CC BY
44Морфология. Патология
УДК 616.62
РЕЗУЛЬТАТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СТЕНКИ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПРИ ИНТЕРСТИЦИАЛЬНОМ ЦИСТИТЕ/СИНДРОМЕ БОЛЕЗНЕННОГО МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
© 2019 Р.Ф. Шолан
Республиканский Лечебно-диагностический центр МЗ Азербайджанской Республики, Баку, Азербайджан
Этиология интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пузыря (ИЦ/СБМП) не до конца выяснена. Для лучшего понимания патофизиологии заболевания созданы экспериментальные модели животных. Гистопатологические особенности могут играть важную роль в прогнозирующем моделировании симптомов ИЦ/СБМП. Проведено гистологическое исследование клеток слизистой мочевого пузыря в 4-х экспериментальных моделях ИЦ/СБМП. Исследование проведено на 37 кроликах-самках. Животным вводили в полость мочевого пузыря протамин сульфат (1 группа); в стенку мочевого пузыря мочу, взятую из мочевого пузыря животного (2 группа); в стенку мочевого пузыря 0,9 % раствор №С1 (3 группа), ничего не вводили (4 группа). Через 14 дней после моделирования кроликов умерщвляли пентобарбиталом в дозе по 200 мг/ кг, затем их рассекали с помощью трансабдоминального разреза по средней линии и производили цистэктомию, готовили биоп-таты и срезы. Инфильтрацию клеток оценивали с помощью шкалы: 0 - нет экстраваскулярных лейкоцитов и тучных клеток; 1 - менее 20 лейкоцитов и тучных клеток; 2 - 20-45 лейкоцитов и тучных клеток; 3 - более 45 лейкоцитов и тучных клеток. Баллы всех 10 срезов складывали, делили на 30 (максимально возможный балл) и умножали на 100. Баллы по лейкоцитам и тучным клеткам для каждого мочевого пузыря были средними из 3 исследованных сечений. Подсчет лейкоцитов и тучных клеток проводили при оптическом увеличении х 200. Среднее число всех типов лейкоцитов в 1 группе превышал таковой в остальных группах (р < 0,001). Тучные клетки определялись в 1 и 2 группах, во 2 группе их количество было в 24,9 раза выше (р <0,001), чем в 1 группе. У животных 1 группы отмечалась воспалительная инфильтрация лимфоцитов и нейтрофилов. Во 2 группе воспалительная инфильтрация ассоциировала с большим числом тучных клеток. В гистограммах животных 3 группы выявлялся отек, единичные элементы воспаления. У животных с химической моделью выявлена пролиферация воспалительных клеток, у животных с токсической моделью - пролиферация и активация тучных клеток.
Ключевые слова: интерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря, экспериментальные модели, лейкоциты, тучные клетки, пролиферация.
Введение. Интерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря (ИЦ/СБМП) является распространенным расстройством, которое, по различным данным, встречается приблизительно в 16 % случаев [1, 2, 3]. Поскольку ИЦ/СБМП диагностируется при отсутствии бактериальной инфекции или явной патологии, этиология симптомов остается неизвестной. Предполагают, что гистопатологические особенности могут играть важную роль в прогнозирующем моделировании симптомов ИЦ/СБМП [4]. Для лучшего понимания его патофизиологии были созданы модели животных с ИЦ/СБМП [5]. За последние несколько десятилетий было разработано около 20 моделей на животных, характеристики которых аналогичны характеристикам фенотипа ИЦ/СБМП [6, 7]. Большинство моделей животных
были получены путем инъекции химических токсинов или стимуляторов в мочевой пузырь или путем системного введения химических агентов, вирусов или антигенов, которые вызывают воспаление мочевого пузыря [5]. Сообщается, что невозможно эффективно охарактеризовать ИЦ/СБМП у людей с использованием одной модели, в связи с чем исследование проводится на моделях, которые широко используются для отражения характеристик пациентов с этим заболеванием [5, 7].
