоростью адгезии к стандартной культуральной поверхности. Отмечался рост клеток, расположенных локально рядом с десцеметовой мембраной. На 2 сутки визуализировались единичные клетки, прикрепленные к поверхности культурального
пластика. Клетки с фенотипом резко отличным от фенотипа клеток заднего эпителия роговицы человека не визуализировались. На 3 сутки отмечалось наличие округлой колонии клеток гексагональной формы (рис. 1). На периферии пласта клетки гексагонального фенотипа сменялись клетками с более вытянутым фенотипом, что может указывать на начало эпителиально-мезенхимальной пластичности (рис. 2). На 4 день культивирования наблюдалась 80-90% конфлюэнтность. Эпителиально-мезенхимальный переход в культурах отмечался уже по достижению конфлюэнтности 90%. Спустя 2 месяца культивирования количество плоских гексагональных клеток в поле зрения составляло 90,4±6,5%. Клетки сохраняли эпителиальный пассаж вплоть до 5 пассажа.
Рис. 2. Клетки, претерпевшие эпителиально-мезенхимальную трансформацию, слева от клеток с нормальным фенотипом.
Выводы. Разработанный протокол выделения клеток являетя эффективным и позволяет изолировать клетки заднего эпителия роговицы кадаверных глаз человека без заноса в культуру клеток другого типа и простимулировать их деление.
Незначительное количество клеток мезенхимальной морфологии в первичной культуре говорит о слабой выраженности
процесса эпителиально-мезенхимальной
трансформации при использовании данного протокола выделения. Помимо этого быстрая адгезия клеток к поверхности культурального пластика и большое количество гексагональных клеток в первичной культуре говорит о возможности использования данного протокола в дальнейших исследованиях.
Условия культивирования и компоненты среды являются оптимальными для поддержания жизнеспособности культуры, что подтверждается количественной оценкой конфлюэнтности в культуре клеток.
Полученные результаты коррелируют с результатами других исследователей, использовавших данную методику выделения
клеток [7, 8]. Компоненты использовавшейся для культивирования среды являются наиболее часто использующимися для формирования питательных сред в работах других исследователей, сумевших получить хорошие результаты.
Актуальность дальнейших исследований в данной облиста лежит в формировании протокола субкультивирования клеток заднего эпителия роговицы человека.
Протокол выделения и культивирования клеток заднего эпителия роговицы из кадаверных глаз человека, использовавшийся в данной работе, видится как оптимальный и может использоваться в дальнейших работах по данной тематике.
Список литературы
1. Вит В.В. Строение зрительной системы человека /В.В. Вит - 2003. - Одесса: Астропринт. - с. 178-180.
2. Казанцев А.Д. Изучение экспериментальных методов выделения и культивирования клеток эндотелия роговицы человека: / А.Д. Казанцев, Д. С. Островский, М.Ю. Герасимов и др. // Российская офтальмология онлайн. 2017. № 4. URL: http://www.eyepress.ru/article.aspx?24737. (Дата обращения 17.11.2017).
3. Bonanno J.A. Identity and regulation of ion transport mechanisms in the corneal endothelium / J.A. Bonanno // Prog Retin Eye Res. - 2003. - Amsterdam: Elsevier. - p. 69-94
4. Chen K. Cornea Transplantation of Adult Human Corneal Endothelium Ex Vivo: A Morphologic Study / K. Chen, D. Azar, N. Joyce // Cornea. - 2001. - New York: Ovid. - p. 731-737
5. Fischbarg J. An update on corneal hydration control / J. Fischbarg, D.M. Maurice //Exp. Eye. Res. - 2004. - Amsterdam: Elseveir. - p. 537-541
6. Joyce N.C. Cell cycle status in human corneal endothelium /N.C. Joyce //Exp. Eye. Res. - 2005. - Amsterdam: Elseveir. -p. 629-638
7. Joyce N. C. Human corneal endothelial cell proliferation: potential for use in regenerative medicine / N. C. Joyce, C. C. Zhu // Cornea. - 2004. - New York: Ovid. - p. 8-19
8. McAlister J.C. Induction of replication in human corneal endothelial cells by E2F2 transcription factor cDNA transfer / J. C. McAlister, N.C. Joyce, D.L. Harris et. al. // IOVS. - 2005. - Charlottesville: Silverchair. - p. 597-603
9. Okumura N. Cell Surface Markers of Functional Phenotypic Corneal Endothelial Cells /N. Okumura, H. Hirano, R. Numata et. al. // IOVS. - 2016. - Charlottesville: Silverchair. - p. 7610-7618
EXPERIENCE OF A NEW METHOD OF ISOLATION AND CULTIVATION OF HUMAN
CORNEAL ENDOTHELIAL CELLS EX VIVO
KAZANTSEVA.D.1'2, OSTROVSKIYD.S13, BORZENOK S.AJ-4 1S. Fyodorov Eye Microsurgery Complex Federal State Institution, Moscow, Russia 2 Sechenov University, Moscow, Russia 3 FSBSIIGPP, Moscow, Russia 4Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov Moscow, Russia
e-mail: [email protected]
Abstract
This article describes the experience of usage of novel technique of isolation of Human cadaveric eye corneal endothelial cells from corneascleral rings and it's cultivation. Cells were cultivated during 48 days. Cell counting and cell phenotype analysis were made using the inverted microscope.
Keywords: human corneal endothelial cell, cell population, cultivation, isolation, cell culture, in vitro.