В нескольких сообщениях указывалось, что в образцах мочевого пузыря с ИЦ/СБМП наблюдается увеличение количества инфильтрованных тучных клеток, причем они активные, так как частично или полностью дегранулированы [8, 9]. Увеличение числа клеток и активация тучных клеток в мочевом пузыре позволило предположить, что тучные клетки в слизистой оболочке являются одним из основных показателей, связанных с этиологией ИЦ/СБМП. Однако для подтверждения правильности использования тучных клеток в качестве биомаркера этого заболевания нужно проведение дальнейших исследований.
Таким образом, не определив патофизиологию и течение ИЦ/СБМП, невозможно достичь адекватной терапии.
Цель исследования - гистологическое исследование клеток слизистой мочевого пузыря в различных экспериментальных моделях интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пузыря.
Материалы и методы исследования. Для моделирования ИЦ/СБМП использованы 37 белых новозеландских кроликов-самок массой 1500-2000 г. При содержании животных и проведении экспериментальных исследований соблюдали правила по уходу и использования лабораторных животных (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) и их соблюдением [10].
Для получения моделей ИЦ/СБМП в мочевой пузырь закапывали различные раздражители, на основании чего животных разделили на 4 группы. Животным 1 группы (n = 7) в полость мочевого пузыря вводили протамин сульфат; животным 2 группы (n = 15) вводили в стенку мочевого пузыря мочу, взятую из мочевого пузыря животного [11]; животным 3 группы (n = 7) вводили в стенку мочевого пузыря 0,9 % раствора NaCl и животным 4 группы (n = 8) ничего не вводили.
Через 14 дней после моделирования кроликов умерщвляли пентобарбиталом в дозе по 200 мг/ кг, после чего их рассекали с помощью трансабдоминального разреза по средней линии и производили цистэктомию. Извлеченный мочевой пузырь фиксировали в 10 %-м буфере нейтрального раствора формалина в течение суток. На следующий день образец исследовали макроскопически. После были выполнены параллельные срезы толщиной 0,3-0,4 см, что позволяло видеть одновременно все слои стенки мочевого пузыря. Затем, с целью фиксации, полученные образцы в течение 24 часов содержали в 10 % буфере нейтрального раствора формалина. В последующие дни для обезвоживания образцов проводилась проводка в растворах спирта в концентрациях 75 %, 85 %, 95 % и 99,9 %. Впоследствии образцы содержались в растворе ксилола и заключались в парафин, сформированы и приготовлены гистологические блоки. Полученные блоки нарезаны с помощью микротома толщиной 3-5 микрон (Leica RM 2125 RTS, Германия). Срезы окрашивали стандартным окрашиванием гематоксилин-эозином и для выявления тучных клеток - Мей-Грюнвальда Гимзы (Merck, Германия) [12]. Подготовленные микропрепараты микроскопировали с помощью светового микроскопа (Leica DM 750, Германия). Все изменения, наблюдаемые во время микроскопического исследования, регистрировали с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу
(Leica ICC 50, Германия). Последовательно были просмотрены 10 полей зрения микропрепарата при большом увеличении и подсчитаны нейтрофилы, эозинофилы и тучные клетки. Инфильтрацию клеток оценивали в каждом из этих участков с помощью следующей шкалы: 0 - нет экстраваскулярных лейкоцитов и тучных клеток; 1 - менее 20 лейкоцитов и тучных клеток; 2 - 20-45 лейкоцитов и тучных клеток; 3 - более 45 лейкоцитов и тучных клеток. Баллы всех 10 срезов складывали, делили на 30 (максимально возможный балл) и умножали на 100. Баллы по лейкоцитам и тучным клеткам для каждого мочевого пузыря были средними из 3 исследованных сечений. Подсчет лейкоцитов и тучных клеток проводили при оптическом увеличении х 200 [13].
Статистические расчеты осуществлены в программе Excel 2016 (SPSS 15.0). Для каждой группы были рассчитаны среднее значение и стандартная ошибка.
Результаты. В ткани мочевого пузыря животных исследуемых групп статистически значимый уровень лейкоцитов выявлялся у животных 1 и 2 группы (табл. 1).
Таблица 1
Среднее количество популяции лейкоцитов в группах исследования
Группы Тип клеток
Нейтрофилы Лимфоциты Эозинофилы Тучные клетки
1 (n = 7) 23,857 ± 5, 4592*,** 14,428 ± 4,117* 3,285 ± 1,133*,** 0,571 ± 1,133*
2 (n = 15) 0,866 ± 1,884* 29,866 ± 10,183*,** 0,333 ± 0,899 14,200 ± 5,796*,**
3 (n = 7) 1,428 ± 2,699* 2,285 ± 3,728* 0,142 ± 0,377 0
4 (n = 8) 0 0,375 ± 1,060 0,375 ± 0,744 0
Примечание: * - статистическая значимость различий с контрольной (4) группой;
** - между группами исследования (р < 0,05-0,001)
Среднее число всех типов лейкоцитов в 1 группе статистически значимо превышало таковой в остальных группах (р < 0,001). Тучные клетки определялись лишь в 1 и 2 группах. При этом во 2 группе их количество было в 24,9 раза выше (р < 0,001), чем в 1 группе.
Морфологические исследования стенки мочевого пузыря контрольных животных выявили отсутствие изменений (микрофото 1).
Гистологический анализ выявил в стенке мочевого пузыря животных после инъекции протамин сульфата (1 группа) инфильтрацию лимфоцитов и нейтрофилов в области сосудов (микрофото 2 а, б).
В микропрепаратах животных с токсической моделью ИЦ/СБМП, полученной путем введения мочи в стенку мочевого пузыря, определялись некроз, скопления гемосидерина и смешанная воспалительная инфильтрация (микрофото 3, а), а также тучные клетки (микрофото 3, б).
В микропрепаратах модели ИЦ/СБМП, созданной введением 0,9 % ШО, определялись рассеянные лимфоциты и отек ткани (микрофото 4).
Как видно, у животных 1 группы отмечалась воспалительная инфильтрация лимфоцитов и нейтрофилов. В гистограммах стенки мочевого пузыря животных 2 группы воспалительная инфильтрация ассоциировала с большим числом тучных клеток, выявленных при подсчете. В гистологических препаратах 3 группы выявлялся отек, возможно, это ответная реакция на инъекцию, но воспалительной инфильтрации не наблюдалось, встречались лишь единичные элементы воспаления, что ассоциировало с подсчетом клеточных элементов.
Микрофото 1. Гистограмма животных группы контроля. Стенка мочевого пузыря без изменений (увеличение х40, окрашивание гематоксилин-эозином)
Микрофото 2а. Гистограмма опытных животных после введения в полость мочевого пузыря протамин сульфата. Инфильтрация лимфоцитов и нейтрофилов вокруг сосудов в стенке мочевого пузыря (увеличение х 100, окрашивание гематоксилин-эозином)
Микрофото 2б. Гистограмма опытных животных после инъекции в полость мочевого пузыря протамин сульфата. Инфильтрация лимфоцитов в ткани мочевого пузыря (увеличение х100, окрашивание гематоксилин-эозином)
Микрофото 3а. Гистограмма стенки мочевого пузыря после инъекции мочи в стенку мочевого пузыря. Скопления гемосидерина и смешанная воспалительная инфильтрация (увеличение х100, окрашивание гематоксилин-эозином)
Микрофото 3б. Гистограмма животных с токсической моделью ИЦ/СБМП, полученной введением мочи в стенку мочевого пузыря. Инфильтрация тучных клеток в стенке мочевого пузыря (увеличение ><400, окрашивание Мэй-Грюнвальд Гимза)
Микрофото 4. Гистограмма животных модели ИЦ/СБМП, полученной введением 0,9 % в стенку мочевого пузыря. На фоне отека одиночные лимфоциты (увеличение х40, окрашивание гематоксилин-эозином)
Обсуждение. В настоящем исследовании представлены результаты определения популяций лейкоцитов в ткани мочевого пузыря животных с различными вариантами моделирования ИЦ/СБМП. Выявлено, что инфильтрация тучных клеток определялась в химической модели (протамин сульфат) и модели с мочевой токсичностью (введение мочи в стенку мочевого пузыря). При этом у животных с моделью мочевой токсичности активность тучных клеток статистически значимо превосходила 1 вариант модели (р < 0,001).
Следует отметить, что тучные клетки в настоящее время признаны регуляторными и эф-фекторными клетками как врожденного, так и адаптивного иммунитета [14]. Их функции зависят от их способности реагировать на самые разнообразные стимулы и секретировать биологически активные продукты с провоспалительными, противовоспалительными и/или им-мунодепрессивными свойства. Тучные клетки играют важную роль в аллергическом воспалении. Как врожденные иммунные защитники, тучные клетки распознают микробные агенты (бактериальные, вирусные, паразитарные и грибковые) и эндогенные факторы, возникающие в результате повреждения клеток [14]. Вероятно, этим и объясняется отсутствие инфильтрации тучных клеток у кроликов 3 и 4 групп обследования. В то же время статистически значимая активность тучных клеток во 2 группе может свидетельствовать о том, что при этом варианте моделирования повреждение уроэпителия мочевого пузыря более сильное и тучные клетки реагируют в ответ на повреждение высокой инфильтрацией.
Универсальность тучных клеток подразумевает, что они могут быть активированы различными механизмами. Считается, что тучные клетки играют важную роль в ИЦ/СБМП, поскольку во многих случаях наблюдается увеличение количества тучных клеток в мочевом пузыре [14]. Исследования на животных показали, что тучные клетки незаменимы для развития воспаления мочевого пузыря и боли, наблюдаемой при ИЦ/СБМП [3, 15].
Согласно нашим данным, тучные клетки в ткани мочевого пузыря существенно активизировались под воздействием мочевой токсичности. Возможно, это связано с тем, что основная функция мочеполовой системы заключается в выделении большого количества токсических веществ из организма. Мочевой пузырь играет важную роль, резервируя, удерживая и выделяя мочу. Конечные продукты обмена веществ и токсины выводятся вместе с мочой из организма. Дополнительное потребление этих веществ может привести к нарушениям функционирования мочевого пузыря [14, 16]. Нарушение барьерной функции уротелиального слоя позволяет токсичным веществам из мочи проходить в ткани [5]. Именно это мы наблюдали при модели ИЦ/СБМП, полученной путем введения в стенку мочевого пузыря мочи, взятой из мочевого пузыря животного.
В проведенном нами исследовании экспериментальные группы с введением в полость мочевого пузыря протамин сульфата (1 группа), а также введением мочи, взятой из мочевого пузыря животного, в стенку мочевого пузыря (2 группа) показали высокий уровень экспрессии воспалительных элементов, повышенную инфильтрацию лимфоцитов и нейтрофилов. В то же время при втором варианте гистологическое исследование показало наличие в стенке мочевого пузыря инфильтратов тучных клеток, которые в свою очередь вызывали воспаление, о чем свидетельствовал развивающийся некроз в стенке мочевого пузыря животных 2 группы. Полученные нами результаты сопоставимы с данными G.R. Sant et я1. [2007], которые считают, что пролиферация тучных клеток является основной особенностью аутоиммунной мышиной модели интерстициального цистита.
Заключение. Проведенное исследование показало повышение количества воспалительных клеток в слизистой стенке мочевого пузыря у животных с химической моделью
ИЦ/СБМП и тучных клеток у животных с токсической моделью ИЦ/СБМП. Гистологический анализ выявил пролиферацию лимфоцитов при химическом варианте модели
ИЦ/СБМП и активацию тучных клеток при токсическом повреждении целостности мочевого
пузыря.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 McLennan MT. Interstitial cystitis: epidemiology, pathophysiology, and clinical presentation. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 2014;41:385-395. doi: 10.1016/j.ogc.2014.05.004
2 Mirkin YaB, Karapetyan AV, Shumov SYu. Interstitsial'nyy tsistit: diskussiya o patogeneze, diagnostike i lechenii. Chast' 1 - patogenez. Eksperimental'naya i klinicheskaya urologiya 2017;4:96-100. (In Russian)
3 Onopko VF, Kirilenko EA, Baranova EO, Golubeva VS. Interstitsial'nyy tsistit ili sindrom boleznennogo mo-chevogo puzyrya: sovremennyy vzglyad na problemu. Acta Biomedica Scientifica 2016;1(1):65-69. https://doi.org/10.12737/21489
4 Birder L., Andersson K-E. Animal Modelling of Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome. Int Neurourol J. 2018;22(Suppl 1):S3-59. doi: https://doi.org/10.5213/inj.1835062.531
5 Bjorling DE, Wang ZY, Bushman W. Models of inflammation of the lower urinary tract. Neurourol Urodyn 2011;30:673-682. doi: 10.1002/nau.21078
6 Buffington T., Ruggieri M.R., Klumpp D. Interstitial cystitis: Animal models. In Bladder Pain Syndrome - An Evolution. Springer International Publishing 2017:33-36. https://doi.org/10.1007/978-3-319-61449-6_6
7 Kwon W-A. Animal Model of Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome. Int Neurourol J. 2018;22(Suppl 1):S1-2. https://doi.org/10.5213/inj. 1820edi.001
8 Fang Z, Xu K. Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome: a Review and an Update. Current Bladder Dysfunction Reports 2016;11(4):391-398. https://doi.org/10.1007/s11884-016-0387-y
9 Liu H-T, Kuo H-C. Biomarkers for patients with interstitial cystitis/bladder pain syndrome. Urological Science 2015;26(4):225-229. https://doi.org/10.1016/j.urols.2015.02.002
10 National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. Washington (DC): National Academies Press (US); 2011. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. 246 р. DOI: https://doi.org/10.17226/12910
11 Sand PK. Proposed pathogenesis of painful bladder syndrome/interstitial cystitis. J Reprod Med. 2006;51(3 Suppl):234-240.
12 Mutsaddi S, Kotrashetti VS, Nayak RS, Pattanshetty SM. Comparison of histochemical staining techniques for detecting mast cells in oral lesions. Biotech Histochem 2019;15:1-10. https://doi.org/10.1080/10520295.2019.1597986
13 Bayrak O., Seckiner I., Solakhan M., Karakok M., Erturhan S.M., Yagci F. Effects of intravesical dexpanthenol use on lipid peroxidation and bladder histology in a chemical cystitis animal model. Urology 2012;79:1023-1026. DOI: 10.1016/j.urology.2012.01.025.
14 Wang X., Liu W., O'Donnell M. et al. Evidence for the Role of Mast Cells in Cystitis-Associated Lower Urinary Tract Dysfunction: A Multidisciplinary Approach to the Study of Chronic Pelvic Pain Research Network Animal Model Study. PLoS ONE 2016;11(12):e0168772. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0168772
15 Sant GR, Kempuraj D, Marchand JE, Theoharides TC. The Mast Cell in Interstitial Cystitis: Role in Pathophysiology and Pathogenesis. UROLOGY 2007;69 (Suppl 4A): 34 -40.
16 Dahlin JS, Hallgren J. Mast cell progenitors: origin, development and migration to tissues. Mol. Immunol 2015;63:9-17. doi:10.1016/j.molimm.2014.01.018
Рукопись получена: 4 сентября 2019 г. Принята к публикации: 16 сентября 2019 г.
